Summary
यहाँ, हम त्वचा बायोप्सी वर्गों पर एक मुक्त चल अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो पार्किंसंस रोग और कई प्रोटीन में शामिल अल्फा सिन्यूक्लिइन के रोग विशिष्ट अनुरूपता वेरिएंट की पहचान के लिए अनुमति देता है परिधीय तंत्रिका तंत्र.
Abstract
तारीख करने के लिए, सबसे neurodegenerative रोगों के लिए केवल एक पोस्ट-मॉर्टम हिस्टोपैथोलॉजिकल निश्चित निदान उपलब्ध है। पार्किंसंस रोग (पीडी) के लिए, निदान अभी भी केवल मोटर भागीदारी के नैदानिक लक्षण पर निर्भर करता है जो बाद में रोग पाठ्यक्रम में दिखाई देते हैं, जब डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के अधिकांश पहले से ही खो जाते हैं। इसलिए, एक बायोमार्कर की सख्त जरूरत है जो बीमारी की शुरुआत में या इसे विकसित करने के जोखिम पर रोगियों की पहचान कर सकता है। पिछले कुछ वर्षों में, त्वचा बायोप्सी इस तरह के छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के रूप में परिधीय तंत्रिका रोगों के लिए एक उत्कृष्ट अनुसंधान और नैदानिक उपकरण साबित हो गया है। दिलचस्प है, एक छोटे से फाइबर न्यूरोपैथी और अल्फा synuclein (जेडसिन) तंत्रिका जमा पीडी रोगियों में त्वचा बायोप्सी द्वारा दिखाया गया है. दरअसल, त्वचा बायोप्सी एक आसानी से सुलभ होने का महान लाभ है, न्यूनतम इनवेसिव और दर्द रहित प्रक्रिया है कि परिधीय तंत्रिका रोग विज्ञान के लिए प्रवण ऊतक के विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, एक ही रोगी के अनुवर्ती के दौरान त्वचा बायोप्सी को दोहराने की संभावना रोग प्रगति के साथ अनुदैर्घ्य सहसंबंध का अध्ययन करने की अनुमति देता है। हम पीडी रोगी की त्वचा तंत्रिका फाइबर में सिन समुच्चय की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक मानकीकृत विश्वसनीय प्रोटोकॉल की स्थापना की। इस प्रोटोकॉल कुछ कम निर्धारण कदम शामिल है, एक cryotome अनुभाग और फिर एक मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल दो विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग: विरोधी प्रोटीन जीन उत्पाद 9.5 (PGP9.5) cutaneous तंत्रिका फाइबर और पता लगाने के लिए विरोधी 5G4 चिह्नित करने के लिए $सिन समुच्चय. यह एक बहुमुखी, संवेदनशील और प्रोटोकॉल है कि भी त्वचा नसों में ब्याज के अन्य प्रोटीन को लक्षित करने के लिए लागू किया जा सकता है प्रदर्शन करने के लिए आसान है. पीडी के एक पूर्व-मर्द हिस्टोपैथोलॉजिकल निदान की स्थापना के लिए एक उपकरण के रूप में त्वचा बायोप्सी के उपयोग के लिए एक और कदम आगे है - सिन समुच्चय को चिह्नित करने की क्षमता।
Introduction
त्वचा बायोप्सी मस्तिष्क संबंधी विकारों1के क्षेत्र में नैदानिक और अनुसंधान उपकरण के रूप में एक महान महत्व हासिल कर लिया है . वास्तव में, बाह्य त्वचा और dermis प्रचुर मात्रा में दैहिक संवेदी तंत्रिका फाइबर होते हैं (myelinated और unmyelinated), nociceptive मुक्त तंत्रिका अंत, संवेदी रिसेप्टर्स और पसीना ग्रंथियों के autonomic innervation, वाहिकाओं, वसामय ग्रंथियों और मांसपेशियों arrector pilorum 2.
मध्य 20वीं सदी में, PGP9.5 एंटीबॉडी के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सेटअप मानव epidermis स्तनधारी त्वचा3के एक व्यापक innervation के सबूत की अनुमति दी. PGP9.5 एक carboxyl-टर्मिनल hydrolase समान रूप से दोनों केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र (PNS) के axons के साथ वितरित है. इस एंटीबॉडी की उपलब्धता ने न केवल त्वचा में पीएनएस की आकृति विज्ञान और शरीर रचना को स्पष्ट करने की अनुमति दी बल्कि इससे जुड़े रोगों के अध्ययन को भी लागू किया3,4. त्वचा बायोप्सी एक नई नैदानिक इकाई को परिभाषित करने के लिए योगदान दिया: छोटे फाइबर न्यूरोपैथी. कई अंतरराष्ट्रीय समूहों intraepidermal तंत्रिका फाइबर और लक्षण के नुकसान के बीच संबंध का प्रदर्शन किया 5 त्वचा बायोप्सी विश्लेषण द्वारा छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के लक्षण और तंत्रिका morphometry के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक अभ्यास6,7,8में प्रयुक्त होने वाले मानक संदर्भ मान .
हाल ही में सबूत की एक बड़ी राशि से पता चला है कि neurodegenerative रोगों, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में misfolded प्रोटीन संचय की विशेषता, बहु प्रणाली रोगों9हैं. वास्तव में, पीडी सबस्टेनिया नाइग्राके डोपामिनर्जिक न्यूरॉन में सिन संचय की विशेषता है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया है कि [सिन और इसके रोगात्मक रूप, फॉस्फोरीलेटिड ]सिन (पी-सिन), परिधीय ऊतकों में भी पता लगाया जा सकता है। गैस्ट्रो आंत्र श्लेष्म10, लार ग्रंथियों11, पसीना ग्रंथियों और pilomotor मांसपेशियों के आसपास त्वचा autonomic फाइबर12,13,14, में , के रोगजनक रूपों के लिए इम्यूनोरेसक्रियता दिखाते हैं Braak परिकल्पना के अनुसार कि पेचीदा ढंग से यह अनुमान लगाया गया है कि पीएनएस में मस्तिष्क15में इसके संचय से पहले , पीएनएस में अच्छी तरह से शुरू हो सकता है . इसके अलावा, पी-सिन की उपस्थिति रेम व्यवहार विकार है कि prodromal पीडी16माना जाता है के साथ रोगियों की त्वचा नसों में प्रदर्शन किया गया है,17 इस प्रकार त्वचा रोग विज्ञान एक आशाजनक जल्दी परिधीय माना जा सकता है सिन्यूक्लिइनोपैथी का हिस्टोपैथोलॉजिकल मार्कर.
पीडी में छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के सहयोग का प्रदर्शन पहले किया गया है और यह पाया गया है कि इंट्राएपिडर्मल तंत्रिका फाइबर घनत्व रोग प्रगति को दर्शाता है18,19. इसलिए, त्वचा बायोप्सी पीडी में neurodegeneration का अध्ययन करने के लिए और रोग के एक पूर्व पोस्टमार्टम हिस्टोपैथोलॉजिकल निदान की स्थापना के लिए एक उपयोगी उपकरण है. दरअसल, त्वचा बायोप्सी एक आसानी से सुलभ और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया होने का एक बड़ा लाभ है, तंत्रिका रोग विज्ञान के लिए प्रवण ऊतक के विश्लेषण की अनुमति. अंत में, एक ही रोगियों के अनुवर्ती के पाठ्यक्रम में त्वचा बायोप्सी दोहराने की संभावना रोग प्रगति के साथ अनुदैर्घ्य सहसंबंध का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
हमारी प्रयोगशाला में, PGP9.5 और रचना-विशिष्ट monoclonal 5G4 एंटीबॉडी के साथ एक डबल इम्यूनो-स्टेनिंग का शोषण, कि छोटे समुच्चय सहित के रोग विशिष्ट रूपों को पहचानता है20,21, हम दिखाने में सक्षम थे एक आशाजनक उच्च नैदानिक दक्षता19के साथ त्वचा नसों में सिन समुच्चय की उपस्थिति . conformational रोगों में त्वचा बायोप्सी के इम्यूनोफ्लोरेसिस विश्लेषण दोनों प्रोटीन समुच्चय का पता लगाने और विवो में neurodegeneration के उपाय के संयोजन के द्वारा biomarkers का एक आशाजनक स्रोत के रूप में बाहर खड़ा है. इसके बाद, हम त्वचा बायोप्सी से निपटने और मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसी दाग प्रदर्शन पर एक आसान और बहुमुखी प्रोटोकॉल वर्णन [सिन समुच्चय का पता लगाने के लिए. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल त्वचा PNS में व्यक्त ब्याज के किसी भी अन्य प्रोटीन को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
निम्नलिखित अध्ययन प्रोटोकॉल का उपयोग त्वचा बायोप्सी19द्वारा पीडी के पीएनएस में एकत्रित सिन विश्लेषण की नैदानिक उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है . पीडी के लिए शामिल किए गए मानदंड थे: ब्रिटेन मस्तिष्क बैंक नैदानिक मानदंडों के अनुसार एक निश्चित नैदानिक निदान, रोग की अवधि कम से कम 3 साल, कोई परिवार के इतिहास, और कोई प्रमुख संज्ञानात्मक हानि या इतिहास में प्रमुख dysautonomic लक्षण. बहिष्करण मानदंड न्यूरोपैथी (ग्लीकेम्ड हीमोग्लोबिन, क्रिएटिनिन, विटामिन बी 12, टीएसएच, सीरम इम्यूनोफिक्सेशन, एचआईवी, एचसीवी, सिफलिस, और बोरेलियोसिस) के ज्ञात कारण थे। प्रत्येक विषय तीन शारीरिक स्थलों पर 3 मिमी व्यास त्वचा बायोप्सी के लिए लिया (C8 त्वचा स्तर पर गर्दन, घुटने के ऊपर जांघ 10 सेमी, पैर 10 सेमी पार्श्व malleolus से ऊपर) पक्ष है, जो चिकित्सकीय अधिक प्रभावित किया गया था. सामान्य में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल त्वचा बायोप्सी से निपटने और मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला और विश्लेषण प्रदर्शन के बारे में है। इसलिए यह अनुकूलित किया जा सकता है और त्वचा के ऊतकों में ब्याज की अन्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रोटोकॉल को छावनी आचार समिति द्वारा अनुमोदित कर दिया गया है और सभी नामांकित विषयों ने अध्ययन के लिए लिखित सूचित सहमति दी है।
1. त्वचा बायोप्सी संग्रह
- एक योग्य चिकित्सक एक उचित नैदानिक सेटिंग में त्वचा बायोप्सी प्रदर्शन करते हैं.
- क्षेत्र चुनें त्वचा बायोप्सी प्रदर्शन और यह एक शराब झाड़ू के साथ साफ करने के लिए.
- 1 सीसी लिडकेन 2% के साथ संवेदनाहारी समाधान तैयार करें।
- क्षेत्र के समानांतर सुई के साथ, स्थानीय संज्ञाहरण subcutaneously सुई.
- संज्ञाहरण के प्रभाव की जाँच करने के बाद, 3 मिमी डिस्पोजेबल पंच लेने के लिए और नीचे की ओर पहुंच गया है जब तक, यह epidermis और dermis के माध्यम से नीचे बारी बारी से करने के लिए घूर्णन और नाजुक नीचे दबाव लागू होते हैं।
- पंच वापस ले लो.
- धीरे त्वचा प्लग अप खींचने के लिए डिस्पोजेबल forceps का प्रयोग करें.
- फैटी ऊतक के स्तर पर नमूने के आधार को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
- नमूने को 10 एमएल पीरियड-लाइसिन-पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएलपी) स्थिर हल युक्त ट्यूब में रखें।
- क्षेत्र को संक्रमित करें और इसे चिपकने वाली पट्टी के साथ कवर करें।
2. ऊतक निर्धारण और भंडारण
- ताजा PLP स्थिर समाधान करें (तालिका 1देखें) ।
- त्वचा बायोप्सी के संग्रह के तुरंत बाद, इसे एक ट्यूब में डूब नाले में भर लें जिसमें 10 एमएल पीएलपी फिक्सेटिव समाधान होता है और इसे रात भर (ओ/एन) 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- दिन के बाद, धूआं हुड के तहत, PLP fixative धीरे से और एक ही ट्यूब में हटा दें, बायोप्सी 3 बार 5 मिनट के लिए 0.1 एम Sorensen समाधान के 5 एमएल के साथ धोने (तालिका 1).
- सोरेनसेन के घोल को त्यागें और बायोप्सी को 5 एमएल क्रायो-प्रोटेकेंट विलयन ओ/एन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- बायोप्सी को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि एक क्रायोटोम के साथ कटौती 1 सप्ताह के भीतर की जाती है; -20 डिग्री सेल्सियस पर बायोप्सी स्टोर अगर कटौती 3 महीने के भीतर किया जाता है; बायोप्सी को क्रायोमोल्ड (चरण 3-2-3.4) में एम्बेड करें और इसे लंबे समय तक संरक्षित करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
3. एक Cryotome के साथ ऊतक कट
- क्रायोटोम को -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
- एक क्रायोमोल्ड लें और इसे क्रायो-एम्बेडिंग माध्यम से भरें। बुलबुले बनाने से बचें।
- छटपटाहट का उपयोग करके क्रायो-एम्बेडिंग माध्यम में बायोप्सी को अनुदैर्घ्य अक्ष (एपिडर्मिस - डर्मिस) के साथ क्रायो-एम्बेडिंग माध्यम में विसर्जित कर दिया जाता है जो क्रायोमोल्ड के नीचे के समानांतर होता है।
- स्नैप सही अभिविन्यास में बायोप्सी युक्त क्रायो-एम्बेडिंग माध्यम का एक ठोस घन प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ नमूना फ्रीज।
- cryostat में नमूना रखो और बायोप्सी acclimateize करने के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
- क्रायोस्टैट पर नमूने को ठीक करें और 50 डिग्री मीटर खंडों को काटें।
- एक छोटे से ब्रश की मदद से, प्रत्येक अच्छी तरह से antifreeze समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली में क्रायो वर्गों हस्तांतरण. अच्छी तरह से प्रति एक वर्ग.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: यदि विश्लेषण पूरे बायोप्सी का विश्लेषण नहीं किया है, यह केवल आंशिक रूप से कटौती. इस मामले में, वर्गों -20 डिग्री सेल्सियस और बायोप्सी के शेष भाग -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए यह समय की एक लंबी अवधि के लिए संरक्षण के लिए।
4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग
- एक 96 अच्छी तरह से थाली भरें, धोने के समाधान के 100 $L के साथ.
- वर्गों स्थानांतरण भंडारण प्लेट से नए एक धोने समाधान युक्त करने के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति 1 अनुभाग (4 शारीरिक साइट प्रति वर्गों, प्रति रोगी: आमतौर पर प्रति रोगी 12 वर्गों की कुल).
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए धोने के समाधान में अनुभाग छोड़ दें। एक ही समाधान युक्त एक और अच्छी तरह से अनुभाग में स्थानांतरण और धोने दोहराएँ.
- वर्गों को ब्लॉकिंग समाधान के 100 $L वाले नए कुओं में ले जाएँ और कम से कम 90 मिनट के लिए और आरटी में अधिकतम 4 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
- काम कर रहे समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-पीजीपी9.5 (रैबिट पॉलीक्लोनल, 1:1000) और एंटी-5G4 (माउस मोनोक्लोनल, 1:400) को पतला करें।
- वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी के कार्य समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस वाले नए कुओं में स्थानांतरित करें और उन्हें आरटी में ओ/एन इनक्यूबेट करें।
- चरण 4.3 के रूप में, आरटी में कम से कम 10 मिनट के लिए वर्गों 2 बार धोने के समाधान के 100 $L के साथ धोलें।
- काम कर रहे समाधान में 5G4 (1:700) का पता लगाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (विभिन्न फ्लोरोफोर्स के साथ संयुग्मी) बकरी विरोधी Rabbit PGP9.5 (1:700) और एक बकरी विरोधी माउस का पता लगाने के लिए।
- वर्गों को आरटी में 90 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के कार्य समाधान के 100 $L युक्त नए कुओं में स्थानांतरित करें। इस बिंदु से, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 96 अच्छी तरह से थाली को कवर करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुग्मी fluorofor के विरंजन से बचने के /
- चरण 4.3 के रूप में, कम से कम 10 मिनट के लिए वर्गों 2 बार धोने के समाधान के 100 $L के साथ धोएं।
- आरटी में 5 मिनट के लिए डीएपीआई के 100 जेडएल (पीबीएस 1x में 1:5,000) वाले नए कुओं में वर्गों को स्थानांतरित करें।
- चरण 4.3 के रूप में, कम से कम 10 मिनट के लिए वर्गों 2 बार धोने के समाधान के 100 $L के साथ धोएं।
- गलत फोल्डिंग से बचने के लिए सही स्थिति में एक स्लाइड पर वर्गों माउंट।
- स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की कुछ बूँदें जोड़ें और एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
- confocal /fluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से पहले स्लाइड सूखी O/N करते हैं।
- प्रकाश जोखिम से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त बॉक्स में स्लाइड स्टोर। यदि सही संग्रहीत, संकेत के बारे में 6 महीने के लिए दिखाई देगा.
नोट: 96 अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से धोने समाधान युक्त थाली में नव कटौती स्लाइस युक्त थाली से एक अनुभाग के हस्तांतरण (कदम 4.1) बायोप्सी लेने में मदद करता है कि एक छोटे से ब्रश का उपयोग किया जाता है. पहली अच्छी तरह से में अनुभाग के हस्तांतरण के बाद, हर बार टुकड़ा एक अलग समाधान के साथ incubated की जरूरत है, यह अच्छी तरह से ब्रश की मदद से अच्छी तरह से करने के लिए कदम.
5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
- एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक confocal माइक्रोस्कोप (20X, 40x या उच्च आवर्धन के तहत वर्गों देखें, सबसे अच्छा परिणाम के लिए एक $-स्टैक योजना पर 2 डिग्री मीटर वेतन वृद्धि के क्रमिक फ्रेम का उपयोग करें).
- एक माइक्रोस्कोप जुड़े कैमरे से छवियों को प्राप्त
-
स्थानिक वितरण और संकेत की तीव्रता के मामले में वर्गों में सकारात्मक संकेतों का विश्लेषण करने के लिए एक पर्याप्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर (यानी ImageJ) का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
- ImageJ सॉफ़्टवेयर के साथ फ़ाइल खोलें।
- प्रत्येक रंग चैनल का विश्लेषण करने के क्रम में छवि पर क्लिक करें gt; रंग और विभाजित चैनलों।
- क्लिक करें छवि gt; स्टैक gt; ] प्रोजेक्ट एकाधिक अनुभाग प्राप्ति का मर्ज प्राप्त करने के लिए।
- एक ही अधिग्रहण के विभिन्न रंग चैनलों का एक मर्ज प्राप्त करने के लिए छवि पर क्लिक करें और रंग ] मर्ज चैनल.
|
एंटीफ्रीज़ समाधान (अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान) |
30% ग्लिसरोल 30% एथिलीन ग्लाइकोल 30% dH2हे 10% 2x फॉस्फेट बफर |
|
समाधान अवरुद्ध करना (इस समय तैयारी) |
4% सामान्य बकरी सीरम 1% ट्राइटन एक्स-100 धुलाई समाधान में |
|
क्रायो-प्रोटेकेंट (अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान) |
20% ग्लिसरोल 80% सोरेनसेन का समाधान |
|
डाइसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट समाधान (6 महीने तक आरटी पर स्टोर) |
0.45M डाइसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट (Na2HPO4) dH2O में एक बाँझ बोतल में फ़िल्टर |
|
Lysine समाधान (अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान) |
0.3M एल-Lysine मोनोहाइड्रोक्लोराइड समाधान का 50% 0.1M सोरेनसेन के समाधान pH7.6 का 50% पीएच 7.4, एक बाँझ बोतल में फिल्टर |
|
पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) 8% (अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धूआं हुड और दुकान के तहत तैयारी) |
2.6M पीएफए dH2O में (55 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है 60 डिग्री सेल्सियस एक बाँझ बोतल में फिल्टर |
|
फॉस्फेट बफर 2x (अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान) |
6% मोनोसोडियम फॉस्फेट (NaH2PO4) समाधान dH2हे में 45% डाइसोडियम फॉस्फेट (Na2HPO4) समाधान |
|
पीएलपी स्थिर समाधान (इस समय तैयारी, धूआं हुड के तहत ) |
25% पैराफॉर्मेल्डिहाइड 8% 0.01M सोडियम (मेटा)periodate 75% Lysine समाधान और lt; |
|
सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट मोनोहाइड्रेट (6 महीने तक आरटी पर स्टोर) |
0.52M सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट मोनोहाइड्रेट (NaH2PO4 *H2O) dH2O में एक बाँझ बोतल में फ़िल्टर. |
|
सोरेनसेन का समाधान (1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) |
2.5% मोनोसोडियम फॉस्फेट समाधान 18.7% डाइसोडियम फॉस्फेट समाधान पीएच7.6, dH2O में |
|
धुलाई समाधान (इस समय तैयारी) |
0.25M Trizma आधार 0.26एम NaCl पीएच7.6, dH2O में |
|
कार्य समाधान (इस समय तैयारी) |
50% अवरुद्ध समाधान 50% धुलाई समाधान |
तालिका 1: आवश्यक समाधान. प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समाधानों की सूची और इसे तैयार करने के तरीके का संक्षिप्त विवरण.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
वर्णित प्रक्रिया के बाद (चित्र 1), हमने पीडी रोगियों की स्वायत्त संरचनाओं को आंतरिक रूप से आंतरिक तंत्रिका फैसिकेल्स में 5G4 एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए सिन समुच्चयों का पता लगाया। अल्फा-साइनुक्लिइन निक्षेपों का रूपचच चर्म तंत्रिकाओं के एक्सॉन के साथ एक डॉटेड संकेत के रूप में प्रकट होता है (चित्र2)। वास्तव में, 19 पीडी रोगियों में इस प्रोटोकॉल का शोषण और तीन शारीरिक साइट पर त्वचा बायोप्सी में 17 नियंत्रण (सर्वाइकल, जांघ और जिला पैर) हमने पाया कि 5G4 संवेदनशीलता का 81% था और स्वस्थ नियंत्रण के लिए विशिष्टता सम्मान के 86% और पी-सीन संवेदनशीलता का 56% था और विशिष्टता 19के 100% |
विशेष रूप से, हमने पाया 5G4 और पी-सिन सकारात्मक जमा मुख्य रूप से पसीने की ग्रंथियों के आसपास नसों में लेकिन यह भी मांसपेशियों सीधा करने वाला pili में, छोटे जहाजों, और subepidermal और dermal जाल, intraepidermal तंत्रिका फाइबर में कभी नहीं.
आम तौर पर, पसीने की ग्रंथि के लुमेन के भीतर, एक गैर-विशिष्ट संकेत का निरीक्षण करना संभव है, जिसका गलत अर्थ 5G4/P-सिन सकारात्मकता के रूप में किया जा सकता है। इस प्रकार का संकेत डॉटेड, गोलाकार है और यह शायद इंट्राल्युमिनल ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री के कारण होता है, जैसा कि हमने प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के बिना तकनीकी नियंत्रणों में प्रदर्शन किया है (चित्र 3)। PGP9.5 के साथ सह-स्थानीयकरण जो तंत्रिका फाइबर को चिह्नित करता है, जो आकृति के अनुसार फिलामेंटस और लम्बी होता है, सही संकेत की पहचान करने में मदद करता है। अतः 5G4 संकेत की विशिष्टता में एक द्वि-प्रतिगमन द्वारा एक अक्षीय मार्कर के साथ अत्यधिक वृद्धि की जाती है (चित्र 4)।
बायोप्सी का एक सटीक निर्धारण इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की अच्छी गुणवत्ता के लिए एक अनिवार्य कारक है, और फ्लोरोसेंट संकेतों की विश्वसनीय व्याख्या के लिए। यदि फिक्सेटिव सही ढंग से तैयार नहीं है या यदि एक अति-निर्धारण हुआ है, तो परिणाम एक उच्च ऑटो-फ्लोरेसेंट होगा जो त्वचा-एपिडर्मल जंक्शन को पार करने वाले तंत्रिका फाइबर के सिग्नल को मुखौटा करेगा या मुख्य त्वचा संरचनाओं को आंतरिक रूप देगा (चित्र5 ) बी, डी, एफ). इस मामले में, सही ढंग से कल्पना करने में असमर्थता PGP9.5 सकारात्मक फाइबर सही ढंग से भी 5G4 का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल कर देगा.
अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग ब्याज के किसी भी प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिसमें अन्य लोगों के अलावा, पी-सिन या टायरोसिन हाइड्रॉक्सीलेस (टीएच) और वासोएक्टिव आंत्र पेप्टाइड (वीआईपी) शामिल हैं जो क्रमशः एड्रेनेर्जिक और कोलीनर्जिक उपप्रकार को ऑटोनोमिक के चिह्नित करते हैं। आंतरिकता (चित्र 6)
चित्र 1 : प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. cutaneous परिधीय तंत्रिका फाइबर में Syn समुच्चय के दृश्य के लिए त्वचा वर्गों के निर्धारण, कट और धुंधला में महत्वपूर्ण चरणों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : dermal तंत्रिका फाइबर में 5G4 समुच्चय की उपस्थिति. CONfocal पीडी रोगियों में पसीना ग्रंथियों के आसपास पीजीपी9.5 (हरी) और 5G4 (लाल) के साथ इम्यूनोफ्लूरेंस के $ स्टैक छवियों का विलय कर दिया (ए -सी) और स्वस्थ विषय (डी-एफ)। यह आंकड़ा 19से संशोधित किया गया है। एक ही पसीने की ग्रंथि के 3 डी दृश्य पीडी (जी) और स्वस्थ (एच) विषयों से ऊपर दिखाया गया है। सफेद तीर, axons के साथ दो मार्करों के पीले colocalization द्वारा इंगित किया. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : ऑटो फ्लोरोसेंट संकेत: तकनीकी नियंत्रण. Confocal DAPI के साथ दाग त्वचा अनुभाग के जेड-स्टैक छवियों विलय कर दिया और प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना (ए-बी),माध्यमिक एंटीबॉडी के बिना (सी-डी),प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बिना (ई-एफ)। छवियों सभी स्थितियों में पसीना ग्रंथियों संरचनाओं में गैर विशिष्ट डॉटेड संकेतों की उपस्थिति दिखा. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : गैर विशिष्ट संकेत पहचान करने के लिए तंत्रिका फाइबर आकारिकी पर विचार करें. Confocal पसीने ग्रंथियों के आसपास डर्मामल नसों के PGP9.5 (हरी) और 5G4 (लाल) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के स्टैक छवियों को मर्ज करें। सफेद तीर सकारात्मक संरचनाओं का संकेत देते हैं; तारांकन गैर-न्यूरोनल संरचनाओं में विशिष्ट धुंधला संकेत देते हैं। स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह आंकड़ा संदर्भ19से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : गलत निर्धारण इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला की गुणवत्ता समझौता करताहै. कॉन्फोकल इम्युनोफ्लोरेसेंस की छवियों को पीजीपी9.5 (हरी) और डीएपीआई (नीला) के साथ अंतरा एपिडर्मल नसों फाइबर (ए-बी) और वसामय ग्रंथि (सी-डी) और पसीने की ग्रंथियों (ई-एफ) के चारों ओर dermal नसों को मर्ज करता है । सही निर्धारण के बाएं परिणाम पर, अधिक निर्धारण के सही परिणाम पर. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : त्वचा नसों में पता लगाने योग्य अन्य प्रोटीन के उदाहरण. एक मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसी परख का उपयोग कर दाग dermal संरचनाओं के माइक्रोस्कोप छवियों। लाल रंग में (क), च -सिन (ठ) और थ् (सी) हरे वीआईपी (डी) में . स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम पीडी के निदान के लिए त्वचा बायोप्सी के लिए एक मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसींस परख का वर्णन: यह विरोधी PGP9.5 एंटीबॉडी, एक panaxonal मार्कर, और विरोधी 5G4, एक अनुरूपता विशिष्ट एंटीबॉडी है कि एकत्रित रूप पहचानता है के साथ डबल इम्यूनोस्टेनिंग शोषण की $Syn.
पीडी में नैदानिक उद्देश्य के लिए त्वचा बायोप्सी के महान लाभ और संभवतः अन्य प्रोटीन conformational विकारों में हैं: 1) एक हल्के इनवेसिव तकनीक से रोग से ग्रस्त तंत्रिका ऊतक के लिए सीधी पहुँच और इस तरह एक उम्मीद बेहतर दृढ़ संकल्प के साथ रक्त या सीएसएफ जैसे जैविक तरल पदार्थ की तुलना में $Syn समुच्चय के लिए संवेदनशीलता; 2) का पता लगाने और neurodegeneration के एक उपाय के रूप में epidermal और autonomic तंत्रिका फाइबर घनत्व की मात्रा निर्धारित करने का अवसर; 3) एक ही रोगियों के अनुवर्ती के दौरान त्वचा बायोप्सी दोहराने की संभावना, आदेश में लंबे समय तक रोग प्रगति के साथ संबंध का अध्ययन करने के लिए.
यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल तेजी से, बहुमुखी है और कुछ महत्वपूर्ण कदम है. सबसे पहले, ऊतक निर्धारण को सही ढंग से आगे बढ़ाया जाना चाहिए, अन्यथा एक उच्च ऑटो-फ्लोरेसेंट विशिष्ट संकेत मुखौटा होगा और डेटा का सही विश्लेषण को रोक देगा। स्थायी समाधान में पैराफॉर्मेल्डिहाइड को ताजा बनाया जाना चाहिए और 7.4 का पीएच सही ढंग से जांच की जानी चाहिए। यह formic एसिड है कि बायोप्सी को नुकसान पहुंचा सकता है के गठन से बचने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. भंडारण और कटौती से पहले, यदि बायोप्सी की संकुचितता एक गलत निर्धारण का सुझाव देती है, तो बायोप्सी को सोरेनसेन के समाधान के साथ फिर से कुल्ला किया जाना चाहिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएलपी समाधान ओ/एन के साथ फिर से इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, शुरुआत में या इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल के अंत में, ऑटो-प्रवाह प्रतिक्रिया करने के लिए कुछ अतिरिक्त कदम उठाए जा सकते हैं। प्रोटोकॉल की शुरुआत में (चरण 4.1 और 4.2) सोडियम बोरोहाइड्राइड समाधान के साथ एक उपचार (1 टीबीएस में मिलीग्राम/एमएल; 10 मिनट के लिए 3 बार), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (3%; 15 मिनट) के साथ एक उपचार या ग्लिसिन के साथ एक उपचार (0.1 एम टीबीएस में; 1h) किया जा सकता है। धुंधला के अंत में वैकल्पिक में (कदम 4.8 और 4.9 के बीच), trypan नीले (250 g/mL के साथ टीबीएस में; 20 मिनट) या सूडान ब्लैक के साथ (0.5% में 70% EtOH; 30 मिनट) प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि, सभी मामलों में, ऑटो-प्रवाह की कमी के अलावा, विशिष्ट संकेत में कमी भी हो जाएगी। वैकल्पिक रूप से, बायोप्सी गलत ढंग से तय शास्त्रीय उज्ज्वल क्षेत्र इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, तथापि, 5G4 और PGP9.5 के colocalization के लिए डबल इम्यूनोस्टेनिंग अधिक चुनौतीपूर्ण और विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो जाएगा.
एक और महत्वपूर्ण कदम cryomold में एक त्वचा बायोप्सी की प्रविष्टि है (कदम 3.3). काटने ब्लेड की ओर बायोप्सी के उन्मुखीकरण स्लाइस जिसमें epidermis और dermis दोनों मौजूद हैं प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुदैर्घ्य अक्ष (एपिडरमिस-डर्मिस) क्रायोमोल्ड के नीचे के समानांतर होना चाहिए, ताकि बायोप्सी का पक्ष, ऊपर या नीचे नहीं, ऑपरेटर का सामना करना पड़ रहा है। स्लाइस मोटाई, 50 डिग्री की पसंद, एक नैदानिक उपकरण7के रूप में त्वचा बायोप्सी के उपयोग के लिए यूरोपीय दिशा निर्देशों के अनुसार है. इसके अतिरिक्त, एक $Syn समुच्चय का पता लगाने के लिए, 50 डिग्री मी मोटाई अधिक संभावना के साथ खंड के भीतर अधिक dermal संरचनाओं, जहां पैथोलॉजिकल जमा मुख्य रूप से पीडी में पाए जाते हैं की अनुमति देता है. उच्च मोटाई के कारण, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे खंड रंगा हुआ है, यह है धुंधला के लिए स्लाइड पर वर्गों जगह की सिफारिश नहीं है, लेकिन इसके बजाय, एक मुक्त अस्थायी धुंधला अनिवार्य है। इस प्रक्रिया के लिए, बड़ी कठिनाई वर्गों को नुकसान पहुँचाए बिना एक छोटे से ब्रश का उपयोग कर एक अच्छी तरह से दूसरे करने के लिए वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए है। यह बायोप्सी कि तरल में तैरता नीचे ब्रश की नोक डालने के लिए सिफारिश की है, बायोप्सी ब्रश की नोक पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है, धीरे एक अच्छी तरह से दूसरे में बायोप्सी ले, बायोप्सी को विसर्जित करने और सुनिश्चित करें कि ब्रश बनाने को हटा दें कि कोई बायोप्सी अवशेषों ब्रश पर छोड़ दिया है. यह महत्वपूर्ण है कि ऑपरेटर अभ्यास के साथ मैनुअल कौशल प्राप्त करें।
अंत में, यह इष्टतम हैंडलिंग और त्वचा बायोप्सी के फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक छोटी और आसान प्रोटोकॉल है। पिछले अध्ययनों के संबंध में इस प्रोटोकॉल का लाभ 5G4 एंटीबॉडी का उपयोग है, पीडी रोगियों के dermal autonomic तंत्रिका फाइबर में पहली बार के लिए सिन छोटे समुच्चय का पता लगाने की अनुमति. यह संभावित PNS शामिल neurodegenerative विकारों के विभिन्न प्रकार में नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से प्रारंभिक चरणों में, जब संभावित इलाज सबसे प्रभावी हो सकता है. विधि की सीमाएं है कि पी की संवेदनशीलता और 5G4 की विशिष्टता अभी भी suboptimal हैं, लेकिन भविष्य के अध्ययन में विभिन्न मार्करों का एक संयोजन निश्चित रूप से पीडी में त्वचा बायोप्सी के नैदानिक उपज में सुधार कर सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस अध्ययन के अपने वित्तीय समर्थन के लिए पार्किंसंस Schweiz और ABREOC (एंटे Ospedaliero Cantonale के वैज्ञानिक अनुसंधान सलाहकार बोर्ड) धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
