Summary
Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.
Abstract
À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d'un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s'est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d'être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l'analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d'étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d'immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s'agit d'un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d'autres protéines d'intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l'utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.
Introduction
La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu'outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques1. En effet, l'épiderme et le derme contiennent d'abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum d'arrector musculaires. 2.
Au milieu du XXe siècle, la configuration de l'immunohistochimie de l'anticorps PGP9.5 a permis l'évidence d'une innervation étendue de la peau humaine de mammifères d'épiderme3. PGP9.5 est un hydrolase carboxyl-terminal également réparti le long des axones du système nerveux central et périphérique (PNS). La disponibilité de cet anticorps a permis non seulement de clarifier la morphologie et l'anatomie de PNS dans la peau, mais a également mis en œuvre l'étude des maladies qui lui sont associées3,4. La biopsie de peau a contribué à définir une nouvelle entité clinique : la neuropathie de petite fibre. Plusieurs groupes internationaux ont démontré l'association entre la perte des fibres nerveuses intraépidermiques et des symptômes/signes de la neuropathie de petite fibre5 par l'analyse de biopsie de peau et ont fourni des protocoles normalisés pour la morphométrie de nerf aussi bien que valeurs de référence normatives à utiliser dans la pratique clinique6,7,8.
Récemment, une grande quantité de preuves a montré que les maladies neurodégénératives, caractérisées par des accumulations de protéines mal repliées dans le système nerveux central, sont des pathologies multi-systèmes9. En effet, la DP se caractérise par une accumulation de Syn dans le neurone dopaminergique de la substantia nigra, mais il a été démontré que le Syn et sa forme pathologique, phosphorylée Syn (P-Syn), pouvaient être détectés également dans les tissus périphériques. La muqueuse gastro-intestinale10, glandes salivaires11, fibres autonomes de la peau entourant les glandes sudoripares et les muscles pilomoteurs12,13,14, montrent l'immunoréactivité aux formes pathogènes de 'Syn, en conformément à l'hypothèse de Braak qui postulent intrigantement que la pathologie de Syn peut commencer dans PNS bien à l'avance, avant son accumulation dans le cerveau15. En outre, la présence de p-Syn a été démontrée dans les nerfs de peau des patients présentant des désordres de comportement de REM qui sont considérés prodromal16,17 ainsi la peau pathologique - Syn peut être considérée un périphérique tôt prometteur marqueur histopathologique de synucleinopathy.
L'association de la neuropathie de petite fibre dans a été démontrée précédemment et il a été constaté que la densité intraepidermal de fibres de nerf reflète la progression de la maladie18,19. Par conséquent, la biopsie de peau est un outil utile pour étudier la neurodégénérescence dans la MP et pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de la maladie. En effet, la biopsie de la peau a un grand avantage d'être une procédure facilement accessible et peu invasive, permettant l'analyse des tissus nerveux enclins à la pathologie. Enfin, la possibilité de répéter la biopsie de la peau au cours du suivi des mêmes patients permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie.
Dans notre laboratoire, l'exploitation d'une double immuno-coloration avec PGP9.5 et l'anticorps monoclonal 5G4 conformation-spécifique, qui reconnaît les formes spécifiques de la maladie de 'Syn y compris les petits agrégats20,21, nous avons pu montrer le présence d'agrégats syn dans les nerfs de la peau avec une efficacité diagnostique élevée prometteuse19. L'analyse d'immunofluorescence de la biopsie de peau dans les maladies conformationnelles se distingue comme source prometteuse de biomarqueurs en combinant à la fois la détection des agrégats protéiques et la mesure de la neurodégénérescence in vivo. Par la suite, nous illustrons un protocole facile et polyvalent sur la manipulation de la biopsie de peau et l'exécution de la coloration d'immunofluorescence flottante libre pour détecter des agrégats de Syn. En outre, ce protocole peut être adapté pour cibler toute autre protéine d'intérêt exprimée dans la peau PNS.
Le protocole d'étude suivant a été utilisé pour évaluer l'utilité diagnostique de l'analyse agrégée de Syn dans le PNS de la MP par biopsie de peau19. Les critères d'inclusion pour la étaient : un diagnostic clinique défini selon les critères diagnostiques de banque de cerveau du R-U, la durée de la maladie au moins 3 ans, aucune histoire de famille, et aucune affaiblissement cognitif majeur ou symptômes dysautonomic principaux dans l'histoire. Les critères d'exclusion étaient des causes connues de neuropathie (hémoglobine glyquée, créatinine, vitamine B12, TSH, immunofixation du sérum, VIH, VHC, syphilis et borréliose). Chaque sujet a subi des biopsies de peau de 3 millimètres de diamètre à trois emplacements anatomiques (cou au niveau dermatomal de C8, cuisse 10 cm au-dessus du genou, jambe 10 cm au-dessus du malleolus latéral) sur le côté, qui a été médicalement plus affecté. En général, le protocole suivant consiste à traiter la biopsie de la peau et à effectuer la coloration et l'analyse de l'immunofluorescence flottante. Par conséquent, il peut être adapté et utilisé pour la détection d'autres protéines d'intérêt dans les tissus cutanés.
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Protocol
Le protocole a été approuvé par le Comité cantonal d'éthique et tous les sujets inscrits ont donné leur consentement éclairé écrit à l'étude.
1. Collection de biopsie de peau
- Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie de la peau dans un cadre clinique approprié.
- Choisissez la zone pour effectuer la biopsie de la peau et nettoyez-la avec un écouvillon d'alcool.
- Préparer la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2%.
- Avec l'aiguille parallèle à la région, injecter sous-cutanée l'anesthésie locale.
- Après avoir vérifié l'effet de l'anesthésie, prendre le poinçon jetable de 3 mm et appliquer une pression rotatif et délicate vers le bas pour le faire pivoter à travers l'épiderme et le derme, jusqu'à ce que la graisse sous-cutanée soit atteinte.
- Retirez le poinçon.
- Utilisez des forceps jetables pour tirer doucement le bouchon de la peau vers le haut.
- Utilisez des ciseaux pour découper la base du spécimen au niveau du tissu adipeux.
- Placez le spécimen dans un tube contenant 10 ml de solution fixative paropérienne-lysine-paraformaldéhyde (PLP).
- Désinfecter la zone et la recouvrir d'un bandage adhésif.
2. Fixation et stockage des tissus
- Faire une solution fixative PLP fraîche (voir tableau 1).
- Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, immerger dans un tube contenant 10 ml de solution fixative PLP et l'incuber pendant la nuit (O/N) à 4 oC.
- Le lendemain, sous le capot de fumée, retirer le fixatif PLP doucement et dans le même tube, laver la biopsie 3 fois pendant 5 min avec 5 ml de la solution de 0,1 M Sorensen (tableau 1).
- Jeter la solution du Sorensen et couver la biopsie avec 5 ml de solution cryo-protectrice O/N à 4 oC.
- Conserver la biopsie à 4 oC si la coupe avec un cryotome est effectuée dans un délai d'une semaine; conserver la biopsie à -20 oC si la coupe est effectuée dans un délai de 3 mois; intégrer la biopsie dans un cryomold (étapes 3.2-3.4) et la stocker à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.
3. Coupe de tissu avec un Cryotome
- Fixer le cryotome à -20 oC.
- Prenez un cryomold et remplissez-le avec le milieu cryo-embedding. Évitez de créer des bulles.
- À l'aide d'une pince à épiler, immerger la biopsie dans le milieu cryo-encastré avec l'axe longitudinal (épiderme - derme) parallèle au fond du cryomold.
- Congelez l'échantillon avec de l'azote liquide pour obtenir un cube solide de milieu cryo-encastré contenant la biopsie dans la bonne orientation.
- Mettre l'échantillon dans le cryostat et attendre 30 min pour permettre à la biopsie de s'acclimater.
- Fixer l'échantillon sur le cryostat et couper des sections de 50 m.
- À l'aide d'une petite brosse, transférer les cryosections dans une plaque de puits de 96 contenant 200 l de solution antigel dans chaque puits. Une section par puits.
- Conserver à -20 oC.
REMARQUE: Si l'analyse de la biopsie entière n'est pas analysée, coupez-la seulement partiellement. Dans ce cas, les sections doivent être stockées à -20 oC et la partie restante de la biopsie à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.
4. Staining immunofluorescence
- Remplir une assiette de 96 puits, avec 100 l de solution de lavage.
- Transférer les sections à analyser de la plaque de stockage à la nouvelle contenant la solution de lavage. 1 section par puits (4 sections par site anatomique, par patient : habituellement un total de 12 sections par patient).
- Laissez la section dans la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante (RT). Transférer la section dans un autre puits contenant la même solution et répéter le lavage.
- Déplacer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de solution de blocage et incuber pendant au moins 90 min et pour un maximum de 4 h à RT.
- Diluer les anticorps primaires anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) et anti-5G4 (Mouse monoclonal, 1:400) dans la solution de travail.
- Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps primaires et les incuber O/N à RT.
- À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min à RT, avec 100 ll de solution de lavage.
- Diluer les anticorps secondaires (conjugués avec différents fluorophores) Chèvre anti-Rabbit pour détecter PGP9.5 (1:700) et un anti-souris de chèvre pour détecter 5G4 (1:700) dans la solution de travail.
- Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps secondaires pendant 90 min à RT. À partir de ce point, couvrir la plaque de puits 96 avec du papier d'aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué avec des anticorps secondaires / ies.
- À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.
- Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 L de DAPI (dilué 1:5 000 en PBS 1x) pendant 5 min à RT.
- À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.
- Montez les sections sur une glissière dans la bonne position en évitant les erreurs de pliage.
- Ajouter quelques gouttes du support de montage sur la glissière et couvrir d'un bordereau.
- Laisser sécher les o/N avant d'utiliser le microscope confocal/fluorescence.
- Conservez les diapositives dans une boîte appropriée à 4 oC en évitant l'exposition à la lumière. S'il est stocké avec précision, le signal sera visible pendant environ 6 mois.
REMARQUE: Le transfert d'une section de la plaque de puits 96 contenant les tranches nouvellement coupées à la plaque de puits 96 contenant la solution de lavage (étape 4.1) est effectué à l'aide d'une petite brosse qui aide à ramasser la biopsie. Après le transfert de la section dans le premier puits, chaque fois que la tranche doit être incubée avec une solution différente, déplacez-la de bien à bien avec l'aide de la brosse.
5. Imagerie immunofluorescence
- Afficher les sections sous un microscope à fluorescence inversée ou un microscope confocal (20X, 40x ou grossissement supérieur, utiliser des cadres successifs de 2 par incréments de m sur un plan Z-stack pour de meilleurs résultats).
- Acquérir des images par une caméra connectée au microscope
-
Utiliser un logiciel d'imagerie adéquat (c.-à-d. ImageJ) pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d'intensité du signal. Pour ce faire, effectuer les étapes mentionnées ci-dessous.
- Ouvrez le fichier avec le logiciel ImageJ.
- Cliquez sur l'image 'gt; couleur 'gt; canaux de fractionnement afin d'analyser chaque canal de couleur.
- Cliquez sur L'image 'gt; pile 'gt; Z projet pour obtenir une fusion d'acquisitions de sections multiples.
- Cliquez sur L'image 'gt; couleur 'gt; fusionner les canaux pour obtenir une fusion de différents canaux de couleur de la même acquisition.
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Solution antigel (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois) |
30% de glycérol 30% d'éthylène glycol 30% dH2O 10% 2x tampon de phosphate |
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Solution de blocage (préparer pour le moment) |
4% Sérum de chèvre normal 1% Triton X-100 dans la solution de lavage |
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Cryo-protecteur (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois) |
20% de glycérol 80% la solution de Sorensen |
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Solution de phosphate d'hydrogène disodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois) |
0.45M Phosphate d'hydrogène disodium (Na2HPO4) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile |
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Solution Lysine (magasinà à 4 oC jusqu'à 3 semaines) |
50% de la solution monohydrochlorure L-Lysine de 0,3 M 50% de la solution de 0,1M Sorensen pH7.6 pH 7.4, filtre dans une bouteille stérile |
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Paraformaldéhyde (PFA) 8% (préparer sous le capot de fumée et le conserver à 4 oC jusqu'à 1 mois) |
2,6 M PFA en dH2O (à 55 oC, ne dépasse pas 60 oC pour éviter la formation d'acide filtre dans une bouteille stérile |
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Tampon de phosphate 2x (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois) |
6% De phosphate monosodique (NaH2PO4) solution 45% phosphate de disodium (Na2HPO4) solution en dH2O |
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Solution fixative PLP (préparer pour le moment, sous le capot de fumée ) |
25% Paraformaldéhyde 8% 0,01 M sodium (méta)période 75% Lysine solution-lt; |
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Monohydrate de phosphate de dihydrogène de sodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois) |
0.52M Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate (NaH2PO4-H2O) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile. |
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La solution de Sorensen (magasinà à 4 oC jusqu'à 1 mois) |
2,5% Solution de phosphate monosodique 18,7% Solution de phosphate de disodium pH7.6, en dH2O |
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Solution de lavage (préparer pour le moment) |
0.25M Base de Trizma 0,26 M NaCl pH7.6, en dH2O |
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Solution de travail (préparer pour le moment) |
50% Solution de blocage 50% Solution de lavage |
Tableau 1 : Solutions requises. Liste des solutions requises pour le protocole et brève description de la façon de le préparer.
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Representative Results
Après la procédure décrite (Figure 1), nous avons détecté des agrégats de Syn, étiquetés avec l'anticorps 5G4, dans les fascicles de nerf dermique intériorisant des structures autonomes des patients de. La morphologie des dépôts d'alpha-synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs dermiques (Figure 2). En effet, en exploitant ce protocole dans 19 patients de et 17 contrôles dans des biopsies de peau à trois emplacement anatomique (cervical, cuisse et jambe distale) nous avons constaté que 5G4 a eu 81% de sensibilité et 86% de la spécificité en ce qui concerne des contrôles sains et P-Syn a eu 56% de sensibilité et 100% de spécificité19.
En particulier, nous avons trouvé des dépôts positifs 5G4 et P-Syn principalement dans les nerfs autour des glandes sudoripares, mais aussi dans le pili d'érection musculaire, les petits vaisseaux, et le plexus subepidermal et dermique, jamais dans les fibres nerveuses intraepidermales.
En général, dans le lumen de la glande sudoripare, il est possible d'observer un signal non spécifique, qui pourrait être mal interprété comme la positivité 5G4/ P-Syn. Ce type de signal est pointillé, sphérique et il est probablement dû à des matériaux autofluorescents intra-luminal, comme nous l'avons démontré dans les contrôles techniques sans anticorps primaires et secondaires (Figure 3). La co-localisation avec PGP9.5 qui marque les fibres nerveuses, qui sont morphologiquement filamenteuses et allongées, aide à identifier le signal correct. Par conséquent, la spécificité du signal 5G4 est fortement augmentée par une double immunostaining avec un marqueur axonal (Figure 4).
Une fixation précise de la biopsie est un facteur obligatoire pour la bonne qualité de la coloration d'immunofluorescence, et pour l'interprétation fiable des signaux fluorescents. Si le fixatif n'est pas correctement préparé ou si une surfixation s'est produite, le résultat sera une autofluorescence élevée qui masquera le signal des fibres nerveuses traversant la jonction dermale-épidermique ou innervate les structures cutanées principales (figure5 B, D, F). Dans ce cas, l'incapacité de visualiser correctement les fibres positives PGP9.5 rendra difficile à analyser correctement aussi 5G4.
Enfin, ce protocole peut être utilisé pour la détection de toute protéine d'intérêt, y compris, entre autres, l'hydroxylase de tyxine (TH) et le peptide intestinal vasoactif (VIP) qui marquent respectivement le sous-type adrénergique et cholinergique du sous-type autonome innervation (Figure 6).
Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Représentation graphique des étapes critiques dans la fixation, la coupe et la coloration des sections de peau pour la visualisation des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses périphériques cutanées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Présence d'agrégats 5G4 dans les fibres nerveuses cutanées. Confocal a fusionné des images Z-pile de l'immunofluorescence avec PGP9.5 (vert) et 5G4 (rouge) des nerfs dermiques autour des glandes sudoripares dans les patients de (A-C) et sujet sain (D-F). Ce chiffre est modifié à partir de 19. La visualisation 3D de la même glande sudoripare a montré ci-dessus de (G) et les sujets sains (H). Indiqué par des flèches blanches, colocalisation jaune des deux marqueurs le long des axones. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Signaux autofluorescents : contrôles techniques. Confocal fusionné Z-pile images de section de la peau tachée de DAPI et sans l'anticorps primaire (A-B), sans l'anticorps secondaire (C-D), sans anticorps primaires et secondaires (E-F). Les images montrent la présence de signaux pointillés non spécifiques dans les structures des glandes sudoripares dans toutes les conditions. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Considérez la morphologie des fibres nerveuses pour reconnaître le signal non spécifique. Confocal fusionner les images Z-pile de l'immunofluorescence avec PGP9.5 (vert) et 5G4 (rouge) des nerfs dermiques autour des glandes sudoripares. Les flèches blanches indiquent des structures positives; les astérisques indiquent la coloration non spécifique dans les structures non-neuronales. Barre d'échelle de 50 m. Ce chiffre est modifié à partir de la référence19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Une fixation incorrecte compromet la qualité de la coloration immunofluorescence. Confocal fusionner les images Z-pile de l'immunofluorescence avec PGP9.5 (vert) et DAPI (bleu) des fibres de nerfs épidermiques intra -A-B) et les nerfs dermiques autour de la glande sébacée (C-D) et les glandes sudoripares (E-F). Sur le résultat de gauche de la fixation correcte, sur le résultat droit de la fixation excessive. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Exemples d'autres protéines détectables dans les nerfs cutanés. Images de microscope des structures cutanées souillées utilisant un assay d'immunofluorescence flottant libre. En rouge 'Syn (A), p-Syn (B), et TH (C), en vert VIP (D). Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons un analyse d'immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l'immunostaining double avec l'anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.
Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d'autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l'accès direct au tissu nerveux enclin à la maladie par une technique légèrement invasive et donc avec une meilleure détermination prévue la sensibilité pour les agrégats syn que les fluides biologiques comme le sang ou le FSC; 2) la possibilité de détecter et de quantifier la densité épidermique et autonome de fibre de nerf comme mesure de la neurodégénérescence ; 3) la possibilité de répéter la biopsie de peau dans le cours du suivi des mêmes patients, afin d'étudier longitudinalement la corrélation avec la progression de la maladie.
Le protocole proposé ici est rapide, polyvalent et comporte peu d'étapes critiques. Tout d'abord, la fixation des tissus doit être poursuivie correctement, sinon une forte autofluorescence masquera le signal spécifique et empêchera l'analyse correcte des données. Le paraformaldéhyde dans la solution fixative doit être frais et le pH de 7,4 doit être vérifié avec précision. Il est extrêmement important d'éviter la formation d'acide formique qui pourrait endommager les biopsies. Avant le stockage et la coupe, si la compacité de la biopsie suggère une fixation incorrecte, la biopsie doit être rincée à nouveau avec la solution de Sorensen, et réincubée avec la solution PLP O/N à 4 oC. De plus, au début ou à la fin du protocole de coloration de l'immunofluorescence, quelques étapes supplémentaires peuvent être introduites pour contrer l'autofluorescence. Au début du protocole (entre les étapes 4.1 et 4.2) un traitement avec la solution de borohydride de sodium (1 mg/mL dans TBS ; 3 fois pour 10 min), un traitement avec le peroxyde d'hydrogène (3%; 15 min) ou un traitement avec la glycine (0.1 M dans TBS ; 1h) peut être exécuté. En alternative à la fin de la coloration (entre les étapes 4.8 et 4.9), un traitement avec le bleu trypan (250 g/mL dans tbS; 20 min) ou avec Le Soudan noir (0,5% en 70% EtOH; 30 min) peut être effectué. Cependant, dans tous les cas, en plus de la réduction de l'autofluorescence, une réduction du signal spécifique se produira également. Alternativement, les biopsies incorrectement fixées peuvent être employées pour exécuter l'immunohistochemistry lumineux classique de champ. Dans ce cas, cependant, la double immunostaining pour la colocalisation de 5G4 et PGP9.5 sera plus difficile et difficile à analyser.
Une autre étape critique est l'insertion d'une biopsie de la peau dans le cryomold (étape 3.3). L'orientation de la biopsie vers la lame de coupe est cruciale pour obtenir des tranches dans lesquelles l'épiderme et le derme sont tous deux présents. L'axe longitudinal (épiderme-derme) doit être parallèle au fond du cryomold, de sorte que le côté de la biopsie, et non le haut ou le bas, est face à l'opérateur. Le choix de l'épaisseur des tranches, 50 m, est conforme aux directives européennes pour l'utilisation de la biopsie de la peau comme un outil de diagnostic7. De plus, pour une détection d'agrégats de Syn, l'épaisseur de 50 m permet avec une plus grande probabilité d'avoir dans la section des structures plus dermiques, où le dépôt pathologique se trouve principalement dans la. En raison de l'épaisseur élevée, pour être sûr que toute la section est teint, il est il n'est pas recommandé de placer les sections sur la glissière pour la coloration, mais au lieu de cela, une coloration flottante libre est obligatoire. Pour cette procédure, la principale difficulté est de transférer les sections d'un puits à l'autre à l'aide d'une petite brosse sans endommager les sections. Il est recommandé d'insérer le bout de la brosse sous la biopsie qui flotte dans le liquide, permettant à la biopsie de s'installer sur le bout de la brosse, de porter doucement la biopsie d'un puits à l'autre, d'immerger la biopsie dans la nouvelle solution et d'enlever la brosse en s'assurant que aucun résidu de biopsie n'est laissé sur la brosse. Il est important que l'opérateur acquière des compétences manuelles avec la pratique.
En conclusion, il s'agit d'un protocole court et facile pour la manipulation optimale et l'immunostaining fluorescent de la biopsie de la peau. L'avantage de ce protocole par rapport aux études précédentes est l'utilisation de l'anticorps 5G4, permettant la détection de petits agrégats syn pour la première fois dans les fibres nerveuses autonomes dermiques des patients atteints de. Il peut être potentiellement utilisé à des fins diagnostiques dans différents types de troubles neurodégénératifs impliquant PNS, en particulier aux premières phases, lorsque la guérison potentielle peut être plus efficace. Les limites de la méthode est que la sensibilité de P-Syn et la spécificité de la 5G4 sont encore sous-optimales, mais une combinaison de différents marqueurs dans des études futures pourrait certainement améliorer le rendement diagnostique de la biopsie de la peau dans la MP.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Parkinson Schweiz et ABREOC (le Conseil consultatif de recherche scientifique de l'Ente Ospedaliero Cantonale) pour leur soutien financier à cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
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