Summary
Hier presenteren we een protocol voor een vrij zwevende indirecte immunofluorescentie assay op de huid biopsie secties die het mogelijk maakt voor de identificatie van de ziekte specifieke conformatie varianten van Alfa synuclein betrokken bij de ziekte van Parkinson en meerdere eiwitten van de perifere zenuwstelsel.
Abstract
Tot op heden is voor de meeste neurodegeneratieve ziekten alleen een post-mortem histopathologisch definitieve diagnose beschikbaar. Voor de ziekte van Parkinson (PD), de diagnose nog steeds berust alleen op klinische symptomen van de motor betrokkenheid die later verschijnen in de ziekte natuurlijk, wanneer de meeste van de Dopaminerge neuronen zijn al verloren. Daarom is er een sterke behoefte aan een biomarker die patiënten kunnen identificeren aan het begin van de ziekte of op het risico van de ontwikkeling ervan. In de afgelopen jaren, huid biopsie heeft bewezen een uitstekend onderzoek en diagnostisch hulpmiddel voor perifere zenuwziekten zoals kleine vezel neuropathie. Interessant is dat een kleine Fiber neuropathie en Alfa synuclein (αSyn) neurale deposito's zijn aangetoond door huid biopsie bij PD patiënten. Inderdaad, huid biopsie heeft het grote voordeel dat het een gemakkelijk toegankelijke, minimaal invasieve en pijnloze procedure die het mogelijk maakt de analyse van perifeer zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Bovendien, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënt maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met de progressie van de ziekte. We zetten een gestandaardiseerd betrouwbaar protocol om de aanwezigheid van αSyn aggregaten in de huidzenuw vezels van de PD patiënt te onderzoeken. Dit protocol omvat weinig korte fixatie stappen, een cryotome en vervolgens een vrij zwevende immunofluorescentie Double-kleuring met twee specifieke antilichamen: anti-eiwit gen product 9,5 (PGP 9.5) om de cutane zenuwvezels en anti 5G4 voor het opsporen van merk αSyn aggregaten. Het is een veelzijdig, gevoelig en gemakkelijk uit te voeren protocol dat ook kan worden toegepast voor het richten van andere eiwitten van belang in de huid zenuwen. De mogelijkheid om αSyn aggregaten merk is een andere stap voorwaarts om het gebruik van huid biopsie als een instrument voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van PD.
Introduction
Huid biopsie heeft verworven een groot belang als de diagnostische en Research Tool op het gebied van neurologische aandoeningen1. Inderdaad, epidermis en dermis bevatten overvloedige somatische zintuiglijke zenuwvezels (gemyeliniseerde en mergloze), Nociceptieve vrije zenuwuiteinden, zintuiglijke receptoren en autonome innervatie van zweetklieren, schepen, talgklieren en spier arrector pilorum 2.
In het midden van de 20e eeuw, de Setup voor Immunohistochemistry van PGP 9.5 antilichaam toegestaan het bewijs van een uitgebreide innervatie van de menselijke epidermis zoogdier huid3. PGP 9.5 is een carboxyl-Terminal hydrolase gelijkelijk verdeeld langs axons van zowel het centrale en perifere zenuwstelsel (PNS). De beschikbaarheid van dit antilichaam liet niet alleen toe om de morfologie en de anatomie van PNS in de huid te verduidelijken maar ook uitgevoerd de studie van ziekten verbonden aan het3,4. Huid biopsie bijgedragen aan het definiëren van een nieuwe klinische entiteit: de kleine vezel neuropathie. Verschillende internationale groepen toonden de associatie tussen het verlies van intraepidermal zenuwvezels en symptomen/tekenen van kleine Fiber neuropathie5 door de huid biopsie analyse en mits gestandaardiseerde protocollen voor zenuw morphometry evenals normatieve referentiewaarden die in de klinische praktijk6,7,8moeten worden gebruikt.
Onlangs heeft een grote hoeveelheid bewijsmateriaal aangetoond dat neurodegeneratieve ziekten, gekenmerkt door misgevouwen eiwit accumulaties in het centrale zenuwstelsel, zijn multi-systeem pathologieën9. Inderdaad, PD wordt gekenmerkt door αSyn accumulatie in de Dopaminerge neuron van Substantia nigra, maar het is aangetoond dat αSyn en haar pathologische vorm, phosphorylated ΑSyn (P-αSyn), ook kan worden gedetecteerd in de perifere weefsels. Gastro-intestinale mucosa10, speekselklieren11, huid autonome vezels omringende zweetklieren en pilomotor spieren12,13,14, tonen immunoreactivity aan pathogene vormen van αSyn, in overeenstemming met de hypothese van braak dat intrigerend postulaat dat αSyn de pathologie kan in PNS goed vooraf beginnen, vóór zijn accumulatie in hersenen15. Verder, de aanwezigheid van p-αSyn is aangetoond in de huid zenuwen van patiënten met rem gedragsstoornissen die worden beschouwd als prodromal PD16,17 dus huid pathologische αSyn kan worden beschouwd als een veelbelovende vroege perifere histopathologisch marker van synucleinopathy.
De vereniging van kleine vezel neuropathie in PD is eerder aangetoond en het is gebleken dat intraepidermal zenuwvezels dichtheid weerspiegelt progressie van de ziekte18,19. Vandaar, de huid biopsie is een nuttig instrument voor het bestuderen van neurodegeneratie in PD en voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van de ziekte. Inderdaad, huid biopsie heeft een groot voordeel van een gemakkelijk toegankelijke en minimaal invasieve procedure, waardoor de analyse van het zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Ten slotte, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënten maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met progressie van de ziekte.
In ons laboratorium, het exploiteren van een dubbele immuun-kleuring met PGP 9.5 en de conformatie-specifieke monoclonal 5G4 antilichaam, dat de ziekte specifieke vormen van αSyn met inbegrip van kleine aggregaten20,21erkent, waren we in staat om aan te tonen de aanwezigheid van αSyn aggregaten in huid zenuwen met een veelbelovende hoge diagnostische efficiëntie19. Immunofluorescentie analyse van de huid biopsie in conformationele ziekten onderscheidt zich als een veelbelovende bron van biomarkers door het combineren van zowel de opsporing van eiwit aggregaten en de maatregel van de neurodegeneratie in vivo. Hierna illustreren we een eenvoudig en veelzijdig protocol over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring voor het opsporen van αSyn aggregaten. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor het richten van een andere proteïne van belang, uitgedrukt in huid PNS.
De volgende studie protocol is gebruikt om de diagnostische nut van geaggregeerde αSyn analyse in de PNS van PD door de huid biopsie19te evalueren. De criteria van de opneming voor PD waren: een welomlijnde klinische diagnose volgens de Britse kenmerkende criteria van de hersenen Bank, ziekteduur minstens 3 jaar, geen familiegeschiedenis, en geen belangrijke cognitieve stoornis of belangrijke dysautonomic symptomen in de geschiedenis. Uitsluitingscriteria waren bekende oorzaken van neuropathie (versuikerde hemoglobine, creatinine, vitamine B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, en Borreliosis). Elk onderwerp onderging aan 3 mm-diameter huid biopten bij drie anatomische plaatsen (hals bij C8 dermatomale niveau, dij 10 cm boven de knie, been 10 cm boven zij malleolus) aan de kant, die klinisch meer werd beïnvloed. In het algemeen, het volgende protocol is over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring en analyse. Vandaar kan het worden aangepast en worden gebruikt voor de opsporing van andere proteïnen van belang in huidweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd door de Cantonal ethische Commissie en alle ingeschreven onderwerpen hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven aan de studie.
1. huid biopsie collectie
- Laat een gekwalificeerde arts de huid biopsie uit te voeren in een passende klinische setting.
- Kies het gebied om de huid biopsie uit te voeren en schoon met een alcoholdoekje.
- Bereid de verdoving oplossing met 1 CC van lidocaïne 2%.
- Met de naald parallel aan het gebied, injecteren lokale anesthesie onderhuids.
- Na controle van het effect van de anesthesie, neem de 3 mm wegwerp Punch en toepassing rotatie en delicate neerwaartse druk om het te draaien naar beneden door de epidermis en dermis, totdat de onderhuidse vet is bereikt.
- Trek de punch.
- Gebruik wegwerp tang om voorzichtig Trek de huid plug-up.
- Gebruik een schaar te snijden uit de basis van het specimen op het niveau van het vetweefsel.
- Plaats het specimen in een buis met 10 mL periodate-lysine-Paraformaldehyde (PLP) fixatieve oplossing.
- Desinfecteer het gebied en bedek het met een kleefband.
2. weefsel fixatie en-opslag
- Maak verse PLP fixatieve oplossing (Zie tabel 1).
- Onmiddellijk na het verzamelen van de huid biopsie, dompel het in een buis met 10 mL PLP fixatief oplossing en Incubeer het 's nachts (O/N) bij 4 ° c.
- De dag na, onder de rook kap, verwijder de PLP fixatief voorzichtig en in dezelfde buis, was de biopsie 3 keer voor 5 min met 5 mL van 0,1 M Sorensen de oplossing (tabel 1).
- Gooi de oplossing van de Sorensen weg en broed de biopsie uit met 5 mL Cryo-beschermingsoplossing O/N bij 4 °C.
- Bewaar de biopsie bij 4 °C indien de snede met een cryotome binnen 1 week wordt uitgevoerd; Bewaar de biopsie bij-20 °C indien de snede binnen 3 maanden wordt uitgevoerd; embed de biopsie in een cryomold (stappen 3.2-3.4) en bewaar het op-80 °C om het te behouden voor een langere periode van tijd.
3. weefsel besnoeiing met een Cryotome
- Stel de cryotome bij-20 °C in.
- Neem een cryomold en vul het met de Cryo-inbedding medium. Vermijd het maken van bubbels.
- Met behulp van een pincet Dompel de biopsie in de Cryo-inbedding medium met de longitudinale as (epidermis-dermis) parallel aan de onderkant van de cryomold.
- Snap Freeze het monster met vloeibare stikstof om een stevige kubus van Cryo-inbedding medium met de biopsie in de juiste oriëntatie te verkrijgen.
- Zet het monster in de cryostat en wacht 30 minuten om de biopsie te acclimatiseren.
- Bevestig het monster op de cryostat en snijd 50 µm secties.
- Met de hulp van een kleine borstel, de overdracht van de Cryo-secties in een 96 goed plaat met 200 µ L van antivries oplossing in elk goed. Een sectie per well.
- Opslag bij-20 °C.
Opmerking: Als het analyseren van de gehele biopsie niet wordt geanalyseerd, snijd het slechts gedeeltelijk. In dit geval moeten de secties worden opgeslagen bij-20 °C en het resterende deel van de biopsie bij-80 °C om het voor een langere periode te bewaren.
4. immunofluorescentie kleuring
- Vul een 96 goed plaat, met 100 µ L van het wassen oplossing.
- Breng de te analyseren gedeelten van de opslag plaat over naar de nieuwe met de spoeloplossing. 1 sectie per elk goed (4 secties per anatomische plaats, per patiënt: gewoonlijk een totaal van 12 secties per patiënt).
- Laat de sectie in de was oplossing voor 10 min bij kamertemperatuur (RT). Breng de sectie in een ander goed met dezelfde oplossing en herhaal de wasbeurt.
- Verplaats de secties in nieuwe putten met 100 µ L van het blokkeren van oplossing en incuberen voor ten minste 90 min en voor een maximum van 4 uur bij RT.
- Verdunnen de primaire antilichamen anti-PGP 9.5 (konijn Polyclonal, 1:1000) en anti-5G4 (muis monoclonal, 1:400) in de werkende oplossing.
- Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van de werkende oplossing van de primaire antilichamen en incubeer hen O/N bij RT.
- Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min bij RT, met 100 µ L van het wassen oplossing.
- Verdunnen de secundaire antilichamen (geconjugeerd met verschillende fluorophores) geit anti-konijn op te sporen PGP 9.5 (1:700) en een geit anti-muis om 5G4 (1:700) te detecteren in de werkende oplossing.
- Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van de werkende oplossing van de secundaire antilichamen voor 90 min bij RT. Vanaf dit punt, bedek de 96 goed plaat met aluminiumfolie om het bleken van fluorophore geconjugeerd met secundaire antilichaam/IES te voorkomen.
- Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min, met 100 µ L van de het wassen oplossing.
- Breng de secties in nieuwe putten met 100 µ L van DAPI (verdund 1:5000 in PBS 1x) voor 5 min bij RT.
- Als stap 4,3, was de secties 2 keer minstens 10 min, met 100 µ L van de het wassen oplossing.
- Monteer de secties op een dia in de juiste positie vermijdend het misvouwen.
- Voeg een paar druppels van de montage medium op de glijbaan en dek af met een dekglaasje.
- Laat dia's drogen O/N alvorens de confocale/fluorescentiemicroscoop te gebruiken.
- Bewaar de dia's in een geschikte doos bij 4 °C vermijdend de lichte blootstelling. Indien nauwkeurig opgeslagen, het signaal zal zichtbaar zijn voor ongeveer 6 maanden.
Opmerking: De overdracht van een gedeelte van de 96 goed plaat met de nieuw gesneden plakjes aan de 96 goed plaat met de was-oplossing (stap 4,1) wordt uitgevoerd met behulp van een kleine borstel die helpt bij het ophalen van de biopsie. Na de overdracht van de sectie in de eerste goed, elke keer dat de slice moet worden uitgebroed met een andere oplossing, verplaats het van goed naar goed met de hulp van de borstel.
5. immunofluorescentie beeldvorming
- Bekijk secties onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een confocale Microscoop (20X, 40x of hoger vergroting, gebruik opeenvolgende frames van 2 µm stappen op een Z-stack plan voor de beste resultaten).
- Beelden te verwerven door een Microscoop aangesloten camera
-
Gebruik een adequate imaging software (dwz ImageJ) om positieve signalen te analyseren in secties in termen van ruimtelijke spreiding en de intensiteit van het signaal. Voer hiervoor de onderstaande stappen uit.
- Open het bestand met ImageJ software.
- Klik op de afbeelding > Kleur > Split kanalen om elk kleurkanaal te analyseren.
- Klik op afbeelding > stack ≫ Z-project om een samenvoeging van meerdere sectie-acquisities te verkrijgen.
- Klik op afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen om een samenvoeging van verschillende kleurkanalen van dezelfde overname te verkrijgen.
|
Antivries oplossing (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden) |
30% glycerol 30% ethyleenglycol 30% dH2O 10% 2x fosfaatbuffer |
|
Blokkerende oplossing (voorbereiden op het moment) |
4% normaal geiten serum 1% Triton X-100 in de oplossing van het wassen |
|
Cryo-Bescherm (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden) |
20% glycerol 80% Sorensen oplossing |
|
Disodium waterstof fosfaat oplossing (opslag bij RT tot 6 maanden) |
0,45 m Disodium waterstof fosfaat (Na2HPO4) in dH2O Filter in een steriele fles |
|
Lysine oplossing (opslag bij 4 °C voor maximaal 3 weken) |
50% van 0.3 M L-lysine monohydrochloride oplossing 50% van 0.1 M de oplossing van Sorensen pH 7.6 pH 7,4, filter in een steriele fles |
|
Paraformaldehyde (de) 8% (bereid onder de rook kap en op te slaan bij 4 ° c voor maximaal 1 maand) |
2,6 m in dH2O (tot 55 °C _do niet meer dan 60 °C filter in een steriele fles |
|
Fosfaatbuffer 2x (opslag bij 4 °C voor maximaal 6 maanden) |
6% mononatriumglutamaat fosfaat (NaH2PO4) oplossing 45% Disodium fosfaat (Na2HPO4) oplossing in dH2O |
|
PLP fixatief oplossing (voorbereiding op het moment, onder rook kap) |
25% Paraformaldehyde 8% 0.01 m natrium (meta) periodate 75% lysine oplossing < |
|
Natrium Dihydrogen fosfaat monohydraat (opslag bij RT tot 6 maanden) |
0.52 m natrium Dihydrogen fosfaat monohydraat (NaH2PO4 * H2O) in dH2O Filter in een steriele fles. |
|
De oplossing van Sorensen (opslag bij 4 °C voor maximaal 1 maand) |
2,5% mononatriumglutamaat fosfaat oplossing 18,7% Disodium fosfaat oplossing pH 7.6, in dH2O |
|
Wassen oplossing (voorbereiden op het moment) |
0,25 m Trizma basis 0.26) pH 7.6, in dH2O |
|
Werkende oplossing (voorbereiden op het moment) |
50% blokkerende oplossing 50% wassen oplossing |
Tabel 1: Vereiste oplossingen. Lijst van de vereiste oplossingen voor het protocol en korte beschrijving van hoe het te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naar aanleiding van de beschreven procedure (Figuur 1), we gedetecteerd αSyn aggregaten, gelabeld met 5G4 antilichaam, in dermale zenuwbundels innervating autonome structuren van PD patiënten. De morfologie van Alfa-synuclein deposito's verschijnt als een gestippelde signaal langs de axonen van de huid zenuwen (Figuur 2). Inderdaad, het exploiteren van dit protocol in 19 PD patiënten en 17 controles in de huid biopten op drie anatomische site (cervicale, dij en distale been) vonden we dat 5G4 had 81% van de gevoeligheid en 86% van de specificiteit respect voor gezonde controles en P-αSyn had 56% van de gevoeligheid en 100% van specificiteit19.
In het bijzonder vonden we 5G4 en P-αSyn positieve deposito's vooral in de zenuwen rond zweetklieren, maar ook in spier-erectus Pili, kleine vaartuigen, en subepidermal en dermale plexus, nooit in intraepidermal zenuwvezels.
Over het algemeen, binnen het lumen van de zweetklier, is het mogelijk om een niet-specifiek signaal in acht te nemen, dat als 5G4/P-αSyn positiviteit verkeerd zou kunnen worden geïnterpreteerd. Dit type van signaal is gestippeld, sferisch en het is gepast het waarschijnlijkst aan intraluminal auto-fluorescent materiaal, aangezien wij in technische controles zonder primaire en secundaire antilichamen toonden (Figuur 3). Co-lokalisatie met PGP 9.5 dat de zenuwvezels, die morfologisch zijn gloeiend en langwerpige merken, helpt bij het identificeren van het juiste signaal. Daarom is de specificiteit van 5G4 signaal sterk verhoogd met een dubbele immunokleuring met een axonale marker (Figuur 4).
Een nauwkeurige fixatie van de biopsie is een verplichte factor voor de goede kwaliteit van immunofluorescentie kleuring, en voor de betrouwbare interpretatie van de fluorescentie signalen. Als de fixatief is niet goed voorbereid of als een over-fixatie heeft plaatsgevonden, het resultaat zal een hoge auto-fluorescentie die het signaal van zenuwvezels kruising van de dermal-epidermale kruising of innervate de belangrijkste dermale structuren zal maskeren (Figuur 5 B, D, F). In dit geval, het onvermogen om correct te visualiseren van de PGP 9.5 positieve vezels zal het moeilijk maken om correct te analyseren ook 5G4.
Tot slot, dit protocol kan worden gebruikt voor de opsporing van een proteïne van belang, waaronder onder andere αSyn, P-αSyn of Tyrosine hydroxylase (TH) en vasoactieve intestinale peptide (VIP) dat merk respectievelijk adrenerge en cholinerge subtype van autonome innervatie (Figuur 6).
Figuur 1 : Schematische weergave van het protocol. Grafische weergave van kritieke stappen in de fixatie, knippen en kleuring van de huid secties voor de visualisatie van αSyn aggregaten in cutane perifere zenuwvezels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Aanwezigheid van 5G4 aggregaten in dermale zenuwvezels. Confocale samengevoegd Z-stack beelden van immunofluorescentie met PGP 9.5 (groen) en 5G4 (rood) van dermale zenuwen rond zweetklieren bij PD patiënten (A – C) en gezond onderwerp (D-F). Dit cijfer wordt gewijzigd van 19. 3D visualisatie van de zelfde zweetklier toonde hierboven van PD (G) en gezonde (H) onderwerpen. Aangegeven door witte pijlen, gele colokalisatie van de twee markers langs axonen. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Auto-fluorescerende signalen: technische controles. Confocale samengevoegd Z-stack beelden van huid sectie bevlekt met DAPI en zonder het primaire antilichaam (A-B), zonder het secundaire antilichaam (C-D), zonder primaire en secundaire antilichamen (E-F). De beelden tonen de aanwezigheid van niet-specifieke gestippelde signalen in zweetklieren structuren in alle omstandigheden. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Overweeg de morfologie van de zenuwvezels om niet-specifiek signaal te erkennen. Confocal merge Z-stack beelden van immunofluorescentie met PGP 9.5 (groen) en 5G4 (rood) van dermale zenuwen rond zweetklieren. Witte pijlen geven positieve structuren aan; sterretjes geven onspecifieke kleuring in niet-neuronale structuren. Schaalbalk = 50 µm. Dit cijfer wordt gewijzigd van referentie19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Onjuiste fixatie compromissen de kwaliteit van immunofluorescentie kleuring. Confocal merge Z-stack beelden van immunofluorescentie met PGP 9.5 (groen) en DAPI (blauw) van intra epidermale zenuwen vezels (A-B) en dermale zenuwen rond Talgklier (C-D) en zweetklieren (E-F). Op het linker resultaat van correcte bevestiging, op het juiste resultaat van over bevestiging. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Voorbeelden van andere proteïnen detecteerbaar in huid zenuwen. Microscoop beelden van dermale structuren gekleurd met behulp van een vrij zwevende immunofluorescentie assay. In rode αSyn (a), p-ΑSyn (B), en th (C), in groene VIP (D). Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een vrij zwevende immunofluorescentie assay voor huid biopten voor de diagnose van PD: het exploiteert dubbele immunokleuring met anti-PGP 9.5 antilichaam, een panaxonal marker, en anti-5G4, een conformatie specifieke antilichaam dat de geaggregeerde vorm erkent van αSyn.
De grote voordelen van huid biopsie voor diagnostische doeleinden in PD en eventueel in andere eiwit conformatie stoornissen zijn: 1) de directe toegang tot zenuwweefsel vatbaar voor ziekte door een licht invasieve techniek en dus met een verwachte betere vastberadenheid gevoeligheid voor αSyn aggregaten dan biologische vloeistoffen zoals bloed of CSF; 2) de mogelijkheid om te detecteren en te kwantificeren epidermale en autonome zenuwvezel dichtheid als een maatregel van neurodegeneratie; 3) de mogelijkheid om huid biopsie in de loop van follow-up van de zelfde patiënten te herhalen om de correlatie met ziektevooruitgang in de lengterichting te bestuderen.
Het hier voorgestelde protocol is snel, veelzijdig en heeft weinig kritische stappen. Eerst en vooral, moet de weefsel fixatie correct worden nagestreefd, anders zal een hoge auto-fluorescentie het specifieke signaal maskeren en zal de correcte analyse van de gegevens verhinderen. De Paraformaldehyde in de fixatieve oplossing moet vers worden gemaakt en pH van 7,4 moet nauwkeurig worden gecontroleerd. Het is uiterst belangrijk om de vorming van vorm zuur te vermijden dat biopten zou kunnen beschadigen. Voor opslag en besnoeiing, als de compactheid van de biopsie een onjuiste bevestiging voorstelt, zou de biopsie opnieuw met de oplossing van Sorensen moeten worden gespoeld, en opnieuw met PLP oplossing O/N bij 4 °C worden uitgebroed. Bovendien kan aan het begin of aan het einde van het immunofluorescentie-kleuring protocol een paar extra stappen worden ingevoerd om auto-fluorescentie tegen te gaan. Aan het begin van het Protocol (tussen stappen 4,1 en 4,2) een behandeling met natriumboorhydride oplossing (1 mg/mL in TBS; 3 keer voor 10 min), een behandeling met waterstofperoxide (3%; 15 min) of een behandeling met Glycine (0,1 M in TBS; 1h) kan worden uitgevoerd. In alternatief aan het einde van de kleuring (tussen de stappen 4,8 en 4,9), een behandeling met trypaanblauw blauw (250 μg/mL in TBS; 20 min) of met Soedan zwart (0,5% in 70% EtOH; 30 min) kan worden uitgevoerd. Echter, in alle gevallen, in aanvulling op de vermindering van de auto-fluorescentie, een vermindering van het specifieke signaal zal ook optreden. Alternatief, kan biopten verkeerd gefixeerd worden gebruikt om klassieke heldere gebieds Immunohistochemistry uit te voeren. In dit geval zal echter de dubbele immunokleuring voor colokalisatie van 5G4 en PGP 9.5 meer uitdagend en moeilijk te analyseren zijn.
Een andere kritieke stap is het inbrengen van een huid biopsie in de cryomold (stap 3,3). De oriëntatie van de biopsie naar het snijblad is van cruciaal belang om plakjes te verkrijgen waarin epidermis en dermis beide aanwezig zijn. De longitudinale as (epidermis-dermis) moet parallel aan de bodem van de cryomold zijn, zodat de kant van de biopsie, niet de bovenkant of de bodem, de exploitant onder ogen ziet. De keuze van de plakjes dikte, 50 µm, is in overeenstemming met de Europese richtlijnen voor het gebruik van huid biopsie als een diagnostisch instrument7. Bovendien, voor een αSyn aggregaten detectie, 50 µm dikte maakt met een grotere kans te hebben binnen de sectie meer dermale structuren, waar pathologische aanbetaling zijn voornamelijk te vinden in PD. door de hoge dikte, om zeker te zijn dat de hele sectie is geverfd, is het niet aan te raden om de secties op de dia voor kleuring, maar in plaats daarvan, een vrij zwevende kleuring is verplicht. Voor deze procedure, de grote moeilijkheid is om de delen van de ene naar de andere goed met behulp van een kleine borstel zonder beschadiging van de secties. Het wordt aanbevolen om het uiteinde van de borstel onder de biopsie die zweeft in de vloeistof, waardoor de biopsie te vestigen op het puntje van de borstel, zachtjes dragen de biopsie van de ene naar de andere goed, dompel de biopsie in de nieuwe oplossing en verwijder de borstel ervoor te zorgen dat geen biopsie residu is links op de borstel. Het is belangrijk dat de exploitant handvaardigheid te verwerven met de praktijk.
Tot slot, dit is een korte en eenvoudige protocol voor de optimale handling en TL-immunokleuring van de huid biopsie. Het voordeel van dit protocol ten aanzien van eerdere studies is het gebruik van 5G4 antilichaam, waardoor de opsporing van αSyn kleine aggregaten voor het eerst in de dermale autonome zenuwvezels van PD patiënten. Het kan potentieel worden gebruikt voor diagnostische doeleinden in verschillende soorten neurodegeneratieve aandoeningen waarbij PNS, vooral in de vroege fasen, wanneer de potentiële genezing kan het meest effectief zijn. Beperkingen van de methode is dat de gevoeligheid van P-αSyn en specificiteit van 5G4 zijn nog steeds suboptimaal, maar een combinatie van verschillende markers in toekomstige studies kan zeker verbeteren van de diagnostische opbrengst van de huid biopsie in PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Parkinson Schweiz en ABREOC (de wetenschappelijke adviesraad voor onderzoek van de Ospedaliero Cantonale) voor hun financiële steun aan deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
