Multiplexación y transfección de plasmión de ADN de alto rendimiento mediante tecnología de nanodispensación acústica

Summary

Este protocolo describe la transfección de plásmido de alto rendimiento de células de mamíferos en una placa de 384 pocillos utilizando tecnología de eyección de gotas acústicas. La dispensación y multiplexación de ADN, que consume mucho tiempo y propensa a errores, pero también la dosificación del reactivo de transfección, son impulsadas por software y realizadas por un dispositivo de nanodispensador. Las células son sembradas en estos pozos precargados.

Abstract

La transfección celular, indispensable para muchos estudios biológicos, requiere controlar muchos parámetros para un logro preciso y exitoso. La mayoría de las veces se realiza a bajo rendimiento, además es lento y propenso a errores, aún más cuando multiplexa varios plásmidos. Hemos desarrollado un método fácil, rápido y preciso para realizar la transfección celular en un diseño de placa de 384 pocillos utilizando la tecnología de eyección de gotas acústicas (ADE). El dispositivo de nanodispensador utilizado en este estudio se basa en esta tecnología y permite la entrega precisa de nanovolúmenes a alta velocidad desde una placa de pozo de origen a una placa de destino. Puede dispensar y multiplexar ADN y reactivo de transfección de acuerdo con una hoja de cálculo prediseñada. Aquí presentamos un protocolo óptimo para realizar la transfección de plásmido de alto rendimiento basada en ADE que permite alcanzar una eficiencia de hasta el 90% y una cotransfección de casi el 100% en experimentos de cotransfección. Ampliamos el trabajo inicial proponiendo una macro basada en hojas de cálculo fácil de usar, capaz de administrar hasta cuatro plásmidos/pozos de una biblioteca que contiene hasta 1.536 plásmidos diferentes, y una aplicación de guía de pipeteo basada en tabletas. La macro diseña las plantillas necesarias de las placas de origen y genera los archivos listos para usar para la aplicación basada en nanodispensador y tableta. El protocolo de transfección de cuatro pasos implica i) un diluyente dispense con un manipulador de líquidos clásico, ii) distribución y multiplexación de plásmidos, iii) un reactivo de transfección dispensando por el nanodispensador, y iv) chapado celular en los pozos precargados. El control basado en software descrito de multiplexación y transfección de plástidos ADE permite incluso a los no especialistas en el campo realizar una transfección celular confiable de una manera rápida y segura. Este método permite una rápida identificación de la configuración óptima para un tipo de celda determinado y se puede transponer a enfoques manuales y de mayor escala. El protocolo facilita aplicaciones, como la proteína ORFeome humana (conjunto de marcos de lectura abiertos [ORF] en un genoma) o la validación de la función génica basada en CRISPR-Cas9, en estrategias de cribado no agrupadas.

Introduction

El método presentado aquí describe en detalle cómo realizar multiplexación y transfección de plásmido de ADN en células de mamíferos a alto rendimiento utilizando un nanodispensador líquido de base acústica en una placa de 384 pocillos, incluso para no especialistas en el campo. Este método publicado recientemente¹ permite realizar hasta 384 condiciones independientes de multiplexación y transfección de ADN plásmido en un experimento, en menos de 1 h. Los experimentos individuales o de cotransfección tuvieron éxito, alcanzando un cotransfección dentro de la población de células transtrinfectadas. Este protocolo facilita la transfección porque la mayoría de los pasos tediosos, lentos y propensos a errores ahora son controlados por software (consulte la figura 1 para obtener una visión general). Se han hecho más esfuerzos para desarrollar herramientas específicas para mejorar la facilidad de uso evitando al mismo tiempo errores humanos durante el proceso general y para promover la transfección exitosa incluso para los no especialistas en la materia. El protocolo descrito incluye una hoja de cálculo macro “fácil de usar” que hemos desarrollado con el fin de gestionar 384 condiciones de transfección independientes con posibilidades de multiplexación de hasta cuatro plásmidos en cada pozo. La macro genera automáticamente plantillas de las placas de origen para cargar el volumen de plásmido de ADN esperado desde el inicio de las soluciones de stock y los archivos necesarios para conducir el software nanodispensador sobre el diseño experimental que se ha introducido. Como la dosificación manual del ADN en una placa fuente de 384 pocillos es tediosa y propensa a errores, también desarrollamos una aplicación dedicada a la tableta para guiar al usuario mientras dispensamos la solución de ADN de acuerdo con la plantilla.

Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Representación esquemática del protocolo automatizado óptimo de transfección inversa de alto rendimiento (desde el diseño experimental hasta el ensayo biológico personalizado). Los pasos manuales se indican mediante el símbolo de la mano y la hora aproximada de cada paso se escribe en un cuadro rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muchos experimentos basados en células comienzan con la transfección de ADN de plásmido, e incluso si muchos reactivos dedicados han sido y todavía se están desarrollando para mejorar la eficiencia de la transfección y / o facilitar el procedimiento, queda mucho por hacer^{2,3 , 4}. La transfección celular de plásmido de ADN implica varios pasos para alcanzar una alta eficiencia, como una toma compleja inicial, escape endosomal y transporte citoplasmático al núcleo^5,6. Además de la precipitación de calcio o técnicas físicas como la electroporación o la microinyección utilizando dispositivos dedicados⁷, los métodos químicos modernos se han centrado en mejorar la entrega de células de ADN mientras se reduce la toxicidad celular^{8, 9}. El uso de lípidos o polímeros catiónicos que forman complejos liposomas y, más recientemente, sistemas de química polimérica no liposómica ha hecho que la transfección sea más fácil y eficiente^10. A pesar de estos avances, la transfección celular todavía requiere habilidades específicas para ser realizadas con precisión, ya que la mayoría de estos protocolos de transfección física o química requieren que los científicos preparen manualmente cada condición de reacción de transfección de ADN, por lo tanto deteriorando el rendimiento. Para evitar este problema, se han desarrollado protocolos de transfección inversa utilizando reactivos de transfección química^11,12,13,lo que permite al usuario probar o combinar varios plásmidos de una manera más rápida. En estos protocolos, se forman complejos de ácido nucleico con reactivos de transfección antes de sembrar las células en los complejos. Sin embargo, estos protocolos inversos siguen estando limitados por el manejo manual de las soluciones de ADN y por la combinación de cada una de las condiciones independientes. Aunque es factible realizarlos en un formato de placa de 96 pocillos, la preparación del ADN y los dispensadores serán tediosos, y es probable que haya errores. Cuando se requieren diferentes cantidades de varios plásmidos de ADN y se multiplexan entre sí, la transfección celular se vuelve aún más difícil de lograr y consume más tiempo, y los errores humanos se vuelven bastante inevitables. Escalar hasta el formato de placa de 384 pocillos en un enfoque de transfección inversa, a pesar de las pocas condiciones de transfección de ADN multiplexado, se convierte en un desafío imposible debido a las siguientes razones. i) Las cantidades de ADN, el reactivo de transfección o los volúmenes de mezcla de reacción que se deben manejar son inferiores a 1 l para cada poca. ii) La multiplexación de plásmidos para 384 condiciones independientes se vuelve extremadamente complicada. La entrega en cada uno de los 384 pozos también es iii) muy lento y iv) propenso a errores. De hecho, la dispensación de la solución correcta en los pozos esperados es difícil de gestionar porque los volúmenes bajos ya dispensados no permiten la supervisión visual entre los pozos vacíos y ya llenos. v) Por último, existe un alto riesgo de secado de la mezcla por evaporación antes de que se añadan las células debido al tiempo necesario para realizar los pasos de dosificación necesarios. En resumen, el factor limitante para configurar ensayos de transfección de plaños de ADN de alto rendimiento parece ser la miniaturización del ensayo, lo que implica multiplexación y gestión de bajo volumen que ya no se puede manejar manualmente, pero que tampoco se pueden lograr en un forma fiable por los manipuladores de líquidos peristáticos clásicos.

Como prueba de dificultad para automatizar tales ensayos y obtener un alto rendimiento, sólo unos pocos intentos de automatizar la transfección se han publicado hasta ahora: un formato de placa de 96 pocillos utilizando un dispositivo comercial de manipulación de líquidos y precipitación de fosfato cálcico¹⁴ y, más recientemente, un reactivo lipoplex, y un chip microfluídico que permite 280 transfecciones independientes¹⁵ pero que requieren habilidades especializadas en este campo. Otro método, la acoustopforesis, que permitía la levitación de líquidos y que conducía a la manipulación y mezcla de fluidos, se utilizó para realizar la transfección de ADN en formatos de placa de 24 a 96 pocillos^16. Aunque es factible, este enfoque sufre de un rendimiento extremadamente bajo, ya que la mezcla de células con mezcla de transfección de ADN requiere una incubación de 60 s para cada punto antes de la sembración. Esto implica una duración de al menos 96 minutos para una placa completa de 96 pocillos. Además, este protocolo está lejos de ser susceptible de la audiencia general de los biólogos, ya que este trabajo se realizó con un dispositivo interno diseñado y fabricado que actualmente no está disponible en el mercado. Por el contrario, en los últimos años, una tecnología de dosificación basada en acústica basada en software fácil de usar ha surgido con dispositivos dispensadores de nanovolúmenes. Utilizando energía acústica enfocada, estos dispositivos permiten la expulsión estrechamente controlada de pequeños volúmenes de líquido de 2,5 nL a 500 nL desde una placa de origen hasta un destino^{de 17.} Esta tecnología, llamada eyección de gotas acústicas (ADE), tiene numerosas ventajas: es totalmente automatizada, sin contacto, sin puntas, precisa, precisa y altamente reproducible, y tiene un alto rendimiento^18. Primero dedicado a la entrega de soluciones de dimetilsulfóxido (DMSO), los ajustes se han mejorado para dispensar tampones acuosos¹⁹. Los nanodispensadores acústicos, entonces, parecen adecuados para los protocolos de transfección de células inversas y podrían eludir la mayoría de las limitaciones manuales antes mencionadas. Como no se describieron previamente los intentos de transfección de plásmidos utilizando esta tecnología, recientemente evaluamos la idoneidad de un sistema de dosificación basado en acústica para realizar la transfección de células inversas.

Aprovechando el rendimiento del nanodispensador y la facilidad de uso, optimizamos un protocolo de transfección inversa para las células HeLa mediante pruebas cruzadas de varios parámetros que pueden influir en la transfección del ADN en una placa única de 384 pocillos, a saber, la cantidad total de ADN y concentración inicial del ADN fuente, volumen diluyente, reactivo de transfección y número de células diseminados. El protocolo desarrollado elude las limitaciones manuales de transfección celular antes descritas y presenta varias ventajas sobre otros intentos de transfección automatizados. En primer lugar, se miniaturiza, lo que permite un reactivo de transfección rentable al ahorrar preparaciones de plásmido de ADN y reactivo de transfección. En segundo lugar, es mucho más alto rendimiento y reproducible que el protocolo manual (incluso para principiantes), ya que la transfección de toda una placa de 384 pocillos se puede lograr en menos de 1 h. Por último, está impulsado por software, permitiendo el control de la cantidad de ADN dispensado y la multiplexación de varios plásmidos. De hecho, gracias al software nanodispenser (Tablade Materiales),el usuario puede elaborar un plan de estudio para controlar los volúmenes a dispensar desde una placa de pozo de origen definida a una placa de destino.

El protocolo presentado aquí está destinado principalmente a aquellos que tienen acceso a un nanodispensador y les gustaría establecer experimentos de transfección a alto rendimiento, pero también para aquellos que quieren optimizar rápidamente sus parámetros de transfección para un tipo de celda dado por aplicando este protocolo para probar varios parámetros a un alto rendimiento. De hecho, hemos demostrado que los parámetros optimizados identificados con este protocolo a nanoescala se pueden transponer a experimentos de transfección manuales y a mayor escala. Por último, dado que el reactivo de transfección utilizado en el presente protocolo permite la transfección de ADN o siRNA según el fabricante, el protocolo también es de interés para aquellos que tienen como objetivo realizar enfoques de matriz para la sobreexpresión genética o derribo. Las placas de destino precargadas con ADN se pueden conservar hasta 7 días antes de su uso en un ensayo de transfección sin pérdida de eficacia, que es otra ventaja del siguiente protocolo para este tipo de aplicación.

Protocol

1. Preparaciones anticipadas Preparación de los programas de manipulación de líquidos peristálticosNOTA: Para los pasos de dosificación de diluyentes y células del protocolo, se debe preparar un programa dedicado, teniendo en cuenta la altura del cabezal dispensador a la placa utilizada y la intención del paso. Para el paso de dispensación de diluyente de 1 l, monte un cassette de 1 l y prepare un programa con los ajustes descritos en los pasos 1.1.1.1 y 1.1.1.2. Aju…

Representative Results

fPara determinar si la tecnología ADE podría utilizarse para un protocolo automatizado de transfección inversa, monitoreamos la eficiencia de la transfección celular mediante microscopía de fluorescencia, utilizando un plásmido de expresión tdTomato fluorescente rojo. En primer lugar con el objetivo de determinar los mejores parámetros de transfección, diferentes volúmenes de diluyente y cantidades totales de ADN fueron probados en crucigé. El volumen diluyente se utilizó para…

Discussion

El establecimiento y la optimización de un método preciso de transfección de alto rendimiento para una línea celular determinada requieren que los científicos sigan algunos parámetros clave descritos en esta sección. Recomendamos encarecidamente comenzar con los valores recomendados en todo el protocolo, ya que estos ajustes optimizados para las células HeLa también demostraron ser eficientes para las células HEK. Sin embargo, como los mejores parámetros pueden depender de las líneas celulares y los reactivos…

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter