Multiplexage et transfection d'ADN à haut débit à l'aide de la technologie de nanodispensation acoustique

Summary

Ce protocole décrit la transfection plasmique à haut débit des cellules de mammifères dans une plaque de 384 puits utilisant la technologie acoustique d’éjection de gouttelettes. La distribution et le multiplexage d’ADN, longs et sujets aux erreurs, mais aussi la distribution de réactifs transfection, sont pilotés par un logiciel et exécutés par un dispositif de nanodistributeur. Les cellules sont ensuite ensecées dans ces puits préremplis.

Abstract

La transfection cellulaire, indispensable pour de nombreuses études biologiques, nécessite le contrôle de nombreux paramètres pour une réalisation précise et réussie. Le plus souvent effectué à faible débit, il est d’ailleurs long et sujet aux erreurs, d’autant plus lorsque le multiplexage de plusieurs plasmides. Nous avons développé une méthode facile, rapide et précise pour effectuer la transfection cellulaire dans une mise en page de plaque de 384 puits en utilisant la technologie acoustique d’éjection de gouttelettes (ADE). Le dispositif nanodistributeur utilisé dans cette étude est basé sur cette technologie et permet une livraison précise de nanovolume à grande vitesse à partir d’une plaque de puits source à une plaque de destination. Il peut distribuer et multiplex ADN et réactif de transfection selon une feuille de calcul préconçue. Ici, nous présentons un protocole optimal pour effectuer la transfection plasmide à haut débit à base d’ADE qui permet d’atteindre une efficacité allant jusqu’à 90% et une cotransfection de près de 100% dans les expériences de cotransfection. Nous étendons le travail initial en proposant une macro basée sur une feuille de calcul conviviale, capable de gérer jusqu’à quatre plasmides/puits à partir d’une bibliothèque contenant jusqu’à 1 536 plasmides différents, et une application de guide de pipetage à base de tablettes. La macro conçoit le modèle (s) nécessaire de la plaque source et génère les fichiers prêts à l’emploi pour l’application nanodispenser et tablette. Le protocole de transfection en quatre étapes implique i) un diluant se passer d’un manipulateur liquide classique, ii) la distribution plasmide et le multiplexage, iii) un réactif de transfection distribué par le nanodispenser, et iv) le placage cellulaire sur les puits préremplis. Le contrôle logiciel décrit du multiplexage et de la transfection du plasmide ADE permet même aux non-spécialistes sur le terrain d’effectuer une transfection cellulaire fiable d’une manière rapide et sûre. Cette méthode permet d’identifier rapidement les paramètres optimaux pour un type de cellule donné et peut être transposée à des approches manuelles et à échelle supérieure. Le protocole facilite les applications, telles que la protéine ORFeome humaine (ensemble de cadres de lecture ouverts [ORFs] dans un génome) expression ou CRISPR-Cas9-basé validation de la fonction génique, dans les stratégies de dépistage non pooled.

Introduction

La méthode présentée ici décrit en détail comment effectuer le multiplexage et la transfection du plasmide de l’ADN dans les cellules de mammifères à haut débit à l’aide d’un nanodistributeur liquide à base acoustique dans une plaque de 384 puits, même pour les non-spécialistes dans le domaine. Cette méthode¹ récemment publiée permet d’exécuter jusqu’à 384 multiplesx d’ADN plasmide indépendants et des conditions de transfection dans une expérience, en moins de 1 h. Les expériences simples ou de cotransfection ont été couronnées de succès, atteignant près de 100 % cotransfection au sein de la population de cellules transfectées. Ce protocole facilite la transfection parce que la plupart des étapes fastidieuses, longues et sujettes aux erreurs sont maintenant pilotées par logiciel (voir la figure 1 pour un aperçu général). D’autres efforts ont été faits pour développer des outils dédiés pour améliorer la facilité d’utilisation tout en évitant les erreurs humaines au cours du processus global et pour promouvoir la transfection réussie, même pour les non-spécialistes dans le domaine. Le protocole décrit comprend une feuille de calcul macro « conviviale » que nous avons développée afin de gérer 384 conditions de transfection indépendantes avec des possibilités de multiplexage allant jusqu’à quatre plasmides dans chaque puits. La macro génère automatiquement des modèles de la plaque source (s) pour charger le volume plasmide de l’ADN prévu à partir de solutions de stock de départ et les fichiers nécessaires pour conduire le logiciel nanodispenser sur la conception expérimentale qui a été entré. Comme la distribution manuelle de l’ADN dans une plaque source de 384 puits est fastidieuse et sujette aux erreurs, nous avons également développé une application dédiée à la tablette pour guider l’utilisateur tout en distribuant une solution d’ADN selon le modèle.

Figure 1 : Flux de travail expérimental. Représentation schématique du protocole de transfection inverse automatisé automatisé optimal (de la conception expérimentale à l’analyse biologique personnalisée). Les étapes manuelles sont indiquées par le symbole de la main et le temps approximatif de chaque étape est écrit dans une boîte rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Beaucoup d’expériences cellulaires commencent par la transfection d’ADN plasmique, et même si de nombreux réactifs dédiés ont été et sont encore en cours de développement pour améliorer l’efficacité de la transfection et / ou faciliter la procédure, beaucoup reste à faire^{2,3 , 4}. la transfection de cellules plasmiques d’ADN implique plusieurs étapes pour atteindre l’efficacité élevée, telle qu’une prise complexe initiale, l’évasion endosomal, et le transport cytoplasmique au noyau^5,6. En plus de la précipitation de calcium ou des techniques physiques telles que l’électroporation ou la microinjection à l’aide d’appareils dédiés⁷, les méthodes chimiques modernes se sont concentrées sur l’amélioration de la livraison des cellules d’ADN tout en abaissant la cytoxicité cellulaire^{8, 9}. L’utilisation de lipides ou de polymères cationiques formant des complexes liposome-like et, plus récemment, des systèmes de chimie polymère nonliposomal a rendu la transfection plus facile et plus efficace¹⁰. Malgré ces développements, la transfection cellulaire nécessite toujours des compétences spécifiques à effectuer avec précision que la plupart de ces protocoles de transfection physique ou chimique exigent des scientifiques de préparer manuellement chaque condition de réaction de transfection de l’ADN, donc altérer le débit. Pour contourner ce problème, des protocoles de transfection inverse ont été développés à l’aide de réactifs chimiques de transfection^11,12,13, permettant à l’utilisateur de tester ou de combiner plusieurs plasmides d’une manière plus rapide. Dans ces protocoles, des complexes d’acide nucléique avec des réactifs de transfection sont formés avant d’ensemencer les cellules sur les complexes. Cependant, ces protocoles inverses sont encore limités par la manipulation manuelle des solutions d’ADN et par la combinaison de chacune des conditions indépendantes. Bien qu’il soit possible de les exécuter dans un format de plaque de 96 puits, la préparation de l’ADN et les dispenses seront fastidieuses, et il y aura probablement des erreurs. Lorsque différentes quantités de plusieurs plasmides d’ADN sont nécessaires et multiplexées les unes avec les autres, la transfection cellulaire devient encore plus difficile à réaliser et plus de temps, et les erreurs humaines deviennent tout à fait inévitables. L’extension jusqu’au format de plaque de 384 puits dans une approche de transfection inverse, en dépit de quelques conditions de transfection multiplexed d’ADN, devient un défi impossible en raison des raisons suivantes. i) Les quantités d’ADN, de réactif de transfection ou de mélange de réaction à gérer sont inférieures à 1 L pour chaque puits. ii) Le multiplexage des plasmides pour 384 conditions indépendantes devient extrêmement compliqué. La livraison dans chacun des 384 puits est également iii) très longue et iv) sujette aux erreurs. En effet, la distribution de la bonne solution dans les puits attendus est difficile à gérer car les faibles volumes déjà distribués ne permettent pas de surveiller visuellement entre les puits vides et déjà remplis. v) Enfin, il y a un risque élevé de séchage du mélange par évaporation avant l’ajout des cellules en raison du temps nécessaire pour effectuer les étapes de distribution nécessaires. En résumé, le facteur limitant pour mettre en place des tests de transfection de plasmide d’ADN à haut débit semble être la miniaturisation de l’analyse, ce qui implique un multiplexage et une gestion à faible volume qui ne peuvent plus être manipulés manuellement, mais qui ne sont pas non plus réalisables dans un manière fiable par les manipulateurs de liquides péristatiques classiques.

Comme preuve de difficulté à automatiser de tels essais et à obtenir un débit élevé, seules quelques tentatives d’automatisation de la transfection ont été publiées jusqu’à présent : un format de plaque de 96 puits à l’aide d’un dispositif commercial de manutention des liquides et des précipitations de phosphate de calcium^14. et, plus récemment, un réactif lipoplex, et une puce microfluidique permettant 280 transfections indépendantes^15, mais nécessitant des compétences spécialisées dans ce domaine. Une autre méthode, l’acoustophoresis, permettant la lévitation liquide et conduisant à la manipulation et au mélange de fluides, a été employée pour effectuer la transfection d’ADN dans les formats de plaque de 24 à 96 puits^16. Bien que faisable, cette approche souffre d’un débit extrêmement faible car le mélange des cellules avec le mélange de transfection d’ADN nécessite une incubation de 60 s pour chaque point avant l’ensemencement. Cela implique une durée d’au moins 96 min pour une plaque complète de 96 puits. En outre, ce protocole est loin d’être favorable à l’audience globale des biologistes puisque ce travail a été fait avec un dispositif interne conçu et fabriqué qui n’est actuellement pas disponible sur le marché. Au contraire, au cours des dernières années, une technologie de distribution acoustique facile à utiliser par logiciel a vu le jour avec des distributeurs de nanovolume. Utilisant l’énergie acoustique focalisée, ces dispositifs permettent l’éjection étroitement contrôlée de petits volumes liquides de 2.5 nL à 500 nL d’une plaque source à une destination¹⁷. Cette technologie, appelée éjection acoustique de gouttelettes (ADE), présente de nombreux avantages : elle est entièrement automatisée, sans contact, sans pointe, précise, précise et hautement reproductible, et elle a un débit élevé¹⁸. D’abord consacré à la livraison de solutions de sulfoxide de diméthyle (DMSO), les paramètres ont été améliorés pour distribuer des tampons aqueux¹⁹. Les nanodistributeurs acoustiques semblent donc adaptés aux protocoles de transfection des cellules inversées et pourraient contourner la plupart des limitations manuelles mentionnées ci-dessus. Comme aucune tentative de transfection plasmique n’a été précédemment décrite à l’aide de cette technologie, nous avons récemment évalué la pertinence d’un système de distribution acoustique pour effectuer la transfection des cellules inversées.

Profitant du débit nanodispenser et de la facilité d’utilisation, nous avons optimisé un protocole de transfection inverse pour les cellules HeLa en testant plusieurs paramètres qui peuvent influencer la transfection de l’ADN sur une plaque unique de 384 puits, à savoir la quantité totale d’ADN et concentration de départ de l’ADN source, volume diluant, réactif de transfection, et nombre de cellules de propagation. Le protocole développé contourne les limites manuelles décrites ci-dessus de la transfection cellulaire et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres tentatives de transfection automatisées. Tout d’abord, il est miniaturisé, permettant ainsi un réactif de transfection rentable en économisant les préparations de plasmide d’ADN et le réactif de transfection. Deuxièmement, il est beaucoup plus haut débit et reproductible que le protocole manuel (même pour les débutants), comme la transfection d’une plaque entière de 384 puits peut être atteint en moins de 1 h. Enfin, il est piloté par un logiciel, permettant le contrôle de la quantité d’ADN distribué et le multiplexage de plusieurs plasmides. En effet, grâce au logiciel nanodispenser (Tableaudes Matériaux),l’utilisateur peut élaborer un plan d’étude pour contrôler les volumes à distribuer à partir d’une plaque de puits de source définie à une plaque de destination.

Le protocole présenté ici est principalement destiné à ceux qui ont accès à un nanodispenser et qui souhaitent mettre en place des expériences de transfection à haut débit, mais aussi pour ceux qui veulent optimiser rapidement leurs paramètres de transfection pour un type de cellule donné par l’application de ce protocole pour contre-vérifier plusieurs paramètres à haut débit. En effet, nous avons montré que les paramètres optimisés identifiés avec ce protocole à l’échelle nanométrique peuvent être transposés à des expériences de transfection manuelles et à plus grande échelle. Enfin, comme le réactif de transfection utilisé dans le protocole actuel permet la transfection d’ADN ou de siRNA selon le fabricant, le protocole est également d’intérêt pour ceux qui visent à effectuer des approches de tableau pour la surexpression ou le knockdown de gène. Les plaques de destination préremplies d’ADN peuvent être conservées jusqu’à 7 jours avant utilisation dans un test de transfection sans perte d’efficacité, ce qui est un autre avantage du protocole suivant pour ce type d’application.

Protocol

1. Préparations préalables Préparation des programmes de manutention de liquides péristaltiquesREMARQUE : Pour les étapes de diluant et de distribution cellulaire du protocole, un programme dédié doit être préparé, en tenant compte de la hauteur de la tête distributrice à la plaque utilisée et de l’intention d’étape. Pour l’étape de distribution de diluant de 1 l,l, montez une cassette de 1 L et préparez un programme avec les paramètres décrits dans les étapes 1.1…

Representative Results

fAfin de déterminer si la technologie ADE pourrait être utilisée pour un protocole automatisé de transfection inverse, nous avons surveillé l’efficacité de la transfection cellulaire par microscopie fluorescence, à l’aide d’un tdTomato fluorescent rouge exprimant plasmide. D’abord visant à déterminer les meilleurs paramètres de transfection, différents volumes de diluants et quantités totales d’ADN ont été testés. Le volume diluant a été utilisé pour permettre aux goutte…

Discussion

L’établissement et l’optimisation d’une méthode précise de transfection à haut débit pour une lignée cellulaire donnée exigent des scientifiques qu’ils suivent certains paramètres clés décrits dans cette section. Nous encourageons fortement en commençant par les valeurs recommandées tout au long du protocole que ces paramètres optimisés pour les cellules HeLa s’est également avéré efficace pour les cellules HEK. Cependant, comme les meilleurs paramètres peuvent dépendre des lignées cellulaires et des …

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter