Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59595
Automatic Translation
1, 1
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Summary

התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.

Abstract

(P) הנוקלאוטיד ppGpp מתפקד כווסת גלובלי בחיידקים בתגובה למגוון רחב של מתח פיזי ותזונתי. יש לו התחלה מהירה, בשניות, אשר מוביל להצטברות של רמות הגישה או לחרוג אלה של בריכות GTP. היפוך מתח מקרים היעלמות מהירה של (p) ppGpp, לעתים קרובות עם מחצית חיים של פחות מדקה. הנוכחות של (p) ppGpp תוצאות שינויים של ביטוי גנים סלולריים ומטבוליזם המונה את ההשפעות המזיקות של מתח. גראם שליליים וחיידקים גראם חיוביים יש מנגנוני תגובה שונים, אבל שניהם תלויים (p) הריכוז ppGpp. בכל מקרה, יש צורך לנטר בו הרבה תרבויות בקטריאלי רדיויניום במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות במהלך תקופות מעבר הלחץ הקריטי. פרוטוקול זה מטפל באתגר הטכני הזה. השיטה מנצלת חממות מבוקרת טמפרטורה ושייקר מבוקרים המאפשרים ניטור מקבילי של הצמיחה (ספיגה) ודגימה מהירה של תרבויות הפוספט האחיד והחד כדי לפתור ולכמת בריכות נוקלאוטיד כרומטוגרפיה בעלת שכבה דקה. בפיי-תאית כמויות קטנות של דגימה נחוצות עבור שכפול טכני וביולוגי מרובים של ניתוחים. מעברים צמיחה מורכבים, כגון הצמיחה diauxic ו מהירה (p) שיעורי המחזור ppGpp ניתן לכמת המוערך על ידי שיטה זו.

Introduction

השליח (p) ppgpp השני הוא מווסת גלובלי המודוללי את הביטוי של מספר רב של גנים, כולל גנים עבור סינתזה הריבוזומים וחומצות אמינו1,2. למרות שהתגלו בתחילה בשנת החיידק הקולי3, (p) ppgpp ניתן למצוא הן בקטריה גראם חיוביים גראם שליליים, כמו גם במפעל כלורפור4,5. עבור E. coli וחיידקים גראם שליליים אחרים, (p) ppgpp אינטראקציה ישירה עם RNA פולימראז בשני אתרים שונים6,7,8. ב גראם חיוביים, (p) ppgpp מעכב gtp שפע, אשר חש על ידי קודי, מחייב gtp חלבון עם מוטיבים לזיהוי דנ א ספציפי גנטי שמוביל תקנה9,10. (p) ppgpp מצטבר בתגובה לרעב עבור חומרים מזינים שונים ותנאי סטרס, וכתוצאה מכך צמיחה איטית והתאמות של ביטוי גנים כדי לאפשר הסתגלות לחץ11,12.

כמות הנטו של ppGpp שנצבר משקפת איזון בין חומרים הידרוקלז לבין פעילויות. ב -E. coli לה היא הבורסה החזקה, והנקודה היא ביותפקודית, עם הידרולז חזק ומגוון של הבורסה החלשה, שכל אחד מהם עשוי להיות מוסדר בצורה שונה באופן תלוי בלחץ. הבורסה החזקה ביותר מופעלת כאשר הזמינות של codon מחויב trna הטעונה לאתר הריבוזומבית כאשר הוא לא מצליח לעמוד בדרישות של סינתזה חלבון13,14,15. כתם חלש (p) ppGpp חומרים הבורסה מופעלת בעוד חזקה (p) ppGpp הידרולז הוא מעוכב בתגובה לתנאי לחץ אחרים דרך מנגנונים אחרים. בתנאים מסוימים, חלבונים כגון ACP או rsd יכול לאגד לספוט, אשר גם לשנות את האיזון בין הידרוליזה וסינתזה16,17. ב גראם תוצאות חיוביות, סינתזה והידרוליזה משקפים איזון מורכב יותר בין החלבון ההומובית היחיד של לה ספוט (RSH) עם סינתזה חזקה ופעילויות הידרוליזה, כמו גם הידרוליסים קטנים ו/או חומרים מטעים12.

The (p) ונוקלאוטידים התגלו לראשונה כמו יוצא דופן 32p המסומנים כתמים הופיעו על אדיגרמות אוטומטית של כרומטוגרמות דק שכבה (חום) במהלך התגובה המחמירים הנגרמת על ידי חומצה אמינית הרעבה3. פרוטוקולים תיוג מפורט יותר נבדקו 18. הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) הוא שינוי של הפרוטוקולים הללו המאפשר בניטור הצמיחה של דגימות מרובות על צלחות microtiter. זה מקל על הערכות ביולוגיות וטכניות מרובות של (p) שינויי שפע ppGpp ופותחה בתחילה למחקרים של משמרות diauxic19. התוויות של (p) ppGpp עם 32p וזיהוי על ידי ומאפשר גם מדידות של (p) שיעורי השפלה ppGpp. שיטות חלופיות פותחו כדי לקבוע (p) רמות ppGpp כגון ספקטרומטר המוני, מיטובי20, כימוטוחיישנים פלורסנט21,22, ו-gfp גן Fusions ליזמים המושפעים על ידי ppgpp23, 24. כימוחיישנים פלורסנט כרגע יש שימוש מוגבל בשל משמרות ספקטרליות קטנות לאחר הכריכה ppgpp, כמו גם בעיות ההבחנה בין ppgpp ו pppGpp21. שיטה זו יעילה כדי לזהות (p) ppGpp ב מבחנה, אבל לא בתמציות הסלולר. שיטות הקשורות לשיטות שופרו ב-20 אך דורשות ציוד יקר ואינן מותאם היטב לרמה גבוהה. לבסוף, GFP fusions יכול לתת הערכה של הפעלה תלויה ppGpp או עיכוב, אבל לא למדוד ppGpp עצמו. בעוד כל אחת השיטות החלופיות הללו הם יקרי ערך, הם דורשים ציוד יקר או הידיים בזמן משמעותי, או שהם בדרך כלל לא קלה לדגימה קינטית מרובים עיבוד הבאים. עם השיטה המתוארת כאן, ניתן להחיל דגימות של 96 על שש צלחות ה-לחות ב-20 דקות (18 דגימות לצלחת), שנפתרה על-ידי התפתחות הפיתוח בפחות מכמה שעות, עם נתונים כמותיים שהתקבלו לאחר מספר שעות או לילה, בהתאם לתיוג עוצמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיה

  1. עבור מגבים (3-(N-שורגואולנו) החומצה propanesulfonic) מדיה25, השתמש 1/10 נפח של מלחי 10 x מלחים, 1/100 נפח של 100x מיקרורונקורט הפתרון, 3 mM נתרן פוספט עבור תרבויות לילה או 0.2 מילימטר נתרן פוספט לתיוג אחיד עם 32P, 0.2% גלוקוז ו-1 μg/mL תיאמין (ויטמין B1). הוסף חומצות אמינו ב-40 μg/mL במידת הצורך.
    1. עבור מלחי מלחים, להשתמש 400 mM מגבים, 40 mM Tricine, 0.1 mM FeSO4, 95 mm NH4Cl, 2.6 mm K2כך4, 5 Μm Cacl2, 10.56 Mm mgcl2, ו 500 מ"מ הנאקל. הוסף את הרכיבים השונים בסדר שנכתב כדי למנוע משקעים. להתאים ל-pH 7.4 עם KOH ולעקר על ידי סינון.
    2. עבור 100x מיקרורונקורט פתרון, השתמש 3 μM (NH4)6(מו 7)24, 0.4 MM H3BO4, 30 μm Cocl2, 10 μm cuso4, 80 μm mncl2, ו-10 μm לבאז4. . לחטא על ידי אוטוקלינג
    3. עבור גלוקוז (20%) ו נתרן פוספט (300 mM) פתרונות, לעקר כמו מניות 100x נפרדות על ידי אוטוקלינג. לעקר 100x מניות של תיאמין ותערובות חומצות אמינו לפי סינון. הכינו מדיה טרייה מפתרונות מניות סטריליים לכל ניסוי.

2. התוויות עם 32P

  1. לגדול בתרבויות הלילה במדיית המנקה עם 3 מ"מ נתרן פוספט.
  2. בצלחת 24 הבאר, להוסיף 550 μL של מדיה של מגבים המכיל 0.2 mM נתרן פוספט המוביל ו 30 μL של כל האינת חיידקים (דילול 1/20). זה יפיק הנפקה ראשונית של OD600nm 0.1. השתמש בטוב אחד עם מדיה טרייה כבקרת עקרות.
  3. מניחים את הצלחת על החממה רועד ב 37 ° צ' לרעוד ב 900 rpm עבור 30 דקות. התרבויות מחוממות מלמטה ומרעידה מספקת מרססים. חבר את הצלחת בחוזקה עם הקלטת כדי למנוע הטיית או נוזלים. צמיחה יכול להיות מפוקח עם צלחת שכפול במקביל במדיה חסרים 32P באמצעות קורא צלחת ו דגירה באותם תנאים.
  4. הוסף 100 μCi לכל טוב של 32P אורטופהונאים (20 μl מ 5 מלאי MCi/mL).
    הערה: ניתן גם לכוונן את כמות הרדיואקטיביות כדי לענות על הצרכים הניסיוניים. עבור רמות נמוכות של הבסיס 100 Μmci עם 0.2 mM הנושאת הספק עובד היטב, אבל עבור מדידה (p) רמות ppGpp צפויים להיות שווה ערך לבריכות GTP, תווית יכול להיות ירד 25 או 50 μCi. ירידה פוספט המוביל מתחת 0.2 mM אינו מומלץ להימנע רמות פוספט להיות מגביל לצמיחה.
    זהירות: 32P הוא איזוטופ פולט β כך להשתמש מיגון ראוי שצוין עבור בטיחות. כל החומר הרדיואקטיבי חייב להיות מסולק כראוי בנקיטת כל אמצעי הזהירות האפשריים.
  5. לגדול בחממה לרעוד עבור 1 כדי 2 טווח (1 h או יותר) כדי לאפשר תווית חיצונית במידה רבה באמצעות בריכות נוקלאוטיד תאיים לפני גרימת לחץ.

3. אינדוקציה של מתח או הרעבה

  1. לגרום למתח באמצעות שיטה של בחירתך, בהתאם לסוג של לחץ למדו, למשל הוספת מעכבי מסלול מטבולית, שינוי טמפרטורה, מעייף החומרים הדרושים, הסטה משמרות המעבר, גרימת לחץ חמצוני, הוספת רעלים, וכו '.
    1. לדוגמה, להוסיף 100 μg/mL ל-valine כדי לגרום לרעב איזולאוצין ב -E. coli K-12 זנים. רמות מוגברת של ppGpp נצפתה לאחר 5 דקות של אינדוקציה.

4. מיצוי הדגימה והפקת ppGpp

  1. הוסף 20 μL של כל דגימת תא המסומנת לצינור 0.2 mL PCR המכיל 20 μL של קרח קר 6 מיקרומטר חומצה.
  2. מניחים מיד את הדגימות בקרח יבש.
  3. שפר את יעילות החילוץ הסלולר על ידי 3 מחזורי הקפאה והפשרה.
  4. רק לפני האיתור פיי תאית כרומאטוגרם שכבה, דגימות צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות מקסימלית לכלוך תא גלולה כדי למנוע לזהות אותו על chromatograms.

5. כרומטוגרפיה של שכבה דקה

  1. עם עיפרון רך, לסמן קו מקור 1 ס מ מהקצה של 20 ס מ x 20 ס מ הלוח התאית והחום של הצלחת כי יש לו 5 ס מ הוסר מלמעלה עם מספריים. החל 5 μL ב-droplet במשטח פיי עבור כל דוגמה. התחל בפיתוח עולה מבלי לאפשר למקום הזה להתייבש, דבר שישפר את הרזולוציה באמצעות מזעור הפסים.
  2. האם התפתחות עולה בטנק עם שכבה של 1.5 M KH2PO4 (pH 3.4) הפתרון רדוד מספיק כדי שהנוזל לא לגעת בנקודת מוצא לדוגמה. לכסות את הטנק עם חותם הדוק אוויר ולאפשר העלייה נוזלי לחלק העליון של גיליון גזוז, 15 ס"מ. כדי להשיג pH 3.4 עבור 1.5 M KH2פו4 פתרון, זה הכרחי להתאים את ה-pH על ידי תוספת של H3po4.
  3. הסר את כרומטוגרם מפותח לחלוטין ואוויר יבש בטמפרטורת החדר.
  4. גזור ולמחוק את החלק העליון (הקדמי pH) של כרומטוגרם המכיל את 32P חינם לתוך פסולת רדיואקטיבית. חלק זה מיוצג בצבע צהוב באיור 2 ובקלות לדמיין תחת אור UV. אם מדידת רק (p) מנוקלאוטידים העוברים לאט יותר GTP, מומלץ להפעיל תקן UV לעין GTP ולאחר מכן לגזור ולמחוק חלק עליון גדול יותר (כל דבר מעל GTP, כפי שמוצג באיור 2).
  5. לחשוף סרטים אדיגרפיות בלילה עם מסך פוספור.
  6. . פתח את הסרט לכידת וכימות האות במסך הזרחן עם פוספואנג'ר.

6. כימות (p) ppGpp

  1. בדיקת כתמים רדיואקטיביים עם תמונה J26,27.
    הערה: כמות (p) ppGpp יכול להיות מנורמל סכום כולל של G נוקלאוטידים שנצפו בכל מדגם (איור 2). אם כמות הרקע היא אחידה, ניתן לחיסור בודד (תיבת 4 מתוך איור 2) כדי לתקן את הרקע. סה כ G הוא סכום של GTP + ppGpp + pppGpp זוהה. נורמליזציה זו מניחה שרמות ה-GMP והתוצר האלקטרוני נמוכות, אשר נכונות ל -E. coli. היחס של נוקלאוטיד נתון ל-total G מספק דרך חשובה לתיקון עבור וריאציות של נפח דגימה שהוחל.

7. מדידה של קצב הדעיכה של ppGpp

הערה: שינוי של פרוטוקול זה מאפשר מדידות של שיעורי ריקבון ppGpp.

  1. לאחר לעורר מתח או רעב לזמן מספיק כדי לאפשר הצטברות ppGpp (שלב 3), להפוך את הלחץ כדי לחסום סינתזה ppGpp המשיך, אשר מאפשר זיהוי של שיעורי הידרוליטיק. ההליך להיפוך יהיה תלוי במתח. לדוגמה, להוסיף 200 μg/mL של כלוראמאנסול כדי להפוך את כל הרעב חומצה אמינית.
  2. שיעורי ריקבון הם בדרך כלל מהירה אך עשוי להשתנות, כך לקחת דגימות כל 20-30 s עד 2 דקות. דגימות תהליך כמו בשלב 4.
  3. לאחר מפותח ומתפתח (כמו בשלב 5) ואת רמות ppGpp שהתקבלו במהלך הזמן, העלילה ppGpp שיורית תוכן על העלילה חצי לוגריתמי לעומת לאפשר ויזואליזציה של שיעורי הסדר אפס של ריקבון, כקו ישר, והערכה של מחצית חיים ppGpp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ב -E. coli K-12 זנים, תוספת ולין מעוררת הרעב אנדוגניים של isoleucine, אשר התוצאות עלייה של רמות ppgpp לאחר 5 דקות3. תאים שגדלו בתוך מגבים המכילים את כל חומצות אמינו למעט ILV היו תוויות עם 32P כפי שצוין באיור 1. פעם אחת, 6 μl של 10 מ"ג/מ"ל l-valine (100 μg/ml ריכוז סופי) נוספה כדי לייצר רעב איזולאוצין. דגימות נלקחו 0 ו 5 דקות לאחר הוספת valine. לאחר 5 דקות (איור 3A), עלייה 2 ו-2.5 מקפלים ברמות של ppgpp ו pppGpp התרחשה. כשליטה שלילית, דגימת שימוש בשלט-רחוק שימש לזיהוי תרכובות אפשריות שלא היו מוונאות במקור 32P. כמו כן, כולל זן ppGpp לקוי (Δ לה Δספוט) כפקד שלילי יכול לעזור זיהוי טוב יותר של נקודות.

היפוך של הרעבה איזולאוצין ניתן להשיג על ידי כלורמפננול, מעכב של סינתזה חלבון, אשר מפחית את הצריכה של מחויב ile-trna ובתורו, משחזר את היחס הגבוה של טעונה trna לא טעונה. הפעלת מערך הבורסה החזקה של לה-תיווך ppGpp בוטלה, אשר מאפשרת מידה של השפלה ppGpp בלתי מודאג על ידי סינתזה שיורית. לכן, 200 μg/mL של כלורמפננול נוספה לתרבויות מורעבים ודגימות נלקחו במרווחי זמן של 20 לאחר מכן. במקרה זה, ppGpp התפורר עם מחצית חיים של אודות 64 s (איור 3B).

Figure 1
איור 1: מדידה של ppGpp על ידי זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול כדי לחלץ את הטופס ppGpp בקטריאלי והזיהוי האחורי שלה על ידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח מייצג. ייצוג סכמטי של התוצאות שהושגו לאחר המסך האוטומטי והפוספור לילה עם האהבה. הנקודות שיש למדוד מוצגות באדום. הנוסחה לחישוב כמות השבר של ppGpp מוצגת גם כן. סה כ G מתייחס לכמות הכוללת של GTP + ppGpp + pppGpp שאותרו במדגם. הלהקה הצהובה מייצגת את חזית ה-pH הנראית תחת אור UV. מספריים מצביעים על היכן אנו ממליצים לחתוך את הכרואטוגרמה להשליך את רוב הרדיואקטיביות. החץ מציין את כיוון הזרימה במהלך פיתוח עולה עם מאגר פוספט 1.5 M. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידה של סינתזה וריקבון של ppGpp. (א) זיהוי של ppGpp על ידי אהבה עבור דגימות 0 ו 5 דקות לאחר הוספת valine. כתמים המתאימים GTP, ppGpp ו pppGpp מסומנים. תרבות ללא תא נכללה כשליטה שלילית (C-). (ב) הדעיכה של ppGpp לאחר הוספת כלורמפאנסול להפוך רעב חומצה אמינית. מחצית החיים של ppGpp נקבע מקצב הריקבון האקספוננציאלי המיוצג על-ידי קווים מנוקדים. קווי שגיאה משקפים את SD מכפילויות. ציר Y מיוצג בקנה מידה של seמילוגitmic (יומן רישום2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השגת התווית האחידה של התאים היא צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. לפיכך, השימוש במדיה מוגדרת, כגון מדיה מסוג מגבים או טריס, הינו חיוני כדי לאפשר וריאציה של ריכוזי פוספט לנושא ופעילות מסוימת. אין אפשרות להשתמש באמצעי מדיה מואגור פוספט, כגון M9 או מדיה A. רוב המדיה הלא מוגדרת מכילה כמויות משתנים של פוספט, כגון LB, טריטונים וחומצות קאמידיות. איזוטופ פוספט 33p הוא פולט חלשה יותר שניתן להחליף עבור 32P. היתרונות של ההחלפה הם שהוא בטוח יותר ויש לו מחצית חיים של 25 ימים במקום 14 ימים עבור 32P. עם זאת, פליטות אנרגטיות יותר של 32P לשפר במידה ניכרת את הרגישות לזיהוי. חשוב להדגיש את הסכנות של עבודה עם איזוטופים ואת החשיבות של שימוש הגנות הגנה נאותה לסילוק. התגלית האחרונה של הריבופס מסוגל לזהות במיוחד ppGpp28 עשוי יום אחד להוביל בדרך בטוחה יותר כדי לזהות ppgpp ב מבחנה ו vivo. כפי שהוזכר במבוא, שיטות אחרות קיימות, למרות שהשימוש בתוויות פוספט נשאר מאוד רגיש, גישה ישירה ומהירה עבור מדידות דרך-לשים של חיידקי (p) ppGpp כמו גם אחרים פוספט התווית תרכובות, כגון ribo-או בריכות-NTP, PRPP, PPi או מלחי סוכר.

צעד קריטי נוסף הוא להבטיח שצמיחת התרבויות המקבילות (לחיצת החממה וקורא הצלחות) דומה. כאשר לומדים תשישות מזינים, כגון משמרת diauxic19, הסנכרון בין התרבויות היא חיונית. השוואת היכולת של צמיחה על מתויג ולוחות ללא תווית ניתן להעריך על ידי OD600 מדידות של באר ללא תווית על הלוח הרדיואקטיבי אחרת. כדי להגדיל את מספר הדגימות נבדק, 96 צלחת הבאר ניתן להשתמש במקום 19, אבל את כמות המדיה הנדרשת כדי למזער אידוי תפחית את מדיית התרבות. רמות בסיס של (p) ppGpp יהיה מעט גבוה יותר במהלך הצמיחה ב 96 צלחת טוב לעומת הצלחת 24 הבאר בשל האנטנה מופחתת. לפיכך, למדידת רמות בסיס, מומלץ לעשות הרבה מאוד צמיחה של 24 צלחות. כדי למדוד וריאציות של רמות המושרה יותר (p) ppGpp, 96 צלחת הבאר הוא המועדף. הבחירה בין 24 ו 96 הצלחות מיקרוטיטר היטב תלויה במטרה הניסיונית.

וריאציות של פרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים רבים עבור תנאים שונים של לחץ. לאחרונה יש לנו להחיל אותו למדוד הצטברות וריקבון של ppGpp במהלך משמרות diauxic קלאסית מ גלוקוז ללקטוז וסוכרים חלופיים אחרים. מחקרים אלה חשפו את המעורבות של הרעב הן גלוקוז וחומצת אמינו רעב19. כאן אנו מתארים הרעבה חומצה אמינית הנגרמת על ידי ולין ב -E. coli K12 זנים כמצב לחץ פשוט ולמד היטב3. דוגמה זו עשויה לשמש כפקד לפני ביצוע מצבי רעב מסובכים יותר. הרעבה חומצות אמינו יכול להיות מעורר על ידי הוספת כמויות מוגבלות של חומצת אמינו נדרשת כי הוא מותש במהלך הצמיחה; הוספת מעכבי של trna עמינח אכלציה או סינתזה (סרין הידרואמאסאט, mupirocin, או 3-aminotriazole) או עבור E. coli K12 הוספת ולין בהעדר isoleucine). סרין הידרואמאט משמש לעתים קרובות כדי לעכב את tRNASer עמינח, אבל דורש ריכוזים גבוהים, אשר עלולים לגרום לבעיות עקב פעילות מחודשת הידרואמניקה עם תרכובות אחרות. היפוך של ההשפעות סרין הידרואמיב על ידי הוספת כמויות גדולות של סרין יכול להיות השפעות לא רצויות1. למרות SHX הוכח להיות יעיל כאבחון של הייצור ppGpp, אנחנו לא ממליצים על השימוש שלה למחקרים פיסיולוגיים לייצר רעב חומצות אמינו, כי נורמלי (p) ppGpp מנגנוני משוב בוטלו, כגון השלכות פיסיולוגיים להורדת פעילויות מיותרות, אך לאפשר הפעלה של מעגלי הישרדות מתחים.

שינויים של הליכים ולכן המתוארים כאן נחוצים כדי להפריד כראוי נוקלאוטידים הרגולציה שאינם קאנוניים, כגון (p) ppApp29, מתוך דגימות מעורבות עם (p) ppGpp. הוכח כי pppapp יש תפקיד עוינת כדי pppapp ב מבחנה30,31; לכן, הפרדה טובה יותר של שני תרכובות נדרש ללימודים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך בתוכנית מחקר הפנים, יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)6(MO7)24 Fisher Scientifics A-674
Autoradiography film Denville scientific inc. E3218
CaCl2 J.T.Baker 1-1309
Chloramphenicol RPI C61000-25.0
CoCl2 Fisher Scientifics C-371
CuSO4 J.T.Baker 1843
FeSO4 Fisher Scientifics I-146
Formic acid Fisher Biotech BP1215-500
Glucose Macron 4912-12
H3BO4 Macron 2549-04
H3PO4 J.T.Baker 0260-02
K2SO4 Sigma P9458-250G
KH2PO4 Fisher Biotech BP362-500
L-Valine Sigma V-6504
MgCl2 Fisher Scientifics FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT Biotek Synergy HT
MnCl2 Sigma M-9522
MOPS Sigma M1254-1KG
Na2HPO4 Mallinckrodt 7892
NaCl J.T.Baker 3624-01
NaH2PO4 Mallinckrodt 7917
NH4Cl Sigma A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) Perkin Elmer NEX053005MC
Storage phosphor screen Kodak So230
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Thiamine Sigma T-4625
TLC PEI Cellulose F Merk-Millipore 1.05579.0001
Tricine RPI T2400-500.0
Typhoon 9400 imager GE Healthcare
ZnSO4 Fisher Scientifics Z-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
  2. Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
  3. Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
  4. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
  5. Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
  6. Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
  7. Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
  8. Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
  9. Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
  10. Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
  11. Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  12. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
  13. Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
  14. Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
  15. Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
  16. Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
  17. Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
  18. Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
  19. Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
  20. Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
  21. Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
  22. Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
  23. Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
  24. Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
  25. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
  29. Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
  30. Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
  31. Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).

Tags

ביולוגיה סוגיה 148 (p) ppGpp בשכבה דקה כרומטוגרפיה 32p האנאנכיה קולי תפוקה גבוהה שליח שני
באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של <em>es, coli</em> (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández-Coll, L., Cashel, M.… More

Fernández-Coll, L., Cashel, M. Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (148), e59595, doi:10.3791/59595 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter