Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anvendelse af Mikrotiterparabol Radiolabeling til flere in vivo-målinger af Escherichia coli (p) ppGpp efterfulgt af Tyndtlagkromatografi

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59595
Automatic Translation
1, 1
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Summary

Væksten af radioaktivt mærkede bakterielle kulturer i mikrotiterretter letter høj gennemløb prøvetagning, der giver mulighed for flere tekniske og biologiske replikat analyser af nukleotid pool overflod, herunder af (p) ppGpp. Virkningerne af vækst overgange fremkaldt af kilder til fysiologisk stress samt genopretning efter stress kan overvåges.

Abstract

Den (p) ppGpp nucleotid fungerer som en global regulator i bakterier som reaktion på en række fysiske og ernæringsmæssige stress. Det har en hurtig debut, i sekunder, hvilket fører til ophobning af niveauer, der nærmer sig eller overstiger dem af GTP puljer. Stress vending lejligheder en hurtig forsvinden af (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre end et minut. Tilstedeværelsen af (p) ppGpp resulterer i ændringer af cellulære genekspression og metabolisme, der modvirker de skadelige virkninger af stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskellige responsmekanismer, men begge afhænger af (p) ppGpp koncentration. Under alle omstændigheder er der et behov for samtidig at overvåge mange radioaktivt mærkede bakterielle kulturer med tidsintervaller, der kan variere fra 10 sekunder til timer i kritiske stress overgangsperioder. Denne protokol omhandler denne tekniske udfordring. Metoden udnytter temperatur-og shaker-kontrollerede mikrotiterparabol inkubatorer, der muliggør parallel overvågning af vækst (absorbans) og hurtig prøvetagning af ensartet fosfat-radioaktivt mærkede kulturer for at løse og kvantificere nukleotidpuljer ved tyndtlagskromatografi på PEI-cellulose. Der kræves små mængder prøve til flere tekniske og biologiske replikater af analyser. Komplekse vækst overgange, såsom diauxic Growth og Rapid (p) ppGpp omsætnings rater kan kvantitativt vurderes ved denne metode.

Introduction

Den (p) ppgpp anden Messenger er en global regulator, der modulerer ekspression af et stort antal gener, herunder gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om det oprindeligt blev opdaget i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan findes i både grampositive og gramnegative bakterier samt i plante chloroplaster4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppgpp interagerer direkte med RNA polymerase på to forskellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppgpp hæmmer GTP overflod, som er fornemmede af CodY, en GTP-binding protein med gen-specifikke DNA-genkendelse motiver, der fører til regel9,10. p) ppgpp akkumuleres som reaktion på hungersnød for forskellige næringsstoffer og stressforhold, hvilket resulterer i langsom vækst og justeringer af genekspression for at muliggøre tilpasning til stress11,12.

Nettomængden af akkumuleret ppGpp afspejler en balance mellem syntetase-og hydrolase aktiviteter. I E. coli RelA er en stærk syntetase og SpoT er bifunktionel, med en stærk hydrolase og en svag syntetase, som hver især kan reguleres forskelligt på en stress afhængig måde. Den stærke RelA-syntetase aktiveres, når tilgængeligheden af codon-specificerede ladede tRNA bundet til ribosomale et sted, når det undlader at holde trit med kravene i proteinsyntese13,14,15. Den svage SpoT (p) ppgpp syntetase er aktiveret, mens den stærke (p) ppgpp hydrolase er hæmmet som reaktion på andre stress betingelser og gennem andre mekanismer. Under visse omstændigheder kan proteiner som ACP eller RSD binde sig til SpoT, hvilket også ændrer balancen mellem hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver afspejler syntese og hydrolyse en mere kompleks balance mellem et enkelt RelA SpoT ligner (rsh) protein med stærke syntese-og hydrolyse aktiviteter samt mindre hydrolaser og/eller synthetaser12.

(P) ppgpp nukleotider blev først opdaget som usædvanlige 32p mærkede pletter, der dukkede op på autoradiogrammer af tyndtlagkromatogrammer (TLC) under en streng respons induceret af aminosyre sult3. Mere detaljerede mærknings protokoller er blevet anmeldt 18. Den protokol, der er beskrevet her (figur 1), er en ændring af disse protokoller, som gør det muligt at overvåge væksten af flere prøver på mikrotiterplader. Dette letter flere biologiske og tekniske skøn over (p) ppGpp overflod ændringer og blev oprindeligt udviklet til studier af diauxic Skift19. Mærkning af (p) ppGpp med 32p og påvisning af TLC muliggør også målinger af (p) ppgpp-nedbrydnings rater. Alternative metoder er blevet udviklet til at bestemme (p) ppGpp-niveauer såsom massespektrometri, HPLC20, fluorescerende kemo sensorer21,22og gfp-genfusioner til initiativtagere, som berøres af ppgpp23, 24. fluorescerende kemo sensorer har i øjeblikket begrænset brug på grund af små spektral forskydninger efter binding af ppgpp samt problemer med at skelne mellem ppgpp og pppgpp21. Denne metode er effektiv til at opdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder, der involverer HPLC er blevet forbedret20 men kræver dyrt udstyr og er ikke godt tilpasset til høj gennem-Put. Endelig kan GFP-fusioner give et estimat af ppGpp-afhængig aktivering eller hæmning, men måler ikke ppGpp selv. Mens hver af disse alternative metoder er værdifulde, de kræver dyrt udstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke modtagelig for flere kinetiske prøvetagning og efterfølgende behandling. Med den metode, der er beskrevet her, kan 96 prøver anvendes på seks TLC-plader i ca. 20 minutter (18 prøver pr. plade), løst ved TLC-udvikling på mindre end et par timer, med kvantitative data opnået efter flere timer eller natten, afhængigt af mærkning Intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af medierne

  1. For MOPS (3-(N-morpholino) propansulfonsyre) Media25, brug 1/10 volumen af 10X Mops salte, 1/100 volumen af 100x mikronæringsstoffer opløsning, 3 mm natriumfosfat til overnight kulturer eller 0,2 mm natriumfosfat til ensartet mærkning med 32P, 0,2% glucose og 1 μg/mL thiamin (vitamin B1). Tilsæt aminosyrer ved 40 μg/mL, hvis det er nødvendigt.
    1. For MOPS salte, brug 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4CL, 2,6 mm K2så4,5ΜM CaCl2, 10,56 mm mgcl2og 500 mm NaCl. Tilføj de forskellige komponenter i den rækkefølge, som er skrevet for at undgå udfældning. Juster til pH 7,4 med KOH og Steriliser ved filtrering.
    2. For 100x mikronæringsstoffer opløsning, brug 3 μM (NH4)6(mo7)24, 0,4 mm H3bo4, 30 μM Cocl2, 10 μm CuSO4, 80 μM mncl2, og 10 μM znso4. Steriliseres ved autoklave iser.
    3. For glucose (20%) og natriumphosphat (300 mM), sterilisere som separate 100x bestande ved autoklave. Steriliser 100x bestande af thiamin og aminosyre blandinger ved filtrering. Forbered friske medier fra sterile stamopløsninger til hvert eksperiment.

