Summary
Her presenterer vi en protokoll for en frittflytende indirekte immunofluorescence analysen på huden biopsi seksjoner som gjør det mulig for identifisering av sykdom spesifikke konformasjon varianter av Alpha synuclein involvert i Parkinsons sykdom og flere proteiner av perifere nervesystemet.
Abstract
Hittil, for de fleste nevrodegenerative sykdommer bare en post-obduksjon histopathological definitive diagnosen er tilgjengelig. For Parkinsons sykdom (PD), avhenger diagnosen fortsatt bare på kliniske tegn på motor involvering som vises senere i Sykdomsforløpet, når de fleste av de dopaminerg neurons er allerede tapt. Derfor er det et sterkt behov for en biomarkør som kan identifisere pasienter i begynnelsen av sykdommen eller risikoen for å utvikle den. I løpet av de siste årene, hud biopsi har vist seg å være en utmerket forskning og diagnostisk verktøy for perifere nerve sykdommer som små fiber nevropati. Interessant, en liten fiber nevropati og Alpha synuclein (αSyn) nevrale innskudd har blitt vist av huden biopsi i PD pasienter. Faktisk har huden biopsi den store fordelen av å være en lett tilgjengelig, minimalt invasiv og smertefri prosedyre som gjør at analysen av perifere nervøse vev utsatt for patologi. Videre kan muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølgingen av den samme pasienten studerer langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon. Vi setter opp en standardisert pålitelig protokoll for å undersøke tilstedeværelsen av αSyn aggregater i hudens nervefibre av PD pasienten. Denne protokollen innebærer noen korte fiksering trinn, en cryotome snitting og deretter en frittflytende immunofluorescence dobbel farging med to spesifikke antistoffer: anti protein Gene Product 9,5 (PGP 9.5) for å markere hud nervefibre og anti 5G4 for å oppdage αSyn aggregater. Det er en allsidig, følsom og lett å utføre protokollen som også kan anvendes for å målrette andre proteiner av interesse i huden nerver. Evnen til å merke αSyn aggregater er et skritt videre til bruk av hud biopsi som et verktøy for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av PD.
Introduction
Skin biopsi har fått en stor betydning som diagnostiske og forskning verktøy innen nevrologiske lidelser1. Faktisk, epidermis og dermis inneholder rikelig somatiske sensoriske nervefibre (myelinated og unmyelinated), nociceptive frie nerve avslutninger, sensoriske reseptorer og autonome innervasjon av svette kjertler, fartøy, talgkjertler og muskel arrector pilorum 2i det.
I midten av 20th århundre, oppsettet for IMMUNHISTOKJEMI av PGP 9.5 antistoff tillot bevis for en omfattende innervasjon av menneskelig epidermis pattedyr hud3. PGP 9.5 er en kar bok syl-Hydrolase like fordelt langs axons av både det sentrale og perifere nervesystemet (PNS). Tilgjengeligheten av dette antistoff tillot ikke bare å avklare morfologi og anatomi av PNS i huden, men også implementert studiet av sykdommer knyttet til den3,4. Hud biopsi bidro til å definere en ny klinisk enhet: den lille fiber nevropati. Flere internasjonale grupper demonstrerte foreningen mellom tap av intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på liten fiber nevropati5 av huden biopsi analyse og gitt standardiserte protokoller for nerve morphometry samt normative referanseverdier som skal brukes i klinisk praksis6,7,8.
Nylig en stor mengde bevis har vist at nevrodegenerative sykdommer, karakterisert ved misfolded protein ansamlinger i sentralnervesystemet, er multi-system patologi9. Faktisk er PD preget av αSyn akkumulering i den dopaminerg Nevron av substantia Nigra, men det har blitt demonstrert at αSyn og patologisk form, fosforylert ΑSyn (P-αSyn), kunne oppdages også i perifere vev. Gastro-intestinal mucosa10, spyttkjertler11, huden autonome fibre rundt svette kjertler og pilomotor muskler12,13,14, Vis immunoreactivity til patogene former for αSyn, i samsvar med Braak hypotese som intriguingly postulatet at αSyn patologi kan begynne i PNS i god tid, før akkumulering i hjernen15. Videre, tilstedeværelsen av p-αSyn har blitt demonstrert i huden nerver av pasienter med REM atferd lidelser som anses prodromal PD16,17 dermed huden patologisk αSyn kan betraktes som en lovende tidlig perifer histopathological markør for synucleinopathy.
Foreningen av små fiber nevropati i PD har blitt demonstrert tidligere, og det har blitt funnet at intraepidermal nervefibre tetthet reflekterer sykdomsprogresjon18,19. Derfor er huden biopsi et nyttig verktøy for å studere neurodegeneration i PD og for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av sykdommen. Faktisk, hud biopsi har en stor fordel av å være en lett tilgjengelig og minimalt invasiv prosedyre, slik at analysen av nervøse vev utsatt for patologi. Til slutt, muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølging av de samme pasientene kan studere langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon.
I vårt laboratorium, utnytte en dobbel Immuno-farging med PGP 9.5 og konformasjon spesifikke monoklonale 5G4 antistoff, som gjenkjenner sykdom spesifikke former for αSyn inkludert små aggregater20,21, kunne vi vise tilstedeværelsen av αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høy diagnostisk effektivitet19. Immunofluorescence analyse av huden biopsi i conformational sykdommer skiller seg ut som en lovende kilde til biomarkører ved å kombinere både påvisning av protein aggregater og mål på neurodegeneration in vivo. Heretter illustrerer vi en enkel og allsidig protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging for å oppdage αSyn aggregater. Videre kan denne protokollen bli tilpasset for å målrette andre protein av interesse uttrykt i huden PNS.
Følgende studie protokoll har blitt brukt til å evaluere diagnostisk nytte av aggregert αSyn analyse i PNS av PD av huden biopsi19. Inkludering kriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til UK Brain bank diagnostiske kriterier, sykdom varighet minst 3 år, ingen slektshistorie, og ingen større kognitiv svekkelse eller store dysautonomic symptomer i historien. Utelukkelse kriterier ble kjent årsaker til nevropati (glykosylert hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immun fikserings, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gjennomgikk 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske områder (halsen på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm over kneet, etappe 10 cm over lateral Malleolus) på siden, som var klinisk mer berørt. Generelt, er følgende protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging og analyse. Derfor kan det tilpasses og brukes for påvisning av andre proteiner av interesse for hud vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er godkjent av kantonale etikk komité og alle registrerte ga skriftlig informert samtykke til studiet.
1. Skin biopsi Collection
- La en kvalifisert lege utføre huden biopsi i en hensiktsmessig klinisk setting.
- Velg området for å utføre huden biopsi og rengjør den med en alkoholserviett.
- Forbered bedøvelse løsning med 1 cc av lidokain 2%.
- Med nålen parallelt med området, injisere lokal anestesi subkutant.
- Etter å ha sjekket effekten av anestesi, ta 3 mm disponibel Punch og påfør roterende og delikat press for å rotere det ned gjennom epidermis og dermis, til subkutan fettet er nådd.
- Ta ut slaget.
- Bruk en gangs tang for å trekke hud pluggen forsiktig opp.
- Bruk saks til å skjære ut bunnen av prøven på nivået av fettvevet.
- Plasser prøven i et rør som inneholder 10 mL periodate-lysin-paraformaldehyde (PLP) bindemiddel løsning.
- Desinfisere området og dekke det med en selvklebende bandasje.
2. vev fiksering og lagring
- Gjør frisk PLP bindemiddel løsning (se tabell 1).
- Umiddelbart etter Oppsamling av hud biopsi, Senk den i et rør som inneholder 10 mL PLP bindemiddel oppløsning og ruge den over natten (O/N) ved 4 ° c.
- Dagen etter, under avtrekks panseret, Fjern PLP bindemiddel forsiktig og i samme rør, vask biopsi 3 ganger i 5 minutter med 5 mL 0,1 M Sorensen ' s løsning (tabell 1).
- Kast Sorensen løsning og ruge biopsi med 5 mL protectant oppløsning O/N ved 4 ° c.
- Oppbevar biopsi ved 4 ° c Hvis snittet med en cryotome utføres innen 1 uke; Lagre biopsi ved-20 ° c Hvis snittet blir utført innen 3 måneder; legge inn biopsi i en cryomold (trinn 3,2-3.4) og lagre den på-80 ° c for å spare den for en lengre periode.
3. tissue kutt med en Cryotome
- Still inn cryotome ved-20 ° c.
- Ta en cryomold og fylle den opp med det fryse-embedding medium. Unngå å lage bobler.
- Ved hjelp av pinsett dyppe biopsi i fryse-embedding medium med langsgående aksen (epidermis-dermis) parallelt med bunnen av cryomold.
- Snap fryse prøven med flytende nitrogen for å få en solid kube av fryse-embedding medium som inneholder biopsi i riktig retning.
- Sett prøven i kryostaten og vente i 30 min for å la biopsi å akklimatisere seg.
- Fix prøven på kryostaten og kutt 50 μm seksjoner.
- Ved hjelp av en liten børste, Overfør fryse seksjonene i en 96 brønn plate som inneholder 200 μL av frostvæske oppløsning i hver brønn. En seksjon per brønn.
- Oppbevares ved-20 ° c.
Merk: Hvis analysere hele biopsi er ikke analysert, kutt den bare delvis. I dette tilfellet må seksjonene oppbevares ved-20 ° c og den resterende delen av biopsi ved-80 ° c for å bevare den i en lengre tidsperiode.
4. Immunofluorescence farging
- Fyll en 96 brønn plate med 100 μL vaskeløsning.
- Overfør seksjonene som skal analyseres fra lagrings platen til den nye som inneholder vaskeløsningen. 1 seksjon per brønn (4 seksjoner per anatomisk område, per pasient: vanligvis totalt 12 seksjoner per pasient).
- La seksjonen i vaskeløsningen i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Overfør seksjonen til en annen brønn som inneholder den samme løsningen og gjenta vasken.
- Flytt seksjonene til nye brønner som inneholder 100 μL av blokkerings løsning og ruge i minst 90 min. og maksimalt 4 timer ved RT.
- Fortynne primære antistoffer anti-PGP 9.5 (Rabbit polyklonale, 1:1000) og anti-5G4 (Mouse monoklonale, 1:400) i arbeidslivet løsningen.
- Overfør delene til nye brønner som inneholder 100 μL av arbeids løsningen til de primære Antistoffene og ruge dem O/N ved RT.
- Som i trinn 4,3, vask seksjonene 2 ganger i minst 10 minutter ved RT, med 100 μL vaskeløsning.
- Fortynne sekundære antistoffer (bøye med forskjellige fluorophores) Goat anti-Rabbit å oppdage PGP 9.5 (1:700) og en geit anti-Mouse å oppdage 5G4 (1:700) i arbeidslivet løsning.
- Overfør delene til nye brønner som inneholder 100 μL av arbeids løsningen på sekundære antistoffer for 90 min ved RT. Fra dette punktet, dekke 96 godt plate med aluminiumsfolie for å unngå bleking av fluoroforen bøyd med sekundær antistoff/IES.
- Som i trinn 4,3, vask seksjonene 2 ganger i minst 10 minutter, med 100 μL av vaskeløsningen.
- Overfør delene til nye brønner som inneholder 100 μL av DAPI (fortynnet 1:5000 i PBS 1x) i 5 minutter ved RT.
- Som i trinn 4,3, vask seksjonene 2 ganger i minst 10 minutter, med 100 μL av vaskeløsningen.
- Monter seksjonene på et lysbilde i riktig posisjon, unngå misfolding.
- Legg noen dråper av monterings mediet på lysbildet og dekk med en dekkglass.
- La lysbildene tørke O/N før du bruker konfokalmikroskopi/fluorescens mikroskop.
- Oppbevar lysbildene i en passende boks ved 4 ° c for å unngå lyseksponeringen. Hvis nøyaktig lagret, vil signalet være synlig i ca 6 måneder.
Merk: Overføring av en seksjon fra 96 brønn plate inneholder den nylig kuttet skiver til 96 brønn plate som inneholder vaskeløsningen (trinn 4,1) utføres ved hjelp av en liten pensel som bidrar til å plukke opp biopsi. Etter overføring av seksjonen inn i første brønn, hver gang stykket må inkubert med en annen løsning, flytte den fra godt til godt med hjelp av børsten.
5. Immunofluorescence Imaging
- Se seksjoner under et invertert fluorescens mikroskop eller et konfokalmikroskopi mikroskop (20X, 40x eller høyere forstørrelse, bruk etterfølgende rammer på 2 μm trinn på en Z-stabel plan for best resultat).
- Anskaffe bilder av et mikroskop koblet kamera
-
Bruk en adekvat tenkelig programvare (dvs. ImageJ) til å analysere positive signaler i seksjoner i form av romlig distribusjon og intensiteten av signalet. For å gjøre dette utføre trinnene som er nevnt nedenfor.
- Åpne filen med ImageJ programvare.
- Klikk på bildet for > farge > splitte kanaler for å analysere hver fargekanal.
- Klikk bilde > stable ≫ Z-prosjekt for å få en sammenslåing av flere inndelings anskaffelser.
- Klikk bilde > farge > slå sammen kanaler for å få en sammenslåing av forskjellige fargekanaler for samme anskaffelse.
|
Frostvæske løsning (oppbevares ved 4 ° c i opptil 6 måneder) |
30% glyserol 30% etylen glykol 30% dH2O 10% 2x fosfat buffer |
|
Blokkering løsning (forberede for øyeblikket) |
4% normal geit serum 1% Triton X-100 i vaskeløsning |
|
Protectant (oppbevares ved 4 ° c i opptil 6 måneder) |
20% glyserol 80% Sorensen løsning |
|
Disodium hydrogen fosfat løsning (oppbevares på RT opptil 6 måneder) |
0.45 m Disodium hydrogen fosfat (Na2HPO4) i dH2O Filtrer i en steril flaske |
|
Lysin løsning (oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 uker) |
50% av 0,3 M L-lysin argininmonohydroklorid løsning 50% av 0,1 M Sorensen oppløsning pH 7.6 pH 7,4, filter i en steril flaske |
|
Paraformaldehyde (PFA) 8% (Forbered under avtrekksvifte og oppbevar ved 4 ° c i inntil 1 måned) |
2.6 m PFA i dH2O (til 55 ° c _do ikke overstiger 60 ° c filteret i en steril flaske |
|
Fosfat buffer 2x (oppbevares ved 4 ° c i opptil 6 måneder) |
6% monosodium fosfat (NaH2PO4) løsning 45% Disodium fosfat (Na2HPO4)-løsning i dH2O |
|
PLP bindemiddel løsning (Forbered for øyeblikket, under avtrekks hette) |
25% Paraformaldehyde 8% 0,01 m natrium (meta) periodate 75% lysin løsning < |
|
Natrium Natriumdihydrogenfosfatmonohydrat fosfat monohydrat (oppbevares på RT opptil 6 måneder) |
0.52 m natrium Natriumdihydrogenfosfatmonohydrat fosfat monohydrat (NaH2PO4 * H2O) i dH2O Filter i en steril flaske. |
|
Sorensen ' s løsning (oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 måned) |
2,5% monosodium fosfat løsning 18,7% Disodium fosfat løsning pH 7.6, i dH2O |
|
Vaskeløsning (forberede for øyeblikket) |
0,25 m Trizma sokkel 0.26 m NaCl pH 7.6, i dH2O |
|
Arbeids løsning (forberede for øyeblikket) |
50% blokkerende løsning 50% vaskeløsning |
Tabell 1: Nødvendige løsninger. Liste over nødvendige løsninger for protokollen og en kort beskrivelse av hvordan du klargjør den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter beskrevet prosedyre (figur 1), oppdaget vi αSyn aggregater, merket med 5G4 antistoff, i dermal nerve bunter innervating autonome strukturer av PD pasienter. Morfologi av Alpha-synuclein avleiringer vises som et prikket signal langs axons av dermal nerver (figur 2). Faktisk, ved å utnytte denne protokollen i 19 PD pasienter og 17 kontroller i huden biopsier på tre anatomiske området (cervical, lår og det som kan være på beina) fant vi at 5G4 hadde 81% av følsomhet og 86% av spesifisitet hensyn til sunne kontroller og P-αSyn hadde 56% av følsomhet og 100% av spesifisitet19.
Spesielt fant vi 5G4 og P-αSyn positive innskudd hovedsakelig i nerver rundt svette kjertler, men også i muskel Erector Pili, små fartøy, og subepidermal og dermal plexus, aldri i intraepidermal nervefibre.
Vanligvis, i svetten kjertel lumen, er det mulig å observere et uspesifisert signal, som kan bli misforstått som 5G4/P-αSyn positivitet. Denne type signal er stiplet, sfærisk og det skyldes mest sannsynlig å intraluminal Auto-fluorescerende materiale, som vi viste i tekniske kontroller uten primære og sekundære antistoffer (Figur 3). Co-lokalisering med PGP 9.5 som markerer nervefibrene, som morfologisk er trådformede og langstrakt, bidrar til å identifisere riktig signal. Derfor er spesifisitet av 5G4 signal sterkt økt med en dobbel immunostaining med en axonal markør (Figur 4).
En nøyaktig fiksering av biopsi er en obligatorisk faktor for den gode kvaliteten på immunofluorescence farging, og for pålitelig tolkning av fluorescerende signaler. Hvis bindemiddel ikke er riktig forberedt eller hvis en over-fiksering har skjedd, vil resultatet bli en høy Auto-fluorescens som vil maskere signalet av nervefibre krysser dermal-epidermal veikryss eller innervate viktigste dermal strukturer (figur 5 B, D, F). I dette tilfellet, manglende evne til å visualisere riktig PGP 9.5 positive fibre vil gjøre vanskelig å analysere riktig også 5G4.
Endelig, denne protokollen kan brukes for påvisning av protein av interesse, inkludert blant annet αSyn, P-αSyn eller tyrosin hydroksylase (TH) og vasoactive intestinal peptid (VIP) som markerer henholdsvis adrenerge og kolinerge under type av autonome innervasjon (figur 6).
Figur 1 : Skjematisk representasjon av protokollen. Grafisk representasjon av kritiske trinn i fiksering, kutt og farging av huden seksjoner for visualisering av αSyn aggregater i hud perifere nervefibre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Tilstedeværelsen av 5G4 aggregater i dermal nervøse fibre. Konfokalmikroskopi fusjonerte Z-stack bilder av immunofluorescence med PGP 9.5 (grønn) og 5G4 (rød) av dermal nerver rundt svette kjertler i PD pasienter (A-C) og sunne (D-F). Dette tallet er endret fra 19. 3D visualisering av samme svette kjertel viste ovenfor fra PD (G) og sunn (H). Indikeres med hvite piler, gul colocalization av de to markørene langs axons. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Tekniske kontroller er Auto-fluorescerende signaler. Konfokalmikroskopi fusjonerte Z-stack bilder av huden delen beiset med DAPI og uten den primære antistoff (A-B), uten sekundær antistoff (C-D), uten primære og sekundære antistoffer (E-F). Bildene viser tilstedeværelsen av ikke-spesifikke prikkete signaler i svette kjertler strukturer i alle forhold. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Vurder nervefibre morfologi til å gjenkjenne ikke-spesifikke signal. Konfokalmikroskopi Merge Z-stack bilder av immunofluorescence med PGP 9.5 (grønn) og 5G4 (rød) av dermal nerver rundt svette kjertler. Hvite piler indikerer positive strukturer; stjernene indikerer løs farging i ikke-neuronal strukturer. Scale bar = 50 μm. Dette tallet er endret fra referanse19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Feil fiksering kompromisser kvaliteten på immunofluorescence farging. Konfokalmikroskopi Merge Z-stack bilder av immunofluorescence med PGP 9.5 (grønn) og DAPI (blå) av intra epidermal nerver fibre (A-B) og dermal nerver rundt talgkjertel (C-D) og svette kjertler (E-F). På venstre resultat av riktig fiksering, på riktig resultat av over fiksering. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Eksempler på andre proteiner som oppdages i hud nerver. Mikroskop bilder av dermal strukturer farget ved hjelp av en fri-flytende immunofluorescence analysen. I rødt αSyn (A), p-ΑSyn (B), og th (C), i grønn VIP (D). Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en fri-flytende immunofluorescence analysen for hud biopsier for diagnostisering av PD: den utnytter dobbelt immunostaining med anti-PGP 9.5 antistoff, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformasjon bestemt antistoff som anerkjenner aggregert form av αSyn.
De store fordelene med hud biopsi for diagnostiske formål i PD og muligens i andre protein conformational lidelser er: 1) direkte tilgang til nervøs vev utsatt for sykdom ved en mildt invasiv teknikk og dermed med en forventet bedre besluttsomhet følsomhet for αSyn aggregater enn biologiske væsker som blod eller CSF; 2) muligheten til å oppdage og kvantifisere epidermal og autonom nerve fiber tetthet som et mål på neurodegeneration; 3) muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølging av de samme pasientene, for å studere lengderetningen sammenhengen med sykdomsprogresjon.
Protokollen foreslås her er rask, allsidig og har noen kritiske skritt. Først av alt, vev fiksering må gjennomføres riktig, ellers en høy Auto-fluorescens vil maskere det spesifikke signalet og vil hindre riktig analyse av dataene. Paraformaldehyde i bindemiddel oppløsning bør gjøres friskt og pH i 7,4 bør være nøyaktig kontrollert. Det er svært viktig å unngå dannelse av maursyre syre som kan skade biopsier. Før lagring og kutt, hvis den kompakt av biopsi antyder en feil fiksering, bør biopsi skylles igjen med Sorensen ' s løsning, og re-inkubert med PLP løsning O/N ved 4 ° c. Videre, i begynnelsen eller på slutten av immunofluorescence farging protokollen, noen flere trinn kan innføres for å motvirke Auto-fluorescens. I begynnelsen av protokollen (mellom trinn 4,1 og 4,2) en behandling med natrium borohydride oppløsning (1 mg/mL i TBS; 3 ganger i 10 min), en behandling med hydrogenperoksid (3%; 15 min) eller en behandling med Glycine (0,1 M i TBS; 1h) kan utføres. I alternativ på slutten av farging (mellom trinn 4,8 og 4,9), kan en behandling med trypan blå (250 μg/mL i TBS; 20 min) eller med Sudan Black (0,5% i 70% EtOH; 30 min) utføres. Men i alle tilfeller, i tillegg til reduksjon av Auto-fluorescens, en reduksjon i det konkrete signalet vil også forekomme. Alternativt kan biopsier feil fiksert brukes til å utføre klassisk lyse feltet immunhistokjemi. I dette tilfellet vil imidlertid den doble immunostaining for colocalization av 5G4 og PGP 9.5 være mer utfordrende og vanskelig å analysere.
Et annet kritisk trinn er innsetting av en hud biopsi i cryomold (trinn 3,3). Orienteringen av biopsi mot skjærebladet er avgjørende for å få skiver der epidermis og dermis er begge til stede. Den langsgående aksen (epidermis-dermis) må være parallelt med bunnen av cryomold, slik at siden av biopsi, ikke toppen eller bunnen, står overfor operatøren. Valget av skiver tykkelse, 50 μm, er i samsvar med europeiske retningslinjer for bruk av hud biopsi som et diagnostisk verktøy7. Videre, for en αSyn aggregater deteksjon, gir 50 μm tykkelse med større sannsynlighet for å ha innenfor den delen mer dermal strukturer, der patologisk innskudd er hovedsakelig funnet i PD. på grunn av den høye tykkelsen, for å være sikker på at hele seksjonen er farget, er det ikke anbefalt å plassere delene på lysbildet for farging, men i stedet, en gratis flytende flekker er obligatorisk. For denne prosedyren, er det store problemer å overføre deler fra en brønn til en annen ved hjelp av en liten pensel uten å skade seksjonene. Det anbefales å sette tuppen av børsten under biopsi som flyter i væsken, slik at biopsi å bosette seg på tuppen av børsten, forsiktig bære biopsi fra en brønn til en annen, dyppe biopsi i den nye løsningen og fjerne børsten å sørge for at ingen biopsi rester er igjen på børsten. Det er viktig at operatøren tilegne seg manuelle ferdigheter med praksis.
Avslutningsvis er dette en kort og enkel protokoll for optimal håndtering og fluorescerende immunostaining av huden biopsi. Fordelen med denne protokollen i forhold til tidligere studier er bruk av 5G4 antistoff, slik at påvisning av αSyn små aggregater for første gang i dermal autonome nervefibre av PD-pasienter. Det kan potensielt brukes til diagnostiske formål i ulike typer nevrodegenerative lidelser som involverer PNS, spesielt i tidlige faser, når potensielle kur kan være mest effektive. Begrensninger av metoden er at følsomheten av P-αSyn og spesifisitet av 5G4 er fortsatt suboptimal men en kombinasjon av ulike markører i fremtidige studier kan sikkert forbedre diagnostisk utbytte av huden biopsi i PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Parkinson Schweiz og ABREOC (Forskningsrådet for vitenskapelig forskning i Ente Ospedaliero Cantonale) for deres økonomiske støtte til denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
