Summary
Her præsenterer vi en protokol for en fritflydende indirekte immunofluorescens assay på hud biopsi sektioner, der giver mulighed for identifikation af sygdomsspecifikke kropsbygnings varianter af alpha synuclein involveret i Parkinsons sygdom og flere proteiner i perifert nervesystem.
Abstract
Til dato, for de fleste neurodegenerative sygdomme er kun en post mortem histopatologisk endelig diagnose tilgængelig. For Parkinsons sygdom (PD), diagnosen stadig kun afhænger af kliniske tegn på motoriske involvering, der vises senere i sygdomsforløbet, når de fleste af de dopaminerge neuroner er allerede tabt. Derfor er der et stort behov for en biomarkør, der kan identificere patienter i begyndelsen af sygdom eller med risiko for at udvikle det. I løbet af de sidste par år har hudbiopsi vist sig at være en fremragende forskning og diagnostisk værktøj til perifere nervesygdomme såsom små fiber neuropati. Interessant, en lille fiber neuropati og alpha synuclein (αSyn) neurale indskud er blevet påvist ved hudbiopsi hos PD patienter. Faktisk, hudbiopsi har den store fordel ved at være en let tilgængelig, minimalt invasiv og smertefri procedure, der gør det muligt at analysere perifere nerve væv tilbøjelige til patologi. Desuden muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af den samme patient giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression. Vi har oprettet en standardiseret pålidelig protokol til at undersøge tilstedeværelsen af αSyn aggregater i hud nervefibre af PD patienten. Denne protokol omfatter kun få korte fikserings trin, en kryotomsektionering og derefter en fritflydende immunofluorescens, dobbelt farvning med to specifikke antistoffer: anti protein Genprodukt 9,5 (PGP 9.5) til at markere kutane nervefibre og anti 5G4 til påvisning af αSyn aggregater. Det er en alsidig, følsom og nem at udføre protokol, der også kan anvendes til at målrette andre proteiner af interesse i huden nerver. Evnen til at markere αSyn aggregater er endnu et skridt frem mod anvendelse af hudbiopsi som et redskab til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af PD.
Introduction
Skin biopsi har fået en stor betydning som diagnostisk og forskning værktøj inden for neurologiske lidelser1. Faktisk, epidermis og dermis indeholder rigelige somatiske sensoriske nervefibre (myelinerede og umyelineret), nociceptive frie nerveender, sensoriske receptorer og autonom innervation af svedkirtler, kar, talgkirtler og muskel arrector pilorum 2. i.
I midten af 20th århundrede, opsætningen for Immunhistokemi af PGP 9.5 antistof tilladt bevis for en omfattende innervation af humant epidermis pattedyr hud3. PGP 9.5 er en carboxyl-Terminal lav affinitet ligeligt fordelt langs axoner af både det centrale og perifere nervesystem (PNS). Tilgængeligheden af dette antistof tilladt ikke kun at afklare morfologi og anatomi af PNS i huden, men også implementeret studiet af sygdomme forbundet med det3,4. Hudbiopsi bidrog til at definere en ny klinisk enhed: den lille fiber neuropati. Flere internationale grupper viste sammenhæng mellem tabet af intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på lille fiber neuropati5 ved Skin biopsi analyse og forudsat standardiserede protokoller for nerve morphometri samt normative referenceværdier, der skal anvendes i den kliniske praksis6,7,8.
For nylig en stor mængde af beviser har vist, at neurodegenerative sygdomme, karakteriseret ved misfoldet protein akkumuleringer i det centrale nervesystem, er multi-system patologier9. Faktisk, PD er karakteriseret ved αsyn akkumulering i dopaminerge neuron af substantia nigra, men det er blevet påvist, at αsyn og dets patologiske form, fosforyleres αsyn (P-αsyn), kunne påvises også i det perifere væv. Gastrointestinalt slimhinde10, spytkirtler11, hudens autonome fibre omkring svedkirtler og pilomotor muskler12,13,14, viser immunoreactivity til patogene former af αsyn, i overensstemmelse med Braak-hypotesen om, at det er interessant at postulere, at αSyn patologi kan begynde i PNS i god tid før dens akkumulering i hjernen15. Desuden er tilstedeværelsen af p-αsyn blevet påvist i hudens nerver af patienter med rem-adfærdsforstyrrelser, som anses for at være prodromale PD16,17 således kan hudpatologisk αsyn betragtes som en lovende tidlig perifer histopatologisk markør for synukleinopati.
Sammenslutningen af små fiber neuropati i PD er blevet påvist tidligere, og det er blevet konstateret, at intraepidermal nervefibre tæthed afspejler sygdomsprogression18,19. Derfor er huden biopsi et nyttigt redskab til at studere neurodegeneration i PD og til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af sygdommen. Faktisk, hudbiopsi har en stor fordel ved at være en let tilgængelig og minimalt invasive procedure, så analysen af nervevævet tilbøjelig til patologi. Endelig muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af de samme patienter giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression.
I vores laboratorium, udnytter en dobbelt immuno-farvning med PGP 9.5 og konformation-specifikke monoklonale 5g4 antistof, der genkender sygdomsspecifikke former for αsyn herunder små aggregater20,21, vi var i stand til at vise tilstedeværelsen af αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høj diagnostisk effektivitet19. Immunofluorescens analyse af hudbiopsi i konformationelle sygdomme skiller sig ud som en lovende kilde til biomarkører ved at kombinere både påvisning af protein aggregater og måling af neurodegeneration in vivo. Herefter illustrerer vi en let og alsidig protokol om håndtering af hudbiopsi og udførelse af fritflydende immunofluorescens farvning til påvisning af αSyn aggregater. Desuden kan denne protokol tilpasses til at målrette ethvert andet protein af interesse udtrykt i huden PNS.
Følgende studie protokol er blevet anvendt til at evaluere den diagnostiske nytte af aggregeret αSyn analyse i PNS af PD ved hud biopsi19. Inklusionskriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til den britiske Brain bank diagnostiske kriterier, sygdom varighed mindst 3 år, ingen slægtshistorie, og ingen større kognitiv svækkelse eller større dysautonomiske symptomer i historien. Udelukkelseskriterier var kendte årsager til neuropati (glycated hæmoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofiksation, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gennemgik 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske steder (hals på C8 dermatomal niveau, lår 10 cm over knæet, Ben 10 cm over lateral malleolus) på siden, som var klinisk mere påvirket. Generelt er følgende protokol handler om håndtering af huden biopsi og udføre den fritflydende immunofluorescens farvning og analyse. Derfor kan det tilpasses og anvendes til påvisning af andre proteiner af interesse i hudvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er blevet godkendt af den kantonale etiske komité, og alle tilmeldte forsøgspersoner gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen.
1. Skin biopsi Collection
- Lad en kvalificeret læge udføre hudbiopsien i en passende klinisk indstilling.
- Vælg området for at udføre huden biopsi og rense det med en spritserviet.
- Forbered anæstesi opløsningen med 1 CC lidocain 2%.
- Med nålen parallelt med området, injicere lokale anæstesi subkutant.
- Efter kontrol af effekten af anæstesi, tage 3 mm engangs punch og anvende roterende og sarte nedadgående tryk for at rotere det ned gennem epidermis og dermis, indtil det subkutane fedt er nået.
- Træk punch.
- Brug engangs pincet til forsigtigt at trække i huden.
- Brug en saks til at skære bunden af præparatet på niveauet af fedtvæv.
- Prøven anbringes i et reagensglas, der indeholder 10 mL fixativ opløsning af periodate-lysin-PARAFORMALDEHYD (PLP).
- Desinficer området og dæk det med en klæbe bandage.
2. vævs fiksering og opbevaring
- Gør en frisk PLP fikativ opløsning (Se tabel 1).
- Umiddelbart efter indsamlingen af hudbiopsi, nedsænkes det i et rør, der indeholder 10 mL PLP fikativ opløsning og inkube det natten over (O/N) ved 4 °C.
- Dagen efter, under stinkhætten, fjerne PLP fiksen forsigtigt og i samme rør, vaske biopsi 3 gange i 5 min med 5 mL af 0,1 M Sørensens opløsning (tabel 1).
- Kassér Sørensens opløsning og inkube Biopsien med 5 mL Cryo-protectant opløsning O/N ved 4 °C.
- Biopsien opbevares ved 4 °C, hvis snittet med en kryotomer udføres inden for 1 uge. oplagrer Biopsien ved-20 °C, hvis snittet udføres inden for 3 måneder indkapsle Biopsien i en kryomold (trin 3.2-3.4) og opbevar den ved-80 °C for at bevare den i en længere periode.
3. vævs udskæring med en Kryotome
- Sæt kryotomen ved-20 °C.
- Tag en kryomgammel og fyld den op med kryo-indlejrings mediet. Undgå at oprette bobler.
- Ved hjælp af pincet nedsænkes Biopsien i kryo-indlejrings mediet med længdeaksen (epidermis-dermis) parallelt med bunden af kryomold.
- Snap fryse prøven med flydende kvælstof for at opnå en solid kube af kryo-indlejring medium, der indeholder biopsi i den rigtige retning.
- Sæt prøven i kryostat og vent i 30 minutter for at tillade biopsi at akklimatisere.
- Prøven fastsættes på kryostat og skæres 50 μm sektioner.
- Ved hjælp af en lille børste overføres kryo-sektionerne i en 96 brønd plade indeholdende 200 μL frostvæske i hver brønd. En sektion pr. brønd.
- Opbevares ved-20 °C.
Bemærk: Hvis analysere hele biopsi er ikke analyseret, klippe det kun delvist. I dette tilfælde skal sektionerne opbevares ved-20 °C og den resterende del af Biopsien ved-80 °C for at bevare den i en længere periode.
4. immunofluorescens farvning
- Fyld en 96 brønd plade med 100 μL vaskeopløsning.
- Overfør de sektioner, der skal analyseres, fra opbevarings pladen til den nye, der indeholder Vaskeopløsningen. 1 sektion pr. brønd (4 sektioner pr. Anatomisk sted, pr. patient: sædvanligvis i alt 12 sektioner pr. patient).
- Lad afsnittet i Vaskeopløsningen være i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Overfør sektionen til en anden brønd, der indeholder den samme opløsning, og Gentag vasken.
- Sektionerne flyttes til nye brønde, der indeholder 100 μL blokerende opløsning, og inkupereres i mindst 90 min og i højst 4 timer ved RT.
- Fortynd de primære antistoffer anti-PGP 9.5 (kanin polyklon, 1:1000) og anti-5G4 (mus monoklonale, 1:400) i arbejdsopløsningen.
- Sektionerne overføres til nye brønde, der indeholder 100 μL af den arbejdende opløsning af de primære antistoffer og inkuperer dem O/N ved RT.
- Som trin 4,3 vaskes sektionerne 2 gange i mindst 10 minutter ved RT med 100 μL vaskeopløsning.
- Fortynde sekundære antistoffer (konjugat med forskellige fluorophores) ged anti-kanin til at detektere PGP 9.5 (1:700) og en Goat anti-Mouse til at detektere 5G4 (1:700) i arbejdsopløsningen.
- Afsnittene overføres til nye brønde, der indeholder 100 μL af den fungerende opløsning af de sekundære antistoffer i 90 min ved RT. Fra dette punkt, dække 96 brønd pladen med aluminiumsfolie for at undgå blegning af fluorophore konjugeret med sekundære antistof/IES.
- Som trin 4,3 vaskes sektionerne 2 gange i mindst 10 minutter med 100 μL af Vaskeopløsningen.
- Afsnittene overføres til nye brønde, der indeholder 100 μL DAPI (fortyndet 1:5000 i PBS 1x) i 5 minutter ved RT.
- Som trin 4,3 vaskes sektionerne 2 gange i mindst 10 minutter med 100 μL af Vaskeopløsningen.
- Monter sektionerne på et dias i den korrekte position, så du undgår at folde.
- Tilsæt et par dråber af monterings mediet på sliden, og dæk med en coverslip.
- Lad diasene tørre O/N, før du bruger mikroskopet med Konfokal/fluorescens.
- Slidene opbevares i en passende æske ved 4 °C, så lyseksponeringen undgås. Hvis det er korrekt opbevaret, vil signalet være synligt i ca. 6 måneder.
Bemærk: Overførslen af en sektion fra 96 brønd pladen, der indeholder de nyklippede skiver til 96 brønd pladen, der indeholder Vaskeopløsningen (trin 4,1), udføres ved hjælp af en lille børste, der hjælper med at opfange Biopsien. Efter overførslen af sektionen i den første brønd, skal hver gang udsnittet skal inkueres med en anden løsning, flytte det fra godt til godt med hjælp af børsten.
5. immunofluorescens afbildning
- Vis sektioner under et inverteret fluorescens mikroskop eller et confokal mikroskop (20X, 40x eller højere forstørrelse, brug efterfølgende rammer med 2 μm intervaller på en Z-stak plan for de bedste resultater).
- Hent billeder ved et mikroskop tilsluttet kamera
-
Brug en passende billedbehandlingssoftware (dvs. ImageJ) til at analysere positive signaler i sektioner med hensyn til rumlig fordeling og signalets intensitet. For at gøre dette udføre de trin, der er nævnt nedenfor.
- Åbn filen med ImageJ software.
- Klik på billede > farve > split kanaler for at analysere hver farvekanal.
- Klik på billede > stak ≫ Z-projekt for at få en fletning af flere sektions anskaffelser.
- Klik på billede > farve > flette kanaler for at få en fletning af forskellige farvekanaler med samme anskaffelse.
|
Anti fryse opløsning (opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder) |
30% glycerol 30% ethylenglycol 30% dH2O 10% 2x fosfatbuffer |
|
Blokerende løsning (Forbered i øjeblikket) |
4% normalt gede serum 1% Triton X-100 i vaskeopløsning |
|
Cryo-protektant (opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder) |
20% glycerol 80% Sørensens løsning |
|
Natriumhydrogenphosphatopløsning (opbevares ved RT op til 6 måneder) |
0,45 m dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) i dH2O Filtrer i en steril flaske |
|
Lysin opløsning (opbevares ved 4 °C i op til 3 uger) |
50% af 0,3 M L-lysin monohydrochloridopløsning 50% af 0,1 M Sorensens løsning pH 7.6 pH 7,4, Filtrer i en steril flaske |
|
PARAFORMALDEHYD (PFA) 8% (tilberedning under stinkskab og opbevares ved 4 °C i op til 1 måned) |
2.6 m PFA i dH2O (til 55 °C _må ikke overskride 60 °C filter i en steril flaske |
|
Fosfatbuffer 2x (opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder) |
6% mononatriumphosphatopløsning (NaH2PO4) 45% dinatriumphosphatopløsning (Na2HPO4) i dH2O |
|
PLP fikativ løsning (Forbered i øjeblikket, under røg hætte) |
25% PARAFORMALDEHYD 8% 0,01 m natrium (meta) periodate 75% lysin opløsning < |
|
Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat (opbevares ved RT op til 6 måneder) |
0,52 m natriumdihydrogenphosphatmonohydrat (NaH2PO4 * H2O) i dH2O Filtrer i en steril flaske. |
|
Sørensens løsning (opbevares ved 4 °C i op til 1 måned) |
2,5% mononatriumphosphatopløsning 18,7% dinatriumphosphatopløsning pH 7.6, i dH2O |
|
Vaskeopløsning (Forbered i øjeblikket) |
0,25 m Trizma base 0,26 m NaCl pH 7.6, i dH2O |
|
Arbejds løsning (Forbered i øjeblikket) |
50% blokerende løsning 50% vaskeopløsning |
Tabel 1: Nødvendige løsninger. Liste over påkrævede løsninger til protokollen og kort beskrivelse af, hvordan den skal forberedes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrevne procedure (figur 1), vi detekterede αsyn aggregater, mærket med 5G4 antistof, i dermal nerve fascicles innerverende autonome strukturer PD patienter. Morfologi af alpha-synuclein indskud vises som et punkteret signal langs axoner af dermal nerver (figur 2). Faktisk, at udnytte denne protokol i 19 PD patienter og 17 kontrol i huden biopsier på tre anatomiske sted (cervikal, lår og distale ben) fandt vi, at 5G4 havde 81% følsomhed og 86% af specificitet hensyn til sund kontrol og P-αSyn havde 56% følsomhed og 100% af specificiteten19.
Især fandt vi 5G4 og P-αSyn positive indskud primært i nerver omkring svedkirtler, men også i muskel erector Pili, små fartøjer, og subepidermal og dermal plexus, aldrig i intraepidermal nervefibre.
Generelt, inden for sved kirtel lumen, er det muligt at observere et ikke-specifikt signal, som kan misfortolkes som 5G4/P-αSyn positivitet. Denne type signal er punkteret, sfærisk og det skyldes sandsynligvis til intraluminal Auto-fluorescerende materiale, som vi demonstreret i tekniske Kontroller uden primære og sekundære antistoffer (figur 3). Samlokalisering med PGP 9.5, der markerer nervefibrene, som morfologisk er filamentøse og aflange, hjælper med at identificere det korrekte signal. Derfor er specificiteten af 5G4 signal stærkt forhøjet med en dobbelt immun farvning med en axonal markør (figur 4).
En nøjagtig fiksering af Biopsien er en obligatorisk faktor for den gode kvalitet af immunofluorescens farvning, og for pålidelig fortolkning af de fluorescerende signaler. Hvis fikserings funktionen ikke er korrekt forberedt, eller hvis der er forekommet en overdreven fiksering, vil resultatet være en høj Auto-fluorescens, der vil maskere signalet fra nervefibre, der krydser det dermale-epidermale kryds eller innerverer de vigtigste dermal strukturer (figur 5 B, D, F). I dette tilfælde, den manglende evne til at visualisere korrekt PGP 9.5 positive fibre vil gøre svært at analysere korrekt også 5G4.
Endelig kan denne protokol anvendes til påvisning af ethvert protein af interesse, herunder blandt andet αSyn, P-αSyn eller tyrosin hydroxylase (TH) og vasoaktive intestinal peptid (VIP), der markerer henholdsvis adrenerge og kolinerge under type af autonome en innervation (figur 6).
Figur 1 : Skematisk gengivelse af protokollen. Grafisk fremstilling af kritiske trin i fiksering, udskæring og farvning af hudsektioner til visualisering af αSyn aggregater i kutane perifere nervefibre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Tilstedeværelse af 5G4 aggregater i dermal nervefibre. Confocal fusionerede Z-stack billeder af immunofluorescens med PGP 9.5 (grøn) og 5G4 (rød) af dermal nerver omkring svedkirtler i PD patienter (A – C) og raske forsøgs (D-F). Dette tal er ændret fra 19. 3D visualisering af samme sved kirtel viste ovenfor fra PD (G) og raske (H). Indikeret med hvide pile, gul kolokalisering af de to markører langs axoner. Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Auto-fluorescerende signaler: tekniske kontroller. Confocal fusionerede Z-stack billeder af huden sektion bejdset med DAPI og uden det primære antistof (a-B), uden det sekundære antistof (C-D), uden primære og sekundære antistoffer (E-F). Billederne viser tilstedeværelsen af ikke-specifikke punkterede signaler i svedkirtler strukturer under alle forhold. Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Overvej nervefibre morfologi at genkende ikke-specifikke signal. Confocal fusionerer Z-stack billeder af immunofluorescens med PGP 9.5 (grøn) og 5G4 (rød) af dermal nerver omkring svedkirtler. Hvide pile indikerer positive strukturer; asterisker indikerer uspecifik farvning i ikke-neuronale strukturer. Skaleringsbar = 50 μm. Dette tal er ændret fra reference19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Ukorrekt fiksering kompromitterer immunofluorescens farvnings kvalitet. Confocal fusionere Z-stack billeder af immunofluorescens med PGP 9.5 (grøn) og DAPI (blå) intra epidermal nerver fibre (a-B) og dermal nerver omkring Talgkirtel (C-D) og svedkirtler (E-F). På venstre resultat af korrekt fiksering, på det rigtige resultat af over fiksering. Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Eksempler på andre proteiner, der er påvise elige i huden nerver. Mikroskop billeder af dermal strukturer bejdset ved hjælp af en fritflydende immunofluorescens analyse. I rødt αSyn (A), p-Αsyn (B) og th (C), i grøn VIP (D). Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en fritflydende immunofluorescens analyse for hud biopsier til diagnosticering af PD: det udnytter dobbelt immun farvning med anti-PGP 9.5 antistof, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformation specifikke antistof, der genkender den aggregerede form af αSyn.
De store fordele ved hud biopsi til diagnostisk formål i PD og eventuelt i andre protein konformationelle lidelser er: 1) direkte adgang til nerve væv tilbøjelige til sygdom ved en mildt invasiv teknik og dermed med en forventet bedre bestemmelse følsomhed for αSyn aggregater end biologiske væsker som blod eller CSF; 2) mulighed for at detektere og kvantificere epidermal og autonom nerve fiber tæthed som et mål for neurodegeneration; 3) muligheden for at gentage hudbiopsi i løbet af opfølgningen af de samme patienter, med henblik på at studere i længderetningen sammenhængen med sygdomsprogression.
Den foreslåede protokol er hurtig, alsidig og har kun få kritiske trin. For det første skal vævs fiksation forfølges korrekt, ellers vil en høj Auto-fluorescens maskere det specifikke signal og vil forhindre en korrekt analyse af dataene. PARAFORMALDEHYD i den fikse ende opløsning skal gøres frisk, og pH-værdien på 7,4 skal kontrolleres nøjagtigt. Det er yderst vigtigt at undgå dannelsen af myresyre, der kan beskadige biopsier. Før opbevaring og udskæring, hvis sammensætningen af Biopsien antyder en ukorrekt fiksering, skal Biopsien skylles igen med Sørensens opløsning og geninkubieres med PLP-opløsning O/N ved 4 °C. Desuden kan der ved begyndelsen eller slutningen af immunofluorescens farvnings protokol indføres et par yderligere trin for at modvirke Auto-fluorescens. I begyndelsen af protokollen (mellem trin 4,1 og 4,2) kan der udføres en behandling med natriumborohydridopløsning (1 mg/mL i TBS; 3 gange i 10 min), en behandling med hydrogenperoxid (3%; 15 min) eller en behandling med glycin (0,1 M i TBS; 1H). Alternativt ved slutningen af farvningen (mellem trin 4,8 og 4,9) kan der udføres en behandling med trypan blå (250 μg/mL i TBS; 20 min) eller med Sudan Black (0,5% i 70% EtOH; 30 min). Men i alle tilfælde, ud over reduktionen af Auto-fluorescens, en reduktion i det specifikke signal vil også forekomme. Alternativt kan biopsier, der er ukorrekt fikseret, anvendes til at udføre klassisk lyse felt Immunohistokemi. I dette tilfælde, dog, den dobbelte immunofarvning for samlokalisering af 5G4 og PGP 9.5 vil være mere udfordrende og vanskeligt at analysere.
Et andet kritisk skridt er indsættelse af en hudbiopsi i kryomold (trin 3,3). Orienteringen af Biopsien mod skærklingen er afgørende for at få skiver, hvor epidermis og dermis begge er til stede. Længdeaksen (epidermis-dermis) skal være parallel med bunden af kryomold, således at siden af Biopsien, ikke toppen eller bunden, vender operatøren. Valget af skiver tykkelse, 50 μm, er i overensstemmelse med europæiske retningslinjer for brug af hudbiopsi som et diagnostisk værktøj7. Desuden, for en αSyn aggregater påvisning, 50 μm tykkelse tillader med større sandsynlighed for at have i afsnittet mere dermal strukturer, hvor patologisk deponering er hovedsageligt findes i PD. på grund af den høje tykkelse, for at være sikker på, at hele afsnittet er farvet, er det ikke anbefales at placere sektioner på diaset for farvning, men i stedet, en fri flydende farvning er obligatorisk. For denne procedure er det største problem at overføre sektionerne fra en brønd til en anden ved hjælp af en lille børste uden at beskadige sektionerne. Det anbefales at indsætte spidsen af børsten under biopsi, der svæver i væsken, så biopsi at bosætte sig på spidsen af børsten, forsigtigt bære biopsi fra en brønd til en anden, fordybe biopsi i den nye løsning og fjerne børsten at sikre, at ingen biopsi rester er tilbage på børsten. Det er vigtigt, at operatøren erhverver manuelle færdigheder med praksis.
Afslutningsvis, dette er en kort og nem protokol for optimal håndtering og fluorescerende immunofarvning af huden biopsi. Fordelen ved denne protokol i forhold til tidligere undersøgelser er brugen af 5G4 antistof, så påvisning af αSyn små aggregater for første gang i dermal autonome nervefibre af PD patienter. Det kan potentielt anvendes til diagnostiske formål i forskellige typer af neurodegenerative lidelser involverer PNS, især i de tidlige faser, når potentiel kur kan være mest effektive. Begrænsninger af metoden er, at følsomheden af P-αSyn og specificitet af 5G4 er stadig suboptimale, men en kombination af forskellige markører i fremtidige undersøgelser kunne helt sikkert forbedre diagnostisk udbytte af huden biopsi i PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Parkinson Schweiz og ABREOC (den videnskabelige Forsknings rådgivende bestyrelse for Ente Ospedaliero Cantonale) for deres økonomiske støtte til denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