2. mærkning med 32P

  1. Vokse overnight kulturer i MOPS medier med 3 mM natriumfosfat.
  2. I en 24-brønd plade tilsættes 550 μl Mops-medier, der indeholder 0,2 mm natriumphosphatbæreren og 30 μl af hver bakteriel inokulum (fortynding 1/20). Dette vil producere en indledende inokulum af OD600Nm 0,1. Brug en brønd med friske medier som sterilitetskontrol.
  3. Pladen placeres på en ryste inkubator ved 37 °C omrystning ved 900 rpm i 30 min. kulturer opvarmes nedefra, og rystning giver beluftning. Fastgør pladen solidt med tape for at undgå at vippe eller spilde. Væksten kan overvåges med en replikat parallelt i medierne, der mangler 32P ved hjælp af en plade læser og inkubeering under de samme forhold.
  4. Der tilsættes 100 μCi til hver brønd af 32P orthophosphat (20 μl fra en 5 MCi/ml-bestand).
    Bemærk: Mængden af radioaktivitet kan også justeres til at opfylde eksperimentelle behov. For lave basal niveauer 100 μCi med 0,2 mM bæreren fosfat fungerer godt, men til måling (p) ppGpp niveauer, der forventes at blive svarende til GTP puljer, etiketten kan droppes til 25 eller 50 μCi. Sænke bæreren fosfat under 0,2 mM anbefales ikke at undgå fosfat niveauer bliver begrænsende for vækst.
    Forsigtig: 32P er en β-emitterende isotop, så brug korrekt afskærmning specificeret for sikkerhed. Alt radioaktivt materiale skal bortskaffes korrekt under hensyntagen til alle mulige forholdsregler.
  5. Vokse i ryste inkubator for 1 til 2 fordoblinger (1 h eller mere) at tillade ekstern etiket til stort set ækvibrere med intracellulære nukleotid puljer før inducerende stress.

3. induktion af stress eller sult

  1. Inducere stress ved hjælp af en metode efter eget valg, afhængigt af den slags stress undersøgt, f. eks tilføje metaboliske pathway hæmmere, skiftende temperatur, udmattende krævede næringsstoffer, Shifting osmolaritet forskydninger, inducerende oxidativ stress, tilsætning af toksiner, etc.
    1. For eksempel tilsættes 100 μg/mL L-valin for at inducere isoleucin-sult i E. coli K-12-stammer. Forhøjede niveauer af ppGpp vil blive observeret efter 5 minutters induktion.

4. prøvetagning og ppGpp-udvinding

  1. Der tilsættes 20 μL af hver mærket celleprøve til et 0,2 mL PCR-rør, som indeholder 20 μL iskold 6 M myresyre.
  2. Anbring straks prøverne i tøris.
  3. Øge cellulære udvinding effektivitet ved 3 cyklusser af frysning og optøning.
  4. Lige før spotte PEI cellulose tynde lag kromatogrammer, centrifuge prøver for 1 min ved maksimal hastighed til pellet celle snavs for at undgå at spotte det på kromatogrammer.

5. tyndtlagskromatografi

  1. Med en blød blyant, markere en oprindelse linje 1 cm fra kanten af 20 cm x 20 cm PEI-cellulose TLC plade, der har haft 5 cm fjernet fra toppen med en saks. Påfør 5 μL som et dråbe i PEI-overfladen for hver prøve. Begynd stigende udvikling uden at tillade dette sted at tørre, hvilket forbedrer opløsningen ved at minimere streaking.
  2. Gør stigende udvikling i en tank med et lag på 1,5 M KH2po4 (pH 3,4) opløsning overfladisk nok, så væsken ikke rører oprindelses prøve stedet. Dæk tanken med en lufttæt forsegling og lad væske opstigning til toppen af det trimmede ark, 15 cm. For at opnå pH 3,4 for en 1,5 M KH2po4 opløsning, er det nødvendigt at justere pH ved tilsætning af H3po4.
  3. Fjern det fuldt udviklede kromatogram og lufttørret ved stuetemperatur.
  4. Skær og kassér den øverste (pH front) del af kromatogrammet, der indeholder det frie 32P, til radioaktivt affald. Denne del er repræsenteret i gul farve i figur 2 og let visualiseret under UV-lys. Hvis måling kun (p) ppgpp nukleotider, at migrere langsommere end GTP, anbefales det at køre en UV-synlig GTP standard og derefter klippe og smide en større øvre del (noget over GTP, som vist i figur 2).
  5. Udsætte autoradiographic film natten over med en fosfor skærm.
  6. Udvikle filmen. Optag og kvantiterer fosfor-skærmsignalet med en phosphoimager.

6. kvantitering af (p) ppGpp

  1. Kvantiterer radioaktive pletter med billede J26,27.
    Bemærk: Mængden af (p) ppGpp kan normaliseres til den samlede mængde G-nukleotider, der er observeret i hver prøve (figur 2). Hvis baggrunds mængden er homogen, kan en enkelt blank (boks 4 fra figur 2) trækkes til korrekt for baggrund. I alt G er summen af GTP + ppGpp + pppGpp registreret. Denne normalisering forudsætter, at GMP-og BNP-niveauerne er ubetydelige, hvilket gælder for E. coli. Forholdet mellem en given nukleotid og total G giver en vigtig måde at korrigere for variationer af anvendt prøvevolumen.

7. måling af frekvensen af ppGpp forfald

Bemærk: En ændring af denne protokol tillader målinger af ppGpp henfalds rater.

  1. Efter provokerende stress eller sult for en tid nok til at tillade ppGpp ophobning (trin 3), vende stress for at blokere fortsatte ppGpp syntese, som tillader påvisning af hydrolytiske satser. Proceduren for tilbageførsel vil afhænge af stress. For eksempel tilsættes 200 μg/mL chloramphenicol for at vende enhver aminosyren sult.
  2. Henfalds rater er normalt hurtige, men kan variere, så tag prøver hver 20-30 s op til 2 min. proces prøver som i trin 4.
  3. Når TLC er udviklet (som i trin 5) og niveauerne af ppGpp opnået i løbet af tidsforløbet, plot resterende ppGpp indhold på en semi-logaritmisk plot vs tid til at tillade visualisering af nul ordre rater af forfald, som en lige linje, og skøn over ppGpp Half-Life.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I E. coli K-12 stammer, tilsætning af valin provokerer en endogene sult af isoleucin, hvilket resulterer i en stigning i ppGpp niveauer efter 5 min3. Celler dyrket i MOPS indeholdende alle aminosyrer undtagen ILV blev mærket med 32P som angivet i figur 1. Efter mærkningen blev 6 μL af 10 mg/mL L-valin (100 μg/mL endelig koncentration) tilsat for at producere isoleucinsult. Prøverne blev taget 0 og 5 min efter tilsætning af valin. Efter 5 min (figur 3a) forekom der en stigning på 2 og 2,5 gange i niveauerne for ppgpp og pppgpp. Som en negativ kontrol, en celle-fri mærket prøve blev anvendt til at detektere mulige forbindelser, der ikke var orthophosphat i 32P kilde. Også, herunder en ppGpp mangelfuld stamme (ΔrelA ΔspoT) som en negativ kontrol kunne hjælpe en bedre identifikation af pletter.

Tilbageførsel af isoleucin sult kan opnås ved chloramphenicol, en hæmmer af proteinsyntese, som reducerer forbruget af opladet Ile-tRNA og igen, genopretter høje nøgletal for opladet til ikke-opladet tRNA. Aktivering af den stærke RelA-medierede ppgpp-syntetase afskaffes, hvilket gør det muligt at måle ppgpp-nedbrydning ved rest syntese. Derfor blev 200 μg/mL chloramphenicol føjet til de udsultede kulturer, og der blev udtaget prøver efter 20 s intervaller derefter. I dette tilfælde afveg ppGpp med en halveringstid på omkring 64 s (figur 3b).

Figure 1
Figur 1: måling af ppGpp ved TLC workflow. Skematisk gengivelse af protokollen til ekstrakt af ppGpp danner bakterielle kulturer og dens posterior detektion af TLC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativ TLC-analyse. Skematisk gengivelse af de opnåede resultater efter Autoradiografi og fosfor skærm natten over med TLC. De pletter, der skal måles, vises med rødt. Formlen til beregning af brøkdelen af ppGpp vises også. I alt G refererer til den samlede mængde GTP + ppGpp + pppGpp, der er registreret i stikprøven. Det gule bånd repræsenterer pH-fronten, som er synlig under UV-lys. Saks angiver, hvor vi anbefaler at skære kromatogrammet for at kassere det meste af radioaktiviteten. Pilen angiver retningen af flowet under stigende udvikling med 1,5 M fosfatbuffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: måling af syntese og forfald af ppGpp. A) påvisning af ppGpp ved TLC for prøver 0 og 5 minutter efter tilsætning af valin. Steder svarende til GTP, ppGpp og pppGpp er markeret. En celle-fri kultur blev medtaget som negativ kontrol (C-). (B) henfald af ppGpp efter tilsætning af chloramphenicol til at vende aminosyren sult. PpGpp Half-Life bestemmes ud fra den eksponentielle henfalds hastighed, der repræsenteres af punkterede linjer. Fejllinjer afspejler SD fra dubletter. Y-aksen er repræsenteret i en semilogaritmic (log2) skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opnåelse nær ensartet mærkning af cellerne er et afgørende skridt for denne protokol. Derfor er brugen af definerede medier, såsom MOPS eller Tris Media, afgørende for at muliggøre variation af bærers fosfat koncentrationer og specifik aktivitet. Fosfat bufferet medie, såsom M9 eller Media A, kan ikke bruges. De fleste udefineret medier indeholder variable mængder fosfat, såsom LB, trypton og casamino syrer. Fosfat isotop 33p er en svagere udleder, der kan erstattes af 32p. fordelene ved substitution er, at det er sikrere og har en halveringstid på 25 dage i stedet for 14 dage for 32P. Men de mere energiske emissioner af 32P betydeligt øge detekteringsfølsomhed. Det er vigtigt at understrege farerne ved at arbejde med isotoper og betydningen af at bruge ordentlig afskærmning beskyttelse og bortskaffelse. Den nylige opdagelse af en riboswitch i stand til at registrere specifikt ppGpp28 kan en dag føre til en sikrere måde at opdage ppgpp in vitro og in vivo. Som nævnt i indledningen findes der andre metoder, selv om brugen af fosfat mærkning fortsat er en følsom, direkte og hurtig tilgang til gennem-Put målinger af bakterielle (p) ppGpp samt andre fosfat mærkede forbindelser, såsom Ribo-eller deoxyribo-NTP-puljer, PRPP, PPi eller sukker phosphater.

Et andet kritisk skridt er at sikre, at væksten af parallel kulturer (ryste inkubator og plade læser) er ens. Når man studerer næringsstof udmattelse, såsom diauxic Shift19, er Synchrony mellem kulturerne afgørende. Sammenligneligheden af vækst på mærkede og ikke-mærkede plader kan vurderes ved OD600 målinger af en ikke-mærket brønd på den ellers radioaktive plade. For at øge antallet af testede prøver, en 96 brønd plade kan bruges i stedet 19, men mængden af medier, der kræves for at minimere fordampning vil reducere kulturen beluftning. Basal niveauer af (p) ppGpp vil være lidt højere under vækst i en 96 brønd plade sammenlignet med en 24 brønd plade på grund af den reducerede beluftning. Derfor anbefales en 24 brønd plade vækst til måling af basal niveauer. For at måle variationer af mere stærkt induceret (p) ppGpp niveauer, en 96 brønd plade foretrækkes. Valget mellem 24 og 96 brønd mikrotiterplader afhænger af det eksperimentelle mål.

Variationer af denne protokol har mange potentielle anvendelser for forskellige betingelser for stress. For nylig har vi anvendt det til at måle ophobning og henfald af ppGpp under klassiske diauxic forskydninger fra glucose til lactose og til andre alternative sukkerarter. Disse undersøgelser afslørede involvering af både glucose sult og aminosyre sult19. Her beskriver vi aminosyren sult induceret af valin i E. coli K12 stammer som en enklere og godt undersøgt stress betingelse3. Dette eksempel kan bruges som et kontrolelement, før der udføres mere komplicerede sult situationer. Aminosyren sult kan provokeres ved at tilføje begrænsede mængder af en nødvendig aminosyre, der er opbrugt under vækst; tilsætning af en hæmmer af tRNA aminoacylering eller syntese (Serin hydroxamat, mupirocin eller 3-Aminotriazol) eller for E. coli K12 tilsætning af valin i fravær af isoleucin). Serin hydroxamat bruges ofte til at hæmme tRNAser aminoacylation, men kræver høje koncentrationer, som kan forårsage problemer på grund af hydroxamat reaktivitet med andre forbindelser. Revertering af Serin hydroxamat effekter ved at tilføje en stor mængde Serin kan have ikke-ønskede effekter1. Selv om SHX har vist sig at være effektiv som en diagnostisk af ppGpp produktion, anbefaler vi ikke dets anvendelse til fysiologiske undersøgelser til at producere aminosyre sult, fordi normal (p) ppGpp feedbackmekanismer afskaffes, såsom fysiologiske konsekvenser at sænke overflødige aktiviteter, men tillader aktivering af reguleringskredsløb for stress overlevelse.

Ændringer af TLC-procedurerne, der er beskrevet her, er nødvendige for at adskille noncanonical Regulatory nucleotides, såsom (p) ppApp29, fra blandede prøver med (p) ppGpp. Det er blevet påvist, at pppapp har en antagonistisk rolle i forhold til ppgpp in vitro30,31; Derfor kræves der en bedre adskillelse af begge forbindelser i fremtidige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet Intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health og Human Development, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)6(MO7)24 Fisher Scientifics A-674
Autoradiography film Denville scientific inc. E3218
CaCl2 J.T.Baker 1-1309
Chloramphenicol RPI C61000-25.0
CoCl2 Fisher Scientifics C-371
CuSO4 J.T.Baker 1843
FeSO4 Fisher Scientifics I-146
Formic acid Fisher Biotech BP1215-500
Glucose Macron 4912-12
H3BO4 Macron 2549-04
H3PO4 J.T.Baker 0260-02
K2SO4 Sigma P9458-250G
KH2PO4 Fisher Biotech BP362-500
L-Valine Sigma V-6504
MgCl2 Fisher Scientifics FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT Biotek Synergy HT
MnCl2 Sigma M-9522
MOPS Sigma M1254-1KG
Na2HPO4 Mallinckrodt 7892
NaCl J.T.Baker 3624-01
NaH2PO4 Mallinckrodt 7917
NH4Cl Sigma A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) Perkin Elmer NEX053005MC
Storage phosphor screen Kodak So230
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Thiamine Sigma T-4625
TLC PEI Cellulose F Merk-Millipore 1.05579.0001
Tricine RPI T2400-500.0
Typhoon 9400 imager GE Healthcare
ZnSO4 Fisher Scientifics Z-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
  2. Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
  3. Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
  4. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
  5. Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
  6. Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
  7. Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
  8. Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
  9. Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
  10. Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
  11. Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  12. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
  13. Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
  14. Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
  15. Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
  16. Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
  17. Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
  18. Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
  19. Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
  20. Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
  21. Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
  22. Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
  23. Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
  24. Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
  25. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
  29. Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
  30. Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
  31. Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).

Tags

Biologi (p) ppGpp tyndtlagkromatografi 32p Escherichia coli høj gennemløb anden Messenger
Anvendelse af Mikrotiterparabol Radiolabeling til flere in vivo-målinger af <em>Escherichia coli</em> (p) ppGpp efterfulgt af Tyndtlagkromatografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández-Coll, L., Cashel, M.… More

Fernández-Coll, L., Cashel, M. Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (148), e59595, doi:10.3791/59595 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter