Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

High-gennemløb DNA plasmid multiplexing og Transfection ved hjælp af akustisk Nanodispenserings teknologi

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Denne protokol beskriver højgennemløb plasmid transfektering af pattedyrsceller i en 384-brønd plade ved hjælp af akustisk dråbe udslyngning teknologi. Den tidskrævende, fejlbehæftede DNA dispensering og multiplexing, men også transfektering reagens dispensering, er software-drevet og udført af en nanodispenser enhed. Cellerne er derefter seedede i disse fyldte brønde.

Abstract

Celle transfection, uundværlig for mange biologiske undersøgelser, kræver kontrol af mange parametre for en nøjagtig og vellykket præstation. Oftest udføres ved lav gennemløb, det er desuden tidskrævende og fejl-tilbøjelige, endnu mere, når multiplexing flere plasmider. Vi udviklede en nem, hurtig og præcis metode til at udføre celle transfektering i en 384-brønd plade layout ved hjælp af akustisk dråbe udslyngning (ade) teknologi. Nanodispenser anordningen, der anvendes i dette studie, er baseret på denne teknologi og muliggør præcis nanovolume-levering ved høj hastighed fra en kilde brønd plade til en destination. Det kan dispensere og multiplex DNA og transfektering reagens i henhold til en foruddesignet regneark. Her præsenterer vi en optimal protokol til at udføre ade-baseret High-gennemløb plasmid transfektering, som gør det muligt at nå en effektivitet på op til 90% og en næsten 100% cotransfection i cotransfection eksperimenter. Vi udvider det indledende arbejde ved at foreslå en brugervenlig regnearks baseret makro, der kan administrere op til fire plasmid'er/brønde fra et bibliotek, som indeholder op til 1.536 forskellige plasmider, og en tablet-baseret pipette Rings guide applikation. Makroen udformer de (t) nødvendige skabelon (r) af kilde pladen (e) og genererer de filer, som er klar til brug, til nanodispenser-og tablet-baseret applikation. Transfektering-protokollen med fire trin involverer i) et fortyndingsmiddel med en klassisk væske handler, II) plasmid-distribution og multiplexing, III) en transfektering-reagens dispensering fra nanodispenseren og IV) celle plating på de fyldte brønde. Den beskrevne software-baseret kontrol af ade plasmid multiplexing og transfektering giver selv ikke-specialister i marken til at udføre en pålidelig celle transfektering på en hurtig og sikker måde. Denne metode muliggør hurtig identifikation af optimale indstillinger for en given celletype og kan overføres til højere og manuelle tilgange. Protokollen letter applikationer, såsom humant ORFeome protein (sæt af åbne læse rammer [Orf'er] i et genom) udtryk eller CRISPR-Cas9-baseret genfunktion validering, i ikke-poolet screening strategier.

Introduction

Den metode, der præsenteres her, beskriver i detaljer, hvordan man udfører DNA plasmid multiplexing og transfektering i pattedyrsceller ved høj gennemløb ved hjælp af en akustisk baseret flydende nanodispenser i en 384-brønd plade, selv for ikke-specialister i marken. Denne nyligt offentliggjorte metode1 giver mulighed for at udføre så meget som 384 uafhængige plasmid DNA multiplexing og transfektering betingelser i et eksperiment, i mindre end 1 h. enkelt-eller cotransfection eksperimenter var vellykkede, nåede en nær 100% cotransfection i populationen af transficeret celler. Denne protokol gør transfektering lettere, fordi de fleste af de kedelige, tidskrævende og fejlbehæftede trin nu er software drevet (Se figur 1 for en generel oversigt). Der er gjort en yderligere indsats for at udvikle dedikerede værktøjer til at øge brugervenligheden og samtidig undgå menneskelige fejl under den samlede proces og for at fremme en vellykket transfektering selv for ikke-specialister på området. Den beskrevne protokol indeholder et "brugervenligt" makro regneark, som vi har udviklet for at administrere 384 uafhængige transfektering betingelser med multiplexing muligheder på op til fire plasmider i hver brønd. Makroen genererer automatisk skabeloner af kilde pladen (e) for at indlæse det forventede DNA-plasmid-volumen fra startlager løsninger og de filer, der kræves for at drive nanodispenser softwaren på det eksperimentelle design, der er blevet indtastet. Da den manuelle udlevering af DNA i en 384-brønd kilde plade er kedelig og fejlbehæftet, har vi også udviklet en dedikeret tablet-baseret applikation til at vejlede brugeren, mens udlevering DNA-løsning i henhold til skabelonen.

Figure 1
Figur 1: eksperimentel arbejdsgang. Skematisk gengivelse af den optimale automatiserede High-gennemløb reverse transfektering protokol (fra eksperimentel design til brugerdefineret biologisk assay). Manuelle trin angives med håndsymbolet, og det omtrentlige tidspunkt for hvert trin skrives i en rød boks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mange celle-baserede eksperimenter starter med plasmid DNA transfektering, og selv om mange dedikerede reagenser har været og stadig er under udvikling for at forbedre transfektering effektivitet og/eller lette proceduren, meget er stadig at gøre2,3 , 4. DNA plasmid celle transfektering involverer flere trin for at nå høj effektivitet, såsom en indledende kompleks optagelse, endosomal flugt, og cytoplasmisk transport til kernen5,6. Ud over calcium udfældning eller fysiske teknikker såsom elektroporation eller mikroinjektion ved hjælp af dedikerede anordninger7, moderne kemiske metoder har fokuseret på at forbedre DNA-celle levering samtidig sænke celle cytoksicitet8, 9. Brugen af lipider eller kationiske polymerer danner liposome-lignende komplekser og, for nylig, nonliposomale polymere kemi systemer har gjort transfektering lettere og mere effektiv10. På trods af denne udvikling kræver celle transfektering stadig specifikke færdigheder, der skal udføres nøjagtigt, da de fleste af disse fysiske eller kemiske transfektering protokoller kræver forskerne til manuelt at forberede hver DNA transfektering reaktion tilstand, således forringe dataoverførselshastigheden. For at omgå dette problem, er reverse transfektering protokoller udviklet ved hjælp af kemiske transfektering reagenser11,12,13, gør det muligt for brugeren at teste eller kombinere flere plasmider på en hurtigere måde. I disse protokoller dannes nukleinsyre komplekser med transfektering reagenser før såning af cellerne på komplekserne. Men disse omvendte protokoller er stadig begrænset af manuel håndtering af DNA-løsninger og ved kombinationen af hver af de uafhængige betingelser. Selv om det er muligt at udføre dem i en 96-brønd plade format, vil DNA forberedelse og dispenser være kedelig, og der vil sandsynligvis være fejl. Når forskellige mængder af flere DNA-plasmider er nødvendige og multiplexed med hinanden, celle transfektering bliver endnu sværere at opnå og mere tidskrævende, og menneskelige fejl bliver helt uundgåelig. Skalering op til 384-brønd plade format i en omvendt transfektering tilgang, på trods af få multiplexed DNA transfektering betingelser, bliver en umulig udfordring på grund af følgende grunde. i) de DNA-mængder, transfektering-reagens eller reaktions blandings volumener, der skal administreres, er lavere end 1 μl for hver brønd. II) multiplexing af plasmider for 384 uafhængige betingelser bliver yderst kompliceret. Leveringen i hver af de 384 brønde er også III) meget tidskrævende og IV) fejl-tilbøjelige. Faktisk er dispensering den rigtige løsning i de forventede brønde er svært at styre, fordi de lave mængder, der allerede dispenseret ikke tillader visuel overvågning mellem de tomme og allerede fyldte brønde. v) Endelig er der en høj risiko for at tørre blandingen ved fordampning, før cellerne tilsættes på grund af den tid, der er nødvendig for at udføre de nødvendige dispenserings trin. Kort sagt synes den begrænsende faktor at opsætte DNA plasmid transfektering-assays med høj gennemløb at være miniaturiseringen af analysen, hvilket indebærer, at multiplexing med lav lydstyrke og styring, der ikke kan håndteres manuelt længere, men som heller ikke er opnåeligt i en pålidelig måde af klassiske peristatiske væske handlere.

Som et bevis på vanskeligheder med at automatisere sådanne assays og få høj gennemløb, er kun et par forsøg på at automatisere transfektering blevet offentliggjort indtil videre: en 96-brønd plade format ved hjælp af en kommerciel væske håndterings anordning og calciumphosphat nedbør14 og, for nylig, en lipoplex reagens, og en mikrofluidisk chip muliggør 280 uafhængige transfections15 men kræver specialiserede færdigheder på dette område. En anden metode, acoustophoresis, der tillod flydende levitation og førte til flydende manipulation og blanding, blev brugt til at udføre DNA-transfektering i 24-til 96-brønd plade formater16. Selv om det er muligt, lider denne tilgang af en ekstremt lav gennemløb, da blandingen af celler med DNA-transfektering blanding kræver en 60 s inkubation for hvert enkelt punkt før såning. Dette indebærer en varighed på mindst 96 min for en komplet 96-brønd plade. Desuden er denne protokol langt fra at være modtagelig for det samlede biologer publikum, da dette arbejde blev udført med en in-House konstrueret og fremstillet udstyr, som i øjeblikket ikke er tilgængelig på markedet. Tværtimod, i de sidste par år, en nem at bruge software-drevet akustisk-baserede dispenserings teknologi er dukket op med nanovolume dispenser anordninger. Ved hjælp af fokuseret akustisk energi, tillader disse enheder den stramt kontrollerede udslyngning af små væskevolumener fra 2,5 nL til 500 nL fra en kilde plade til en destination en17. Denne teknologi, kaldet akustisk dråbe udslyngning (ade), har talrige fordele: det er fuldt automatiseret, kontaktløs, tipless, præcis, præcis og meget reproducerbar, og det har en høj gennemstrømning18. Først afsat til levering af dimethylsulfoxid (DMSO)-opløsninger, er indstillingerne blevet forbedret for at dispensere vandig buffer19. Akustiske nanodispensere virker så velegnede til omvendte celle transfektering protokoller og kan omgå de fleste af de ovennævnte manuelle begrænsninger. Da ingen plasmid transfektering forsøg tidligere blev beskrevet ved hjælp af denne teknologi, vi for nylig evalueret egnetheden af en akustisk baseret Dispenseringssystem til at udføre reverse celle transfektering.

Ved at udnytte nanodispenserens gennemløb og brugervenlighed optimerede vi en reverse transfektering-protokol for Hela-celler ved at kryds teste flere parametre, der kan påvirke DNA-transfektering på en 384-brønd, enkelt plade, nemlig det totale DNA-beløb og kilde-DNA-startkoncentration, fortyndingsvolumen, transfektering reagens og antal spredte celler. Den udviklede protokol omgår de ovenfor beskrevne manuelle begrænsninger af celle transfektering og præsenterer flere fordele i forhold til andre automatiserede transfektering forsøg. For det første er det miniaturiseret, hvilket giver mulighed for omkostningseffektiv transfektering reagens ved at gemme DNA plasmid præparater og transfektering reagens. For det andet er det langt mere højt gennemløb og reproducerbar end den manuelle protokol (selv for begyndere), som transfektering af en hel 384-brønd plade kan opnås på mindre end 1 h. Endelig er det software-drevet, der tillader kontrol af den dispenserede DNA-mængde og multiplexing af flere plasmider. Faktisk, takket være nanodispenser software (tabel over materialer), kan brugeren udarbejde en undersøgelse plan for at kontrollere de mængder, der skal udleveres fra en bestemt kilde brønd plade til en destination en.

Protokollen præsenteres her er primært beregnet til dem, der har adgang til en nanodispenser og vil gerne oprette transfektering eksperimenter ved høj gennemløb, men også for dem, der ønsker hurtigt at optimere deres transfektering parametre for en given celletype ved anvendelse af denne protokol til at kryds teste flere parametre ved høj gennemløb. Vi har faktisk vist, at optimerede parametre, der er identificeret med denne nanoskala-protokol, kan overføres til større og manuelle transfektering eksperimenter. Da det transfektering reagens, der anvendes i denne protokol, tillader DNA eller siRNA-transfektering ifølge producenten, er protokollen også af interesse for dem, der har til formål at udføre array-tilgange til genekspression eller Knockdown. Destinations pladerne fyldt med DNA kan bevares i op til 7 dage før brug i en transfektering analyse uden tab af effekt, hvilket er en anden fordel ved følgende protokol for denne form for anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af forskud

  1. Forberedelse af de peristaltiske væske håndterings programmer
    Bemærk: i forbindelse med protokollens fortyndings trin og celle dispensering skal der forberedes et dedikeret program under hensyntagen til højden af dispenserings hovedet til den anvendte plade og den trinvise hensigt.
    1. For det 1 μL fortynder dispenserings trin skal du montere en 1 μL kassette og forberede et program med indstillingerne som beskrevet i trin 1.1.1.1 og 1.1.1.2.
      1. Juster flowrate parameteren til høj for den bedste gennemstrømning, da der ikke forventes nogen biologisk materialeskade i dette trin. Juster dispenserings højden til 9,6 mm (ifølge den anvendte cellekultur plade, supplerende figur 1) for at tillade, at 1 μl dråbe rører bunden af brøndene under uddeling.
        Bemærk: dette trin er afgørende for at undgå tilbageholdelse af dråberne på dispenserings hovedet, indtil de når et tilstrækkeligt volumen til at falde.
      2. Juster pladen klar højde til 14,4 mm for at tillade en fri forskydning af dispenserings hovedet over pladen efter dispensering af hver række. Kontroller visuelt de korrekte indstillinger for den peristaltiske væske håndterings hovedhøjde: Sørg for, at der ikke er nogen dråber tilbage på dispenserings spidserne, mens du dispener, og kontroller, at hovedet er højt nok til, at hovedet kan forryres efter udløbet af hver række.
        Bemærk: undgåelse af drop retention er en afgørende parameter, da det vil forringe nøjagtigheden af mængden af uddeling.
    2. Til dispensering af 40 μL-cellesuspensionen skal du montere en 10 μL-kassette og forberede et program med indstillingerne som beskrevet i trin 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Juster flow hastigheds parameteren til lav for at dispensere celler med lav hastighed for at undgå at fremme potentielle skader på cellerne ved at forskyde stress og høj indvirkning på bunden af brøndene. Juster dispensations højden til 11,43 mm (ifølge den anvendte cellekultur plade, supplerende figur 1), høj nok til at sænke celle påvirkningen på bunden af brøndene under dispenserings processen, men lav nok til at undgå fastholdelse af dråberne på dispenserings hovedet. Juster pladen klar højde til 16 mm for at tillade fri forskydning af dispenserings hovedet over pladen efter dispensering af hver række.
      2. Kontroller visuelt de korrekte indstillinger for den peristaltiske væske håndterings hovedhøjde: Sørg for, at der ikke er nogen dråber tilbage på dispenserings spidserne, mens du dispener, og kontroller, at hovedet er højt nok til, at hovedet kan forryres efter udløbet af hver række.
        Bemærk: undgå drop retention er en afgørende parameter, da det vil føre til udlevering af et upålideligt celle nummer.
  2. DNA plasmid forberedelse (klassisk miniprep ekstraktions protokol)
    1. Vokse en forvandlet DH5α bakteriestamme i LB medium suppleret med 125 μg/mL ampicillin udvælgelse antibiotikum (tabel over materialer) natten over ved 37 °c og under blid agitation (200 rpm) på en orbital shaker (tabel over materialer).
    2. Høst 2 mL af kulturen, pellet cellerne ved at centrifuger i 5 min ved 6.000 x g, og kassér supernatanten.
    3. Opslæmning af celle pellet med 250 μl opblanding buffer indeholdende RNase a (tabel over materialer). Tilsæt 250 μL lysis-buffer, og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur i henhold til producentens anvisninger.
    4. Stop lysis-reaktionen ved at tilføje 300 μL neutraliserings buffer (tabel over materialer) og vortexting kort tid. Centrifuger rørene i 5 minutter ved 11.000 x g.
    5. Placer en ny plasmid-minicolumn (tabel over materialer) i et 2 ml opsamlings glas, og afleder supernatanten i kolonnen ved at centrifuge i 1 min ved 11.000 x g.
    6. Kassér gennemstrømningen, og Placer minikolonnen tilbage i opsamlingsrøret.
    7. Vask plasmid-minisøjlen med 500 μL valgfri vaskebuffer (tabel over materialer) og centrifuge i 1 min ved 11.000 x gi henhold til producentens anvisninger.
    8. Kassér gennemstrømnings-og Placer plasmid-minikolonnen tilbage i opsamlingsrøret.
    9. Tilsæt 700 μL vaskebuffer (tabel over materialer) suppleret med ethanol og centrifuge i 1 min ved 11.000 x g, i henhold til producentens anvisninger.
    10. Kassér gennemstrømnings-og centrifuger plasmid-minikolonnen og dens opsamlings slange 1x mere i 2 min ved 11.000 x g for at tørre silicagmembranen.
    11. Placer den tørrede plasmid minicolumn i et nyt 1,5 mL rør og tilsæt 30 μL destilleret vand forvarmet ved 60 °C, Inkuber det i 2 minutter ved stuetemperatur, og centrifuger det derefter i 1 min ved 11.000 x g.
    12. Kassér plasmid-minikolonnen, og opbevar eluatet med det rensede DNA-plasmid.
    13. Mål DNA-koncentrationen af det eluede DNA ved hjælp af et mikrovolumen-Spektrofotometer (tabel over materialer).
      1. Tænd for Spektrofotometer, og Vælg indstillingerne for DNA-måling .
      2. Løft prøvetagnings armen af spektrofotometeret og afpipetteres 1 μL vand på måle piedestal for at udføre en blind kalibrering.
      3. Sænk prøvetagnings armen, start blind målingen, og vent på færdiggørelse.
      4. Løft prøvetagnings armen, og aftør prøven fra de øvre og nedre piedelaler.
      5. 1 μL af DNA-opløsningen afpipetteres på den nedre piedestal for at måle den.
      6. Sænk prøvetagnings armen, start DNA-koncentrations målingen, og vent på færdiggørelse.
      7. Løft prøvetagnings armen, og aftør prøven fra de øvre og nedre piedelaler.
      8. Gentag trin 1.2.13.5-1.2.13.7 for yderligere DNA-koncentrationsmålinger.
    14. Når målingerne er færdige, opbevares DNA-opløsningerne ved 4 °C indtil brug.

2. eksperimentel design og produktion af pluklisterne til at drive den ADE-baserede dispenser

Bemærk: en dedikeret "brugervenlig" regnearks makro blev udviklet til at håndtere DNA-mængder og blande op til fire plasmider i et 384-brønds plade format. Baseret på det indtastede eksperimentelle design, genererer denne makro de nødvendige filer til at drive den ade-baserede DNA transfektering protokol af nanodispenser. For at generere disse filer, skal flere felter udfyldes i skabelon arket som vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2 : Generering af pluklisterne for at drive ade-uddelinger ved hjælp af regnearks makroen. Flere parametre skal fyldes, nemlig (1) transfektering reagens (TR) og de minimale/maksimale volumener, der skal anvendes i kilde pladen, (2) de indledende plasmid koncentrationer, der skal dispenseret i kilde pladen, og (3) den hele pladen design, herunder de forventede plasmid mængder og multiplexing i hver af de 384-brønde. (4) Generer pluklister aktivering gør det muligt for de forskellige felter, der skal verificeres og, når korrekt udfyldt, pluklister for DNA og TR dispensation og den nødvendige kilde plade skabelon genereres automatisk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Indtast nanodispenser-protokol parametrene i de lyserøde felter. Indstil blandings værdien for transfektering reagens (TR) til 500 nl. Indstil den minimale lydstyrke værdi i kilde pladens brønde til 4 μL. Indstil den maksimale lydstyrke i kilde pladens brønde til 11,25 μL.
    Bemærk: den nanodispenser, der anvendes her, kan kun overføre maksimalt 500 nL i én kørsel af ADE. Disse lyserøde felter er fyldt med de anbefalede værdier, men kan ændres i henhold til brugernes behov.
  2. Indtast 100 ng/μL DNA-start koncentrationer i de blå felter svarende til det underliggende DNA.
    Bemærk: denne værdi er den optimale koncentration, der tidligere er defineret, men kan dog ændres til forskellige brugerbehov.
  3. Indtast det ønskede DNA-beløb i de grå/grønne felter. Indtast beløbene og plasmid navne for 384 brøndene, hvilket sikrer den samme stavning, hvis den samme plasmid anvendes i flere brønde.
  4. Generer kilde plade design, valglister-filerne og pipette Rings guidens fil. Klik på Generer pluklister for at tillade, at makroen genererer filerne DNA-picklist. csv, T. R.-Picliste. csv og 384-Wells-Pipetting-Guide. csv fra data, som er indsamlet på det tilsvarende ark. Hvis du bliver bedt om det, skal du rette de orange fyldte celleværdier, da det angiver fejl eller diskenheder, der ikke kan håndteres af nanodispenseren.
  5. Udskriv skabelonen (erne) fra kilde plade arket. Plasmid navne og minimal volumen til at fylde i brøndene er indiceret. Ligeledes skal transfektering reagens blandings volumener, der skal fyldes i følgende brønde, angives som TR og fremhæves med grønt.

3. klargøring af DNA-kilde pladen ved hjælp af 384-Well pipette Rings guide-applikationen

  1. Den lagrede DNA-plasmid fortyndes fra trin 1.2.14 til 100 ng/μL med destilleret vand.
  2. Kalibrer 384-brønd gitteret til pladens dimensioner: Åbn 384-brønd pipette Rings vejledningen på en tablet (figur 3). Placer kilde pladen på gitteret på den nederste skærm, og klik på + eller - (eller brug den røde markør) i den øverste venstre Kalibreringsmenu for at forbedre eller reducere størrelsen på gitteret og brøndene for at justere de grønne brønde til pladens fire hjørne brønde. .

Figure 3
Figur 3 : Brug af programmet 384-Well pipette Rings guide. (1) kalibrering af 384-brønd gitter til pladens størrelse; (2)) montering af en universel 3D-printet plade adapter til tabletten ved hjælp af dobbeltsidet tape; (3) placering af pladen på adapteren; (4) forskydning af gitteret for at centrere det til den monterede plade. (5) låsning af kalibrerings trinnet. (6) åbning af 384 Wells pipette Rings guide. csv-fil. (7) i betragtning af fillisten, vil ansøgningen angive det forventede kilde plade navn, reagens (DNA eller transfektering reagens), koncentrationen, og mængden til at dispensere i målet brønde, som vil blive belyst en efter en. (8) venstre og højre pileknap gør det muligt for brugeren at følge pipette Rings vejledningen, så reagenserne let kan dispenserer i henhold til regnearksskabelon (er) til makrokilde pladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Brug dobbeltsidet tape til at montere den 3D-printede plade adapter på skærmen for at undgå bevægelser med kilde pladen under dispensering. Hvis det er nødvendigt, skal du flytte det kalibrerede gitter ved hjælp af rotations pilene og op/ned/højre/venstre -knapperne for at justere gitteret på skærmen til pladens position. Når gitteret og brønd størrelserne er korrekt kalibreret og placeret, skal du markere afkrydsningsfeltet Lås kalibrering .
  2. Klik på filer , og Åbn 384 Wells pipette Rings guide. csv -filen. Følg instruktionerne på skærmen for manuelt at dispensere det angivne volumen af det angivne plasmid ved den angivne koncentration i den hvide Fremhævede brønd svarende til den korrekte måldestination for den forventede plade. Brug - eller + pilene til at gå tilbage eller videre i DNA dispenserings processen. Stop dispensering, når du når den første Transfection reagens opløsning for at indlæse.
  3. Når DNA-dispenseringer er afsluttet, fjernes kilde pladen fra adapteren. Hvis flere kilde plader skal fyldes, skal du anbringe en ny kilde plade på adapteren og følge instruktionerne for udlevering. Når DNA-uddelinger er færdig, centrifugeres den DNA-fyldte kilde plade (er) (ved 1.500 x g i 2 minutter) for at sikre korrekt væske udjævning og for at fjerne bobler, hvilket fører til unøjagtighed i de ade-baserede overførsler.

4. Peristaltisk væske handler-baseret 1 μl fortyndingsmiddel dispensation i målpladen

Bemærk: Udfør trin 4.1-4.5 i et biologisk sikkerhedskabinet.

  1. Desinficer 1 μL-kassette hovedet ved at spraye det med et spray desinfektionsmiddel (tabel over materialer), og lad denne løsning komme ind i spidsen holderen. Absorbere det rest desinfektionsmiddel på absorberende papir. Monter 1 μL-kassetten på den peristaltiske væske håndterings anordning. Tænd for enheden, og sørg for, at indstillingen for kassette type er korrekt (1 μL) samt plade formatet (384 brønde).
  2. Desinficere hele lumen af slangen: Indsæt røret Organizer (holder de otte rør sammen) i et sterilt fartøj og fylde det med 5 mL 70% alkohol. Ved hjælp af den peristaltiske væske håndterings funktion skal du først skylle alkoholen i slangen og derefter skylle den ved at sende 5 mL destilleret vand og 5 mL serumfrit medium (Dulbecco's modificerede ørne medium [DMEM] suppleret med 100 U/mL penicillin-streptomycin; Materiale), som successivt fylder samme fartøj. Sørg for, at ingen af spidsen er tilstoppet ved visuelt at inspicere væskestrømmen fra dem alle.
  3. Slangen fyldes med serumfrit medium ved at fylde et nyt sterilt fartøj med 10 mL forvarmet serumfrit medium og dykke i røret. Tryk på Prime-knappen på den peristaltiske væske handler i ca. 10 s. Endnu en gang, sikre ingen tip er tilstoppet ved visuelt inspicere væskestrømmen fra dem alle.
  4. Fyld pladen med 1 μL fortyndingsvæske. Anbring en steril 384-brønd kultur plade (destination) på den peristaltiske væske handler plade bærer, og Fjern låget.
  5. Kør det forudkalibrerede program for at dispensere 1 μL i hver brønd af 384-brønd pladen. Dispenserings tiden er ca. 8 s. Udskift derefter låget på 384-brønd pladen.
    Bemærk: Alternativt kan dette trin håndteres manuelt i et sikkerhedskabinet ved hjælp af en multikanals mikropipette.

5. udførelse af en undersøgelse for at kontrollere de manuelt dispenserede volumener

Bemærk: Se figur 4for yderligere oplysninger.

  1. Kør nanodispenser programmet, gå til fanen diagnostik, Markér feltet kilde plade ud , læg kilde pladen på plade holderen, og sæt kryds i for at komme ind i pladen. Når du bliver bedt om det, skal du vælge 384Ldv_aq_b2 for at indstille nanodispenseren til den vandige buffer dispenserings tilstand og trykke på OK.
  2. Vælg undersøgelse i menuen Diverse , og klik på Launch. Vælg de fyldte brønde til at analysere og klik på Go -knappen. Kontroller, at de målte volumener svarer til de forventede, og sørg for, at der ikke er lastet brønde med volumener på mere end 12 μL, da dette vil undgå overførsler.

Figure 4
Figur 4 : Definition af undersøgelses softwarens parametre. (1) start nanodispenser programmet. (2) Åbn fanen diagnostik . (3) Indsæt kilde pladen ved at afkryde for kilde pladen og derefter i. (4) Definer kilde plade typen i menuen, når du bliver bedt om det. (5) i diverse boks, Vælg undersøgelse i drop-down menuen. (6) start undersøgelsesprogrammet ved at klikke på Launch. (7) Vælg de fyldte brønde, som skal måles. (8) start analysen ved at klikke på Go. (9) når undersøgelsen er udført, er de målte volumener skrevet i de tilsvarende udvalgte brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

6. ADE-drevet DNA-uddeling til destinations pladen

  1. Kør valgliste softwaren, Indstil henholdsvis 384-kilde-og destinations plade typerne til 384_LDV og Greiner 384PS_781096 (figur 5). Indstil enheden til vandig buffer dispenserings tilstand ved at vælge 384ldv_aq_b2, og fjern markeringen "Optimer overførselshastigheden".

Figure 5
Figur 5 : Udførelse af de valgliste baserede uddelinger. (1) start nanodispenser softwaren. På fanen protokol skal du vælge (2) prøve pladens format, (3) målpladens type og (4) unticks "Optimer overførselshastigheden". (5) Vælg Plukliste fane. (6) Klik på Importer og vælg den korrekte *. csv-fil (DNA-valgliste eller T.R.-valgliste). (7) når du er valgt, klik på Importer. (8) Klik på Afspil og Gem protokollen. (9) Udfør en uddelinger simulering ved at klikke på simulere, eller (10) starte den programmerede dispensation ved at klikke på Kør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Vælg "plukliste" fanebladet, klik på Importer, skal du vælge DNA-picklist. csv fil. Klik på Afspil og Gem protokollen. Klik på Simulér for at udføre en simulering af de programmerede uddelinger for at sikre, at valglisten svarer til det forventede eksperimentelle design. Når du er færdig, klik på Luk.
  2. Klik på Afspil, og derefter køre, for at starte dispenserings programmet: når du bliver spurgt, skal du indsætte den ønskede kilde plade (DNA-løsninger manuelt udfyldt) og destinations pladen (fortyndingsvæske fyldt) i nanodispenseren.
    Bemærk: dispenserings tiden er ca. 5-20 min for en komplet 384-brønd plade, afhængigt af de valgte volumener og det samlede antal dispenseringer i det eksperimentelle design.
  3. Alternativt kan du sætte protokollen på pause her, da de fortynde-og DNA-fyldte plader håndterer tør eller frosset opbevaring i op til 7 dage. For tør opbevaring, lad pladerne tørre på bænken ved stuetemperatur og derefter gemme dem på samme måde. Tø og centrifuge (ved 1.500 x g i 2 min) frosne lagrede plader før brug i et transfektering trin (afsnit 7).
     

7. ade-drevet transfektering reagens dispensation

  1. I et biosikkerheds kabinet fortyndes extemporantant lipopolyplex transfektering reagens i serumfrit medium til en 1x slutkoncentration. Vortex og straks dispensere denne transfektering reagens mix i henhold til den foruddefinerede kilde plade (r) designet af makroen og ved hjælp af den forudkalibrerede 384-Well pipette Rings programguide som beskrevet i trin 3,4.
    Bemærk: centrifuger ikke kilde pladen, når den er fyldt med reagenset, da der ikke er bemærket nogen transfektering efter centrifugering.
  2. Kør nanodispenser programmet for at udføre en "undersøgelse" som beskrevet i afsnit 5 for at kontrollere mængderne af alle de manuelt udfyldte TR -brønde på kilde pladen (-erne) for at undgå dispenserings fejl på grund af mængder på mere end 12 μl.
  3. Klik på Nulstil for at rydde eksempel listen over DNA-valgliste i valgliste softwaren, og kontroller, at enhedens parametre stadig er indstillet til vandige buffere og til de anvendte kilde-og destinations plade typer, som i trin 6,1.
  4. Klik på Importer , og vælg TR-picklist. csv-filen. Klik på Afspil og Gem protokollen hvis du bliver bedt om det, og (dette er valgfrit, men stærkt anbefales) udføre en simulering af de programmerede transfektering reagens blanding uddelinger for at sikre korrekt udformning af dispenseringer ved at klikke på Knappen Simuler . Når du er færdig, klik på Luk.
  5. Klik på Afspil, og derefter Kør knappen for at starte dispenserings programmet: Placer på den ønskede kilde plade (r) (TR-blandingen-fyldt) og MÅLPLADEN (fortyndingsmiddel-og DNA-fyldt) i nanodispenseren.
    Bemærk: dispenserings tiden er mindre end 20 min for en komplet 384-brønd plade ved udlevering 500 nL af TR-blandingen.
  6. Inkuber 15-30 min ved stuetemperatur efter tilsætning af TR til DNA'ET som angivet i fabrikantens protokol.

8. Peristaltisk væske handler-baseret celle uddeling

  1. Forbered den peristaltiske væske handler til dispensering af celler. Desinficer et 10 μL kassette hoved ved at sprøjte det med Aniospray surf 29 desinfektionsmiddel og absorbere rest på papir. Monter kassetten på den peristaltiske væske håndteringsenhed, Skift kassette type indstillingen til 10 μL, og sørg for, at plade formatet er indstillet til 384 brønde.
  2. Desinficer 10 μL kassette slangen som tidligere beskrevet i trin 4,2. røret i et sterilt fartøj og skyl slangen med 5 mL 70% alkohol, derefter med 5 mL destilleret vand og endelig med 5 mL serumfrit medium, der successivt fyldes i det samme fartøj, og indtil hvert rør er tomt.
  3. Forbered cellesuspensionen til at dispensere. Fra en flydende Hela Cell B10-kultur skål vaskes cellerne 1x med 1x fosfat-Buffered Saline (PBS) opløsning, og derefter dissocierer cellerne med trypsin/EDTA i 5 min ved 37 °c.
  4. Kontrollér celle dissociationen under et mikroskop, og stop trypsin/EDTA-handlingen ved at tilsætte 10 mL komplet medium (DMEM suppleret med 10% føtal kvægserum og 100 U/mL penicillin-streptomycin; Se materiale tabellen) i kultur skålen. Høst celler i et 50 mL rør og tælle cellerne under mikroskopet, ved hjælp af en Malassez celle eller en automatisk celle tæller.
  5. Forbered mindst 25 mL HeLa-cellesuspension i en koncentration på 37.500 celler/mL i komplet medium (dvs. 1.500 celler/40 μL) for en komplet 384-brønd plade for at sikre rørpriming og 40 μL/brønd uddeling.
  6. For at dispensere cellerne skal du fylde et nyt sterilt fartøj med den forberedte cellesuspension og røre det for at undgå sedimentering, hvilket fører til unøjagtighed i uddelings cellens tæthed. Indsæt tube Organizer i denne opløsning, og tryk på Prime -knappen, indtil cellesuspensionen begynder at skylle fra doserings hovedet. Sørg for, at ingen af spidsen er tilstoppet ved visuelt at inspicere væskestrømmen fra dem alle, og sørg for, at hvert rør er fyldt med cellesuspension.
  7. Ilæg DNA-og TR-fyldte 384-nå-destinations pladen på den peristaltiske væske handler plade bærer, og Fjern låget. Kør det forudkalibrerede program for at dispensere 40 μL af cellesuspensionen på den komplette 384-brønd plade (dvs. 1.500 celler/brønd). Dispenserings tiden er ca. 8 s. Udskift låget på 384-brønd pladen.
    Bemærk: Alternativt kan 40 μL-cellesuspensionen udleveres manuelt ved hjælp af en multikanals mikropipette.

9. brugerdefineret biologisk analyse (celle transfektering effektivitets overvågning)

Bemærk: efter eksperimentets forsøgs indstillinger og hensigt skal du bruge de påkrævede metoder til luminescens, fluorescens, screening med høj indhold og omvendt transskription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR). I dette afsnit af protokollen evalueres celle transfektering effektivitet ved automatiseret Fluorescens mikroskopi og billedanalyse.

  1. Pladen inkubates ved 37 °C med 5% CO2 i en vand mættet atmosfære og indtil korrekt protein ekspression.
    Bemærk: her bruges en 48 h inkubations tid for Hela-celler til at overvåge transfektering effektivitet, ved hjælp af tdtomato-og mvenus-udtrykker plasmider.
  2. Fjern dyrkningsmediet 48 h efter transfection ved at invertere pladen, tilsæt 30 μL/brønd på 10% formalin ved hjælp af den peristaltiske væske handler (10 μL kassette), og Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Fjern formalin ved at invertere pladen; derefter inkubatér cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur med 0,1 ng/mL Hoechst fortyndet i 1x PBS opløsning.
  4. Cellerne 3 x i 15 minutter vaskes med 80 μL 1x PBS justeret til pH = 8 for at genvinde det høje fluorescens signal tabt ved 6,9 pH i formalin-løsningens inkubations trin.
  5. Ved hjælp af et automatiseret fluorescerende mikroskop, erhverve billeder af to eller tre fluorescerende kanaler (Hoechst, tdTomato, og mVenus) sekventielt med 10x mål og en ordentlig emission filter sæt (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol [DAPI], dsRed, og fluorescein henholdsvis isothiocyanat [FITC]).
  6. For at evaluere transfektering effektivitetsgevinster, bruge billedanalyse software til at bestemme transfektering effektivitetsgevinster ved hjælp af script analyse baseret på kerner farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fIn for at afgøre, om ade teknologi kan anvendes til en automatiseret reverse transfektering protokol, vi overvågede celle transfektering effektivitet ved Fluorescens mikroskopi, ved hjælp af en rød fluorescerende tdtomato udtrykker plasmid. For det første med henblik på at bestemme de bedste transfektering parametre, blev forskellige fortyndings mængder og totale mængder af DNA kryds testet. Fortyndings volumenet blev brugt til at tillade, at DNA-dråberne, når de var udleveret, spredte sig over brøndene for at omgå uhomogen transfektering observeret ved indledende eksperimenter (dvs. kun i midten af brøndene). Som vist i figur 6avar transfektering af Hela-celler, der brugte lipopolyplex reagens20 , vellykket. Interessant, ved hjælp af en 1 μl fortyndingsvolumen, DNA-mængder spænder fra 5 til 30 ng viste den samme effektivitet og op til 90% celle transfektering sammenlignet med højere mængder, såsom 50 og 100 ng, for hvilke en brat fald blev observeret. Vi prøvede forskellige fortyndings volumener fra 15 nL til 4 μL og identificerede 1 μL til at være den bedste tilstand, som i betydelig grad eksemplificeret her ved hjælp af 30 ng af DNA.

Figure 6
Figur 6 : Repræsentative resultater. A) virkningen af DNA-mængden og fortyndingsvolumen på transfektering effektivitet. Hela celler blev omvendt transficeret ved hjælp af nanodispenser enheden og lipopolyplex, ved hjælp af en 1x koncentration som anbefalet af producenten. Af den anbefalede fortyndingsvæske (serumfrit medium) blev 15-4000 nL anvendt med 10-100 ng mængder af rødt fluorescerende plasmid (tdTomato). Transfection effektivitetsgevinster blev bestemt 48 h post-transfection ved hjælp af billedbaseret analyse software. Resultaterne udtrykkes som en procentdel af transficeret celler for det stigende DNA-beløb, og fortyndingsvolumen viser de optimale betingelser: 30 ng af total DNA med en stigende fortyndingsvolumen og 1 μl fortyndingsmiddel med stigende DNA-mængder. Fejllinjerne repræsenterer SEM med n ≥ 4. To-vejs ANOVA og Bonferroni post-test blev anvendt til statistisk analyse. *p < 0,05 sammenlignet med andre prikker. B) stabiliteten af de fremstillede DNA-plader. Fortyndingsmiddel (1 μl) blev dispenseret ved brug af Peristaltisk Væskehåndtering, og 30 ng af DNA blev dispenseret og straks transficeret ved hjælp af lipopolyplex reagens dispenseret ved ade (kontrol) eller enten opbevares ved stuetemperatur, når tør eller frosset ved-20 °c. Ved dag 0, 2 eller 7 blev det tørre DNA rehydreret med 1 μL fortyndingsmiddel dispenseret ved brug af den peristaltiske væske handler, og frosne plader blev optøet ved stuetemperatur og centrifugeret (ved 1.500 x g i 2 min). Cellerne blev derefter seedet ved hjælp af den peristaltiske væske handler i henhold til den beskrevne protokol. Fejllinjerne repræsenterer SEM med n ≥ 3. To-vejs ANOVA og Bonferroni post-test blev anvendt til statistisk analyse. NS = ikke væsentligt anderledes. C) PLASMID-DNA-cotransfection-effektivitet. Hela cellerne blev transficeret med 30 ng mvenus-og tdtomato-ekspederet plasmid lastet i to separate kilde brønde (ved hjælp af en 1,7 ratio af mvenus over tdtomato for at niveau deres relative fluorescens udgang). Transfection effektivitetsgevinster blev sammenlignet 48 h post-transfection ved hjælp af billedbaseret analyse software og blev udtrykt som en procentdel af transficeret celler og en procentdel af cotransfected celler i den transficeret befolkning. Procentdelen af cotransfected celler blev bestemt ved at beregne det grøn-fluorescens-udtrykte celle nummer i de røde fluorescerende populations celler. Fejllinjerne repræsenterer SEM med n ≥ 3. To-vejs ANOVA og Bonferroni post-test blev anvendt til statistisk analyse. NS = ikke væsentligt anderledes. D) repræsentative felter af Fluorescens mikroskopi fra billed erhvervelsen vist i panel C med tre fluorescerende kanaler (Hoechst, Tdtomato og mvenus), der er erhvervet sekventielt af en billed platform (tabel over materialer ), ved brug af 10x mål og et korrekt emissionsfiltersæt (henholdsvis DAPI, dsRed og FITC). Dette tal er blevet ændret fra Colin et al.1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For yderligere at øge gennemløbet af denne protokol, vi næste undersøgt, om en kilde plade opbevaring fyldt med DNA og fortynder løsninger kan lagres og anvendes på et senere tidspunkt. Der blev testet to metoder til effektiv opbevaring af DNA, nemlig tør opbevaring af pladen ved at lade den tørre på bænken eller frosset opbevaring (ved-20 °C). Begge opbevaringsmetoder førte ikke til signifikant forskellige resultater end en frisk dispenseret DNA-opløsning opbevaret i op til 7 dage (figur 6b), og begge metoder gjorde det muligt at udføre transfektering fra lagrede DNA-fyldte plader, såsom en bank af Plasmider.

Endelig, som plasmid transfektering oftest opstår ved hjælp af mindst to forskellige plasmider, vi næste undersøgt DNA multiplexing evne af protokollen præsenteres her ved hjælp af de bedst identificerede betingelser (1 μl af fortyndingsmiddel og 30 ng af DNA). Den tidligere anvendte tdTomato rød-fluorescerende-protein-udtrykte plasmid blev modificeret til at udtrykke mVenus, en lys gul fluorescerende protein, og begge blev derefter brugt i cotransfection forsøg. Rød-eller grøn-fluorescerende-positiv celle analyse (figur 6c) viste transfektering effektivitet at være omkring 80%; men i den røde befolkning, næsten 100% af cellerne blev også cotransfected med mVenus-udtrykker plasmid som kan ses i den repræsentative software-baserede billedanalyse af figur 6d.

Supplerende figur 1: diagram, der viser en passende dispenserings højde for dråbe til at røre bunden af brønden for at undgå dens fastholdelse på dispensering spidsen. Til venstre, korrekte indstillinger tillade dråbe til at sprede på brønden overflade undgå sin tilbageholdelse på dispenserings tips. Til højre, dårlige indstillinger føre til dråbe fastholdelse, der kan observeres under hovedet bevægelse til den næste rå. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etableringen og optimeringen af en nøjagtig transfektering-metode med høj gennemløb for en given cellelinje kræver, at forskerne følger nogle af de nøgleparametre, der er beskrevet i dette afsnit. Vi anbefaler kraftigt at starte med de anbefalede værdier i hele protokollen, da disse indstillinger, der er optimeret til HeLa-celler, også viste sig at være effektive for HEK-celler. Men da de bedste parametre kan afhænge af cellelinjer og transfektering reagenser, kan optimale betingelser defineres ved at variere celle nummer, fortyndingsvolumen, total DNA-mængde, og transfektering reagens natur, koncentration, eller endda volumen, der anvendes som det var tilfælde under optimering af denne protokol for HeLa celler1.

Den samlede protokol præsenteres her er blevet udviklet og yderligere optimeret til at tillade celle transfektering selv af nybegyndere i marken. For at nå dette mål, nøgleredskaber til at gøre protokollen så enkel som muligt og undgå menneskelige fejl er blevet udviklet: en brugervenlig regnearks makro til nemt at designe eksperimentet og en tablet applikation til at vejlede brugeren til korrekt fylde kilden plade (er).

For at sikre protokollens pålidelighed er det således kun nogle få kritiske trin, der skal kontrolleres: i) et egentligt eksperimentelt design; II) de korrekte peristaltiske dispenseringer fra den klassiske peristaltiske væske handler; III) den korrekte DNA og transfektering reagens akustiske-baserede dispenseringer; IV) undgåelse af centrifugering af kilde pladen før udleveringen af transfektering reagens, som syntes at forringe transfektering. Efter disse få anbefalinger vil sikre en effektiv transfektering af cellerne.

Korrekt eksperimentel design

Den eksperimentelle setup er blevet gjort brugervenligt af udviklingen af makro regnearket, som bare skal fyldes med det forventede DNA plasmider navn, ønskede beløb, og nogle centrale parameterværdier. Når makroen først er udfyldt, analyserer den først de indtastede parametre for at registrere potentielle fejl, såsom passende minimale og maksimale mængder indtastet for kilde brøndene og volumen af transfektering reagens uddelinger. Ud fra de DNA-koncentrationer, der er indtastet i hver af de fire mulige rækker og plasmid-mængden i de underliggende felter, kontrollerer makroen, om de forventede volumener, der skal dispenserer, er multipla af 2,5 nL (mængden af de dråber, der udleveres af nanodispenser). Når der er foretaget en kontrol af eventuelle fejl, beregner makroen den samlede mængde af hver DNA-prøve, der skal udleveres, og udformer derefter kilde plade skabelonen (ved at sortere DNA-navnene i alfabetisk rækkefølge). De mængder, der er angivet i kilde pladen (-erne), tager hensyn til de forventede arbejdsmængder i en kilde brønd (beregnet ud fra de minimale og maksimale volumen værdier, der er udfyldt i skabelon arket). Alle de forventede DNA-dispenseringer i hver af brøndene skrives derefter på DNA-valgliste arket. Listen over DNA-transfected brønde bruges derefter til at skrive TR-valgliste arket ved hjælp af det transfektering reagens volumen, der er angivet på skabelon arket. De mængder, der beregnes på kilde plade arket, overføres derefter til guide arket 384-brønd pipettering. Data fra DNA-valglisten, TR-piclist og 384-Well pipette Rings guide bruges derefter til at generere de tilsvarende filer i *. csv-format.

Korrekt DNA-og TR-uddeling på kilde pladen

Som dispensering på en 384-brønd kilde plade og, mere specifikt, lokalisering af målet godt kan fremme fejl og er desuden tidskrævende, har vi udviklet en dedikeret tablet-baseret applikation svarende til iPipet21. I modsætning til iPipet, den, der er beskrevet her, kan bruges med Android (kun Android version 4,4 og op understøttes). Baseret på den 384-Wells-Pipetting-Guide. csv-fil, der genereres af makro regnearket, hjælper den brugeren i den samlede dispenserings proces. Der henviser til, at dets anvendelse for et par dispensationer ikke er det værd, kan det være interessant at spare tid og undgå fejl, hvis et stort antal DNA og TR dispenseringer forventes. . Csv-filen skal indeholde oplysninger om brønd, plade, navn, koncentration og diskenhed. Denne applikation kan derefter bruges til andre applikationer, såsom dispenserings løsninger (reagenser, farvestof, sammensatte, etc.) i målet godt, ifølge en bruger dedikeret CSV-fil. Desuden, det giver brugeren mulighed for at belyse en hel række eller linje ved at indtaste de relevante oplysninger i Target Well kolonne ved hjælp af dette forventede format: Row_1 (til 24) eller Line_A (til P).

Fejlfinding af dårlig celle transfektering effektivitet

Flere parametre, der er beskrevet nedenfor, kan forringe celle transfektering i den beskrevne ade-baserede protokol og skal kontrolleres individuelt og omgås i tilfælde af effektivitetsproblemer.

En af de første vigtige parametre for transfektering er kvaliteten af cellerne og den tæthed, der anvendes under såningen. Selv om hver celletype vil kræve forskellige parametre, skal nogle af dem respekteres for at sikre en vellykket transfection. Først og fremmest skal cellesuspensionen forberedes extemporantant fra en subconfluent plade for at undgå celle stress før transfection, og de bør ikke efterlades liggende på bænken for længe (2 h maksimum). For det andet, såning tæthed af cellerne skal være lav nok af to grunde: for at undgå cellulære kontakter og fremme en høj celle overflade en gang spredes, men også fordi aktivt dividere celler bedre tage fremmed nukleinsyre22,23. Desværre, den optimale celletæthed for transfektering varierer afhængigt af celletyper og transfektering teknologi og skal bestemmes for hver cellelinje. Disse er afgørende parametre for at sikre effektiv transfection.

En anden vigtig parameter, der kan moduere transfektering effektivitet er cellen passage nummer24. Faktisk er celler i kulturen konstant udsat for Evolution på grund af konkurrence og naturlig udvælgelse. Det er velkendt, at differentiale genekspression mellem lav og høj celle passage tal forventes i de fleste cellelinjer på grund af dedifferentiering som passage antallet stiger. Efter dette fænomen, kan transfektering effektivitet også blive påvirket. Det er imidlertid påvist, at passage relaterede virkninger er stærkt afhængige af celle linjen og dyrkningsforholdene. Oven i det, hvad der betragtes som en "høj" passage niveau varierer fra den ene cellelinje til en anden. Det betyder, at antallet af passage numre, hvorunder et sæt eksperimenter kan udføres pålideligt, skal bestemmes for hver given cellelinje.

En anden parameter, som øger vanskeligheden ved fastsættelsen af de bedste betingelser for transfektering er, at kulturmedium sammensætning også spiller en afgørende rolle, da tilstedeværelsen af serum og/eller antibiotika moduere transfektering effektivitet. Faktisk, de fleste kommercielle protokoller anbefaler brugen af serum-fri medium under transfektering skridt til at øge effektiviteten eller omgå problemer med dårlig effektivitet3,25,26,27. Men denne parameter er faktisk mere kompleks at påfange, da det er blevet påvist, at for en given cellelinje, tidligt versus sene passager kan forbedre eller lavere effektivitet afhængigt af serum tilstedeværelse eller fravær i kulturmedium28. Andre forskere preconize brugen af antibiotika-fri medium for passage før transfektering ved dyrkning celler, for at opnå høj kvalitet celler til transfektering29. Afslutningsvis, ved optimering af transfektering betingelser for en given celletype, skal hver af disse parametre testes: tidlige eller sene passage celler og brugen af medium med eller uden serum under den sidste passage før høst af cellerne og/eller under transfektering skridt selv.

Under optimering af protokollen præsenteret her, to typer af reagens blev brugt: en liposomal reagens danner liposome-lignende komplekser og lipopolyplex reagens, en nonliposomal polymert sammensatte1. Mens vi havde succes i årevis manuelt transfficerer Hela celler med den første, dårlig transfektering effektivitet blev observeret i den nuværende automatiserede protokol. Dette skyldtes sandsynligvis et påkrævet vortexat trin ved blanding af DNA med transfektering reagens, der ikke kan udføres i 384-brønd plade format. Den lipopolyplex behøver ikke et sådant skridt, og derfor førte til højere transfektering effektivitetsgevinster i alle de testede indstillinger. Selv om dette ikke er blevet bekræftet i den nuværende undersøgelse, undgå transfektering reagenser, der kræver en fysisk blande trin Sådan har pipettering eller vortexning vil sandsynligvis føre til bedre resultater.

Vi anbefaler også brug af en transfektering reagens kompatibel med reverse Trans fection som den præsenterede protokol er baseret på en reverse transfektering. Nogle celler er kendt for at være svære at transficere og nogle dedikerede kemiske forbindelser er udviklet til at fremme højere transfektering effektivitet30,31. Hvis du sigter mod at transfficerer svære at transfect celler, anbefaler vi at teste de givne celle-type eller celle-line-dedikerede transfektering reagenser, forudsat reverse transfektering er muligt med disse.

Flere parametre, som er beskrevet i de underliggende afsnit, kan have en virkning og noget forringe ADE dispenserings processen, hvilket muligvis ødelægger det endelige eksperiment.

Nanodispenseren blev udviklet til at dispensere 2,5 nL-dråber fra kilde brønde fyldt med 3-12 μL vandig buffer (dvs. 9 μL arbejdsvolumen). Nanodispenser anordningen, der anvendes i dette studie, integrerer en dynamisk væske analyseteknologi til bestemmelse af væske sammensætningen og væske højden i kilde pladen for at styre den nødvendige effekt til at skubbe 2,5 nL-dråber19ud. Mens du fylder kilde pladen manuelt eller ved hjælp af en klassisk Peristaltisk væske handler, er volumener oftest ikke så nøjagtige end dem, der bestemmes af den dynamiske væskeanalyse. Dette er et afgørende punkt at tage hensyn til, da enheden ikke er i stand til at dispensere fra kilde brønde lastet med mere end 12 μL. Således vil deres tilstedeværelse kompromittere eksperimentet. Selvfølgelig, en liste over de udførte uddelinger kan genereres i slutningen af programmet, men dette kræver, at brugeren til at justere mængder og køre et program til at inddrive de mistede dispensationer kun. For at undgå disse uoverensstemmelser anbefales det at udføre en "undersøgelse", når DNA-plasmiderne er blevet indlæst for at verificere den forventede mængde i hver berørt brønd.

En afgørende parameter for dråbe udslyngning er variationen i flydende overfladespænding17,32. Vand DNA-opløsninger er kendt for deres viskositet; Dette kan forringe dispenserings processen ved ADE. Mens de fysiske parametre ikke blev fastlagt i vores tidligere studie1, resulterede højere DNA-opløsning koncentrationer i kilde pladen i lavere transfektering effektivitet, selv for den samme totale mængde af DNA dispenseret, sandsynligvis på grund af denne Fænomen. Derfor anbefaler vi at bruge en plasmid fortynding på 100 ng/μL for de bedste resultater, selv om andre koncentrationer kan testes for brugernemheds skyld. For at sikre korrekt ADE med den bruger-nødvendige DNA-koncentration kan et farvestof tilsættes til opløsningen for at overvåge dråbe udslyngning i brøndene eller endnu bedre på plade låget. Som den præsenterede protokol første mål var at opnå høj gennemløb, billige minicolumn-baserede plasmid DNA minipreparation kits kompatible med plade-baserede High-gennemløb plasmid rensning protokoller blev brugt. Der henviser til, at det fungerede korrekt under forsøget, i tilfælde af lav effektivitet og dårlig cellelevedygtighed efter transfection, anbefales det at anvende højere kvalitet DNA rensningsmetoder såsom MIDI-eller Maxi-præparater eller endda endotoxin-fri kommercielt tilgængelige kits, der ville sikre en bedre DNA-renhed og lavere toksicitet for cellerne33.

Fejlfinding af inhomogen celle transfektering over brønd overfladen

Første forsøg, når du konfigurerer protokollen førte til celle transfektering kun i midten af brøndene, hvor dråberne blev sendt af ade. Vi bemærkede faktisk, at DNA-og transfektering-blandingen ikke spredte sig over overfladen og tørring før celle tilsætning på grund af de lave volumener dispenseret (knap 500 NL). For at omgå dette problem blev der tilføjet et fortyndings trin for fortynding for at tillade, at DNA/TR-blandingen spredes over brøndene før celle tilsætning. Dette resulterede i en homogen celle transfektering i brønden. Ved gengivelse af eksperimentet og DNA/TR-blandingen spredes således ikke over brøndene, kan fortyndings volumenet justeres i henhold til brugerens behov.

Da den akustiske væske handler kan distribuere volumener i nanoliter området, har den beskrevne metode potentielt ingen tekniske begrænsninger. Vi bemærkede dog, at vandfyldte brønde er genstand for fordampning, hvilket kunne udgøre en begrænsning. Hvis de nøjagtige volumener, der skal udleveres, sænkes ved denne fordampning, vil nanodispensering ikke blive udført til den forventede ende. I dette tilfælde genereres en fejlrapport af nanodispenseren. For at omgå dette problem skal du bruge større mængder end forventet, mens du opholder dig i det acceptable øvre område (ja, lavere end 12 μL). Men hvis fordampning fører til forringelse af nogle dispenseringer, genereres en fejlrapport af nanodispenseren. Denne fil kan bruges til at fylde kilde pladen med ny reagens, der skal udleveres på de pågældende bestemmelses brønde. At gøre dette i et kort tidsinterval syntes ikke at forringe transfektering effektivitet.

Den protokol, der er beskrevet her, er den første til at opnå et sådant gennemløb for uafhængige DNA plasmid transfections. Bedste priser nået før var for 288 forskellige betingelser, der krævede højt specialiserede færdigheder, der skal udføres samtidigt15. Dette, bortset fra sin høje gennemløb, den nuværende protokol har andre betydelige fordele som den samlede proces er blevet optimeret til at tillade dets anvendelse af ikke-specialister og værktøjer er blevet udviklet for at undgå fejl, nemlig i) en dedikeret regneark makro giver den nemme udformning af den eksperimentelle skabelon, II) den automatiske generering af den tilsvarende DNA og transfektering reagens kilde plade (s) skabelon af denne makro, III) generation af to klar-til-brug filer til at styre software-drevne dispenseringer af DNA og transfektering reagens af nanodispenser anordningen, og IV) eksport af en "384-Well pipette Rings guide"-fil, der svarer til de (t) anvendte kilde plade (r), som skal anvendes af en dedikeret tablet-baseret applikation, der også er udviklet for at undgå menneskelige fejl, mens dispensering i 384-brønd kilde pladen (-erne).

Fremtidige forbedringer af protokollen

For at øge gennemløb og reproducerbarhed kan kilde pladen fyldt med plasmider opbevares ved 4 °C eller frossen som sædvanlig for DNA-stamopløsninger. Desuden viste vi, at den forudindlæste destinations plade med DNA også kan opbevares tørt eller frosset i mindst 7 dage, før der tilføjes transfektering reagens og celler, hvilket fører til en forbedring af den samlede gennemstrømning og lethed af protokollen. DNA-bevaring i mere end 4 år er tidligere blevet rapporteret ved hjælp af optimerede medier34 og bør derfor testes i forbindelse med denne protokol, da det vil skubbe det et skridt videre, hvilket muliggør langtidsopbevaring af plader fyldt med banker af plasmider og klar til brug i transfektering eksperimenter.

Vi har tidligere vist, at de identificerede optimale transfektering betingelser kunne overføres til større eksperimenter, fra 96-godt til 10 cm kultur retter1, ved at beregne DNA-mængden, transfektering reagens volumen og celletæthed, der bør anvendes baseret på den optimerede 384-brønd plade protokol. Som 1536-Well Plate dispensation er håndterbar af nanodispenser også, protokollen kan også udføres på en lavere skala, og dermed øge dens gennemløb. Men en væsentlig begrænsning for at nå dette format er evnen til at dispensere celler og styre den endelige læsning i et sådant miniaturiserede format. Celle dispensering af ADE er allerede blevet udført med succes i 1536-Well Plate format35 ved hjælp af en opløsning af neutral tæthed, der forhindrede celle såning og sikrede lige celletæthed i tid. Baseret på det anvendte celle nummer og overflade forholdet på 384 (0,056 cm2) versus 1536 brønde (0,025 cm2), ville 500-650 celler blive dispenseret i dette sidste format. En sådan celle dispensation nummerinterval har vist sig at være meget pålidelig, hvis 14%-18% koncentreret opløsning af neutral tæthed anvendes. Under disse indstillinger, 100 nL af cellesuspension ville blive fordelt over 1536 brønde. Med en fungerende opløsning på 5-8 μL i sådanne brønde vil tilsætning af 5-8 μL af dyrkningsmediet ved hjælp af klassiske peristaltiske væske handlere fortynde antiseeding opløsningen til mindre end 0,3%, hvilket giver mulighed for korrekt celle såning. Det forekommer derfor teknisk muligt at transftere celler i så lav målestok. virkningen af restkoncentrationen af opløsningen med neutral tæthed på transftionseffekten vil dog fortsat afhænge af det videre arbejde.

Brug af kilde plade typer, der bærer højere arbejdsmængder til at dispensere celler, såsom 384-brønd polypropylenplader med en fungerende volumen på 45 μL, ville tillade 100 nL-celle opløsning dispenseringer fra kun fire kilde brønde for en samlet 1536-brønd plade. Desuden er nye nanodispensere i stand til at udlevere dråber på 25 nL i stedet for 2,5 nL, der blev anvendt i denne protokol. Denne Dråbestørrelse dividerer derefter 10-fold dispenserings tiden, men indebærer at bruge et multiplum af 25 nL-volumener, som dog forbliver forenelige med de forskellige mængder, der er udleveret i den her forelagte protokol.

Baseret på disse nyeste værker og teknologiske forbedringer, en yderligere ade celle dispenserings trin for at opnå en 1536-brønd plade transfektering kunne nemt føjes til den nuværende protokol. Men at nå sådanne miniaturiseringer er kun det værd, hvis bioassay er samtidig muligt i en sådan miniaturiserede format.

Afslutningsvis har vi udviklet en nem, høj gennemløb og nøjagtig transfektering metode bærer flere fordele på grund af miniaturization: (1) sænke omkostningerne ved transfektering reagens; 2) reduktion af spild af DNA-præparater (3) at sikre, at selv begyndere kan udføre celle transfection. Faktisk kræver det kun et par nemme manuelle trin, nemlig fortynding af DNA til 100 ng/μL, dispensering af det på en kilde plade (et plasmid/brønd) i henhold til den regnearks genererede skabelon og ved hjælp af den tabletbaserede pipette Rings vejledning og klargøring af cellesuspensionen før såning. Den ADE-baserede nanodispenser er ansvarlig for den tidskrævende og fejlbehæftede dosis levering og multiplexing af plasmiderne, i henhold til den givne skabelon for eksperimentet.

Der henviser til, at denne protokol kunne sikre de fleste af de grundlæggende biologiske hensigter med klassiske transfektering eksperimenter, men at den også kunne åbne op for nye metoder til array-baserede eksperimenter. For eksempel, at udtrykke eller banke ned hvert humant protein-kodning gen fra Human ORFeome Collection36 eller Crispr-Cas9 Library-baserede tilgange37, ville kræve mindre end 24 h på en dedikeret automatiseret platform (53 x 384- godt plader), snarere end 2-3 dage af menneskeligt arbejde, under forudsætning af brug af en DNA-Preloaded plade bank. På grund af sin høje effektivitet og høj gennemløb ydeevne, protokollen præsenteres her kan endda være i stand til at opnå nye ikke-poolet tilgange til CRISPR-Cas9 baseret-studier med gRNA biblioteker/CRISPR-Cas9-udtrykke Plasmids. Faktisk milde cellulære fænotype ændringer, som i øjeblikket ikke kan tillade den nødvendige celle-sortering skridt, ville endelig være håndterbare, som en brønd ville repræsentere en banket gen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne offentliggjorde en modtagelse af følgende finansielle støtte til forskning, forfatterskab, og/eller offentliggørelse af denne artikel: INSERM, lille University, lille Pasteur Institute, Conseil régional du Nord, og PRIM-HCV1 og 2 (pôle de Recherche Interdisciplinaire Sur Le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og det Europæiske Fællesskab (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). Forfatterne vil gerne takke Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément og Dr. H. Groult for deres kritiske gennemgang og rettelser af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

Tilbagetrækning akustisk dråbe udslyngning høj gennemløb transfection DNA plasmid pattedyrsceller Væskehåndtering fluorescerende protein
High-gennemløb DNA plasmid multiplexing og Transfection ved hjælp af akustisk Nanodispenserings teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,… More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter