High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Durchsatz-Plasmidtransfektion von Säugetierzellen in einer 384-Well-Platte mit akustischer Tröpfchenauswurftechnologie. Die zeitaufwändige, fehleranfällige DNA-Dosierung und Multiplexing, aber auch die Transfektionsreagenz-Dosierung, sind softwaregesteuert und werden von einem Nanospenderdurchgeführt ausgeführt. Die Zellen werden dann in diesen vorgefüllten Brunnen gesät.

Abstract

Die Zelltransfektion, die für viele biologische Studien unverzichtbar ist, erfordert die Kontrolle vieler Parameter für eine genaue und erfolgreiche Leistung. Am häufigsten bei geringem Durchsatz durchgeführt, ist es darüber hinaus zeitaufwändig und fehleranfällig, noch mehr beim Multiplexing mehrerer Plasmide. Wir haben eine einfache, schnelle und genaue Methode entwickelt, um die Zelltransfektion in einem 384-Well-Plattenlayout mit akustischer Droplet-Auswurf-Technologie (ADE) durchzuführen. Das in dieser Studie verwendete Nanodispenser-Gerät basiert auf dieser Technologie und ermöglicht eine präzise Nanovolumenabgabe bei hoher Geschwindigkeit von einer Quellbrunnenplatte zu einem Ziel. Es kann nach einer vorgefertigten Kalkulationstabelle DNA- und Transfektionsreagenz abgeben und multiplexieren. Hier präsentieren wir ein optimales Protokoll zur Durchführung einer ADE-basierten Hochdurchsatz-Plasmidtransfektion, die es ermöglicht, einen Wirkungsgrad von bis zu 90% und eine fast 100% Kotransfektion in Kotransfektionsexperimenten zu erreichen. Wir erweitern die anfängliche Arbeit, indem wir ein benutzerfreundliches, auf Tabellenkalkulationen basierendes Makro vorschlagen, das in der Lage ist, bis zu vier Plasmide/Brunnen aus einer Bibliothek mit bis zu 1.536 verschiedenen Plasmiden und eine Tablett-basierte Pipettieranleitung zu verwalten. Das Makro entwirft die erforderlichen Schablonen der/die Quellplatte(n) und generiert die gebrauchsfertigen Dateien für die Nanospender- und Tablet-basierte Anwendung. Das vierstufige Transfektionsprotokoll beinhaltet i) eine Verdünnungsmittelabgabe mit einem klassischen Flüssigkeitshandler, ii) Plasmidverteilung und Multiplexing, iii) eine transfektionspflichtige Reagenz, die vom Nanospender abgegeben wird, und iv) Zellbeschichtung auf den vorgefüllten Brunnen. Die beschriebene softwarebasierte Steuerung von ADE-Plasmidmultiplexing und -transfektion ermöglicht es auch Nicht-Spezialisten auf dem Gebiet, eine zuverlässige Zelltransfektion schnell und sicher durchzuführen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Identifizierung optimaler Einstellungen für einen bestimmten Zelltyp und kann auf höherskalige und manuelle Ansätze übertragen werden. Das Protokoll erleichtert Anwendungen, wie z. B. menschliches ORFeome-Protein (Satz offener Leserahmen [ORFs] in einem Genom) oder CRISPR-Cas9-basierte Genfunktionsvalidierung, in nicht gepoolten Screening-Strategien.

Introduction

Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie DNA-Plasmidmultiplexing und -transfektion in Säugetierzellen bei hohem Durchsatz mit einem akustischen flüssigen Nanospender in einer 384-Well-Platte durchgeführt werden kann, selbst für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet. Diese kürzlich veröffentlichte Methode¹ ermöglicht die Durchführung von bis zu 384 unabhängigen Plasmid-DNA-Multiplex- und Transfektionsbedingungen in einem Experiment in weniger als 1 h. Einzel- oder Kotransfektionsexperimente waren erfolgreich und erreichten fast 100 % Kotransfektion innerhalb der Population der transfizierten Zellen. Dieses Protokoll erleichtert die Transfektion, da die meisten mühsamen, zeitaufwändigen und fehleranfälligen Schritte jetzt softwaregesteuert sind (eine allgemeine Übersicht siehe Abbildung 1). Es wurden weitere Anstrengungen unternommen, um spezielle Instrumente zu entwickeln, um die Benutzerfreundlichkeit zu verbessern und menschliche Fehler während des gesamten Prozesses zu vermeiden und eine erfolgreiche Transfektion auch für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet zu fördern. Das beschriebene Protokoll enthält eine “benutzerfreundliche” Makrotabelle, die wir entwickelt haben, um 384 unabhängige Transfektionsbedingungen mit Multiplexing-Möglichkeiten von bis zu vier Plasmiden in jedem Brunnen zu verwalten. Das Makro generiert automatisch Vorlagen der Quellplatte(n), um das erwartete DNA-Plasmidvolumen vom Start von Bestandslösungen und die Dateien zu laden, die erforderlich sind, um die Nanodispenser-Software nach dem eingegebenen experimentellen Design anzutreiben. Da die manuelle Abgabe von DNA in einer 384-Well-Quellplatte mühsam und fehleranfällig ist, haben wir auch eine spezielle Tablet-basierte Anwendung entwickelt, um den Benutzer zu führen und gleichzeitig dna-Lösung entsprechend der Vorlage zu dosieren.

Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Schematische Darstellung des optimalen automatisierten Hochdurchsatz-Reverse-Transfektionsprotokolls (vom experimentellen Design bis zum benutzerdefinierten biologischen Assay). Manuelle Schritte werden durch das Handsymbol angezeigt und die ungefähre Zeit für jeden Schritt ist in ein rotes Feld geschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Viele zellbasierte Experimente beginnen mit der Plasmid-DNA-Transfektion, und selbst wenn viele dedizierte Reagenzien entwickelt wurden und werden, um die Transfektionseffizienz zu verbessern und/oder das Verfahren zu erleichtern, bleibt noch viel zu tun^{2,3 , 4}. DNA-Plasmid-Zell-Transfektion umfasst mehrere Schritte, um eine hohe Effizienz zu erreichen, wie eine anfängliche komplexe Aufnahme, endosomale Flucht und zytoplasmatischen Transport zum Kern^5,6. Neben Kalziumfällung oder physikalischen Techniken wie Elektroporation oder Mikroinjektion mit speziellen Geräten⁷haben sich moderne chemische Methoden auf die Verbesserung der DNA-Zell-Entbindung konzentriert und gleichzeitig die Zellzytoxizität^{gesenkt 8, 9}. Die Verwendung von Lipiden oder kationischen Polymeren, die liposomeähnliche Komplexe bilden, und in jüngerer Zeit nichtliposomaler polymerer Chemiesysteme hat die Transfektion einfacher und effizienter gemacht¹⁰. Trotz dieser Entwicklungen erfordert die Zelltransfektion immer noch spezifische Fähigkeiten, die genau ausgeführt werden müssen, da die meisten dieser physikalischen oder chemischen Transfektionsprotokolle von Wissenschaftlern verlangen, jeden DNA-Transfektionsreaktionszustand manuell vorzubereiten. den Durchsatz zu beeinträchtigen. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Reverse-Transfektionsprotokolle mit chemischen Transfektionsreagenzien^11,12,13entwickelt, die es dem Anwender ermöglichen, mehrere Plasmide schneller zu testen oder zu kombinieren. In diesen Protokollen werden Nukleinsäurekomplexe mit Transfektionsreagenzien gebildet, bevor die Zellen auf den Komplexen gesät werden. Diese Reverse-Protokolle sind jedoch nach wie vor durch den manuellen Umgang mit DNA-Lösungen und durch die Kombination der einzelnen unabhängigen Bedingungen begrenzt. Obwohl es machbar ist, sie in einem 96-Well-Plattenformat durchzuführen, wird die DNA-Vorbereitung und die Abgabe mühsam sein, und es wird wahrscheinlich Fehler geben. Wenn unterschiedliche Mengen von mehreren DNA-Plasmiden erforderlich und miteinander multiplexiert werden, wird die Zelltransfektion noch schwieriger zu erreichen und zeitaufwändiger, und menschliche Fehler werden unvermeidlich. Die Skalierung auf das 384-Well-Plattenformat in einem umgekehrten Transfektionsansatz wird trotz weniger multiplexierter DNA-Transfektionsbedingungen aus folgenden Gründen zu einer unmöglichen Herausforderung. i) Die zu verwaltenden DNA-Mengen, Transfektionsreagenz oder Reaktionsgemischvolumina sind für jeden Brunnen weniger als 1 L. ii) Das Multiplexing von Plasmiden für 384 unabhängige Erkrankungen wird extrem kompliziert. Die Lieferung in jeder der 384 Brunnen ist auch iii) sehr zeitaufwändig und iv) fehleranfällig. Tatsächlich ist es schwierig, die richtige Lösung in den erwarteten Brunnen zu verteilen, da die bereits ausgegebenen geringen Volumina keine visuelle Überwachung zwischen den leeren und bereits gefüllten Brunnen ermöglichen. v) Schließlich besteht ein hohes Risiko, das Gemisch durch Verdunstung zu trocknen, bevor die Zellen hinzugefügt werden, da die für die Durchführung der erforderlichen Dosierschritte erforderlichen Zeit benötigt wird. Zusammenfassend scheint der begrenzende Faktor für die Einrichtung von DNA-Plasmid-Transfektions-Assays mit hohem Durchsatz die Miniaturisierung des Assays zu sein, was ein Low-Volume-Multiplexing und -Management impliziert, das nicht mehr manuell behandelt werden kann, aber auch in einem zuverlässigen Weg durch klassische peristatische Flüssigkeitshandler.

Als Beweis für die Schwierigkeit, solche Tests zu automatisieren und einen hohen Durchsatz zu erzielen, wurden bisher nur wenige Versuche zur Automatisierung der Transfektion veröffentlicht: ein 96-Well-Plattenformat mit einem kommerziellen Flüssigkeitshandhabungsgerät und Calciumphosphatniederschlag¹⁴ und in jüngerer Zeit ein Lipoplex-Reagenz und ein mikrofluidischer Chip, der 280 unabhängige Transfektionen¹⁵ ermöglicht, aber spezielle Fähigkeiten in diesem Bereich erfordert. Eine andere Methode, die Acoustophorese, die eine Flüssigkeitsschwebe ermöglicht und zu Flüssigkeitsmanipulation und -mischung führt, wurde verwendet, um DNA-Transfektion in 24- bis 96-Well-Plattenformaten¹⁶durchzuführen. Obwohl dieser Ansatz machbar ist, leidet er unter einem extrem niedrigen Durchsatz, da das Mischen von Zellen mit DNA-Transfektionsgemisch eine Inkubation von 60 s für jeden einzelnen Punkt vor der Aussaat erfordert. Dies bedeutet eine Dauer von mindestens 96 min für eine komplette 96-Well-Platte. Darüber hinaus ist dieses Protokoll weit davon entfernt, dem Publikum der Biologen zugänglich zu sein, da diese Arbeit mit einem eigens entwickelten und hergestellten Gerät durchgeführt wurde, das derzeit nicht auf dem Markt erhältlich ist. Im Gegenteil, in den letzten Jahren ist mit Nanovolumen-Dispenser-Geräten eine einfach zu bedienende softwaregesteuerte akustische Dosiertechnologie entstanden. Mit fokussierter akustischer Energie ermöglichen diese Geräte den streng kontrollierten Auswurf kleiner Flüssigkeitsvolumina von 2,5 nL bis 500 nL von einer Quellplatte zu einem Ziel¹⁷. Diese Technologie, die als akustischer Tröpfchenauswurf (ADE) bezeichnet wird, hat zahlreiche Vorteile: Sie ist vollautomatisiert, berührungslos, spitzenlos, präzise, präzise und hoch reproduzierbar und hat einen hohen Durchsatz^{von 18}. Zuerst für die Lieferung von Dimethylsulfoxid (DMSO) Lösungen gewidmet, wurden die Einstellungen verbessert, um wässrige Puffer zu verteilen¹⁹. Akustische Nanospender scheinen daher für Reverse-Zell-Transfektionsprotokolle geeignet zu sein und könnten die meisten der oben genannten manuellen Einschränkungen umgehen. Da bisher keine Plasmidtransfektionsversuche mit dieser Technologie beschrieben wurden, haben wir kürzlich die Eignung eines akustischen Dosiersystems für die Durchführung von Reverse-Zell-Transfektionen bewertet.

Unter Ausnutzung des Nanodispensers-Durchsatzes und der Benutzerfreundlichkeit optimierten wir ein Reverse-Transfektionsprotokoll für HeLa-Zellen, indem wir mehrere Parameter kreuztesten, die die DNA-Transfektion auf einer 384-Well-Einzelplatte beeinflussen können, nämlich die gesamte DNA-Menge und Dna-Ausgangskonzentration, Verdünnungsvolumen, Transfektionsreagenz und Anzahl der Streuzellen. Das entwickelte Protokoll umgeht die oben beschriebenen manuellen Einschränkungen der Zelltransfektion und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen automatisierten Transfektionsversuchen. Erstens wird es miniaturisiert, wodurch ein kostengünstiges Transfektionsreagenz durch Speichern von DNA-Plasmidpräparaten und Transfektionsreagenz ermöglicht wird. Zweitens ist es viel mehr durchsatzfähig und reproduzierbar als das manuelle Protokoll (auch für Anfänger), da die Transfektion einer ganzen 384-Well-Platte in weniger als 1 h erreicht werden kann. Schließlich ist es softwaregesteuert, so dass die Kontrolle der abgegebenen DNA-Menge und die Multiplexing von mehreren Plasmiden. Dank der Nanodispenser-Software (Table of Materials) kann der Anwender einen Studienplan ausarbeiten, um die Volumina zu steuern, die von einer definierten Quellbrunnenplatte zu einem Zielschild abgegeben werden sollen.

Das hier vorgestellte Protokoll richtet sich vor allem an diejenigen, die Zugang zu einem Nanospender haben und Transfektionsexperimente mit hohem Durchsatz einrichten möchten, aber auch für diejenigen, die ihre Transfektionsparameter für einen bestimmten Zelltyp schnell optimieren möchten, Anwendung dieses Protokolls, um mehrere Parameter bei hohem Durchsatz zu kreuztesten. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass optimierte Parameter, die mit diesem nanoskaligen Protokoll identifiziert wurden, auf größere und manuelle Transfektionsexperimente übertragen werden können. Da das im vorliegenden Protokoll verwendete Transfektionsreagenz dna- oder siRNA-Transfektion nach Angaben des Herstellers zulässt, ist das Protokoll auch für diejenigen von Interesse, die Array-Ansätze für Genüberexpression oder Knockdown durchführen wollen. Die mit DNA vorgefüllten Zielplatten können bis zu 7 Tage vor der Anwendung in einem Transfektionstest ohne Wirksamkeitsverlust konserviert werden, was ein weiterer Vorteil des folgenden Protokolls für diese Art der Anwendung ist.

Protocol

1. Vorarbeiten Vorbereitung der peristaltischen FlüssigkeitshandlerprogrammeHINWEIS: Für die Verdünnungs- und Zelldosierschritte des Protokolls muss ein spezielles Programm vorbereitet werden, das die Höhe des Dosierkopfes an der verwendeten Platte und die Schrittabsicht berücksichtigt. Montieren Sie für den Verdünnungsgang 1 l eine 1-L-Kassette und bereiten Sie ein Programm mit den Einstellungen gemäß den Schritten 1.1.1.1 und 1.1.1.2 vor. Passen Sie den Durchfluss…

Representative Results

fUm festzustellen, ob die ADE-Technologie für ein automatisiertes Reverse-Transfektionsprotokoll verwendet werden könnte, überwachten wir die Effizienz der Zelltransfektion durch Fluoreszenzmikroskopie, indem wir ein rotes fluoreszierendes tdTomato-exzierendes Plasmid verwendeten. Zunächst wurden die besten Transfektionsparameter ermittelt, verschiedene Verdünnungsvolumina und Gesamtmengen an DNA wurden kreuzgetestet. Das Verdünnungsvolumen wurde verwendet, um die nach der Abgabe ve…

Discussion

Die Etablierung und Optimierung einer genauen Transfektionsmethode mit hohem Durchsatz für eine bestimmte Zelllinie erfordert, dass die Wissenschaftler einige wichtige Parameter befolgen, die in diesem Abschnitt beschrieben werden. Wir empfehlen dringend, mit den empfohlenen Werten im gesamten Protokoll zu beginnen, da sich diese für HeLa-Zellen optimierten Einstellungen auch für HEK-Zellen als effizient erwiesen haben. Da jedoch die besten Parameter von den Zelllinien und Transfektionsreagenzien abhängen können, k?…

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter