Summary
El crecimiento de cultivos bacterianos radiomarcados en platos de microtíteres facilita el muestreo de alto rendimiento que permite múltiples ensayos técnicos y biológicos de réplica de la abundancia de piscinas de nucleótidos, incluyendo el de (p)ppGpp. Los efectos de las transiciones de crecimiento provocadas por fuentes de estrés fisiológico, así como la recuperación del estrés pueden ser monitoreados.
Abstract
El nucleótido (p)ppGpp funciona como regulador global de bacterias en respuesta a una variedad de estrés físico y nutricional. Tiene un inicio rápido, en segundos, que conduce a la acumulación de niveles que se acercan o superan los de las agrupaciones GTP. La inversión del estrés ocasiona una rápida desaparición de (p)ppGpp, a menudo con una vida media de menos de un minuto. La presencia de (p)ppGpp resulta en alteraciones de la expresión génica celular y el metabolismo que contrarrestan los efectos dañinos del estrés. Las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas tienen diferentes mecanismos de respuesta, pero ambos dependen de la concentración de (p)ppGpp. En cualquier caso, es necesario monitorear simultáneamente muchos cultivos bacterianos radiomarcados en intervalos de tiempo que pueden variar de 10 segundos a horas durante los períodos críticos de transición de estrés. Este protocolo aborda este desafío técnico. El método aprovecha las incubadoras de antenas de microtíter controladas por temperatura y agitador que permiten el monitoreo paralelo del crecimiento (absorbancia) y el muestreo rápido de cultivos radiomarcados con fosfato uniforme para resolver y cuantificar piscinas de nucleótidos cromatografía de capa fina en PEI-celulosa. Se necesitan pequeñas cantidades de muestra para múltiples réplicas técnicas y biológicas de análisis. Este método puede evaluar cuantitativamente transiciones complejas de crecimiento, como el crecimiento diónico y las tasas de rotación rápidas (p)ppGpp.
Introduction
El (p)ppGpp segundo mensajero es un regulador global que modula la expresión de un gran número de genes, incluyendo genes para sintetizar ribosomas y aminoácidos1,2. Aunque se descubrió inicialmente en Escherichia coli3, (p)ppGpp se puede encontrar tanto en bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como en cloroplastos vegetales4,5. Para E. coli y otras bacterias Gram-negativas, (p)ppGpp interactúa directamente con ARN polimerasa en dos sitios diferentes6,7,8. En Gram positivos, (p)ppGpp inhibe la abundancia de GTP, que es sentido por CodY, una proteínade unión gta con motivos de reconocimiento de ADN específicos del gen que conducen a la regulación 9,10. (p)ppGpp se acumula en respuesta a la inanición de diferentes nutrientes y condiciones de estrés, lo que resulta en un crecimiento lento y ajustes de la expresión génica para permitir la adaptación al estrés11,12.
La cantidad neta de ppGpp acumulada refleja un equilibrio entre las actividades de sintetasa e hidrolasa. En E. coli RelA es una sintetizadora fuerte y SpoT es bifuncional, con una hidrolasa fuerte y una sintetasa débil, cada uno de los cuales podría ser regulado de manera diferente de una manera dependiente del estrés. La fuerte sintetasa RelA se activa cuando la disponibilidad de tRNA cargado con codón se une al sitio ribosomal A cuando no logra mantenerse al día con las demandas de síntesis de proteínas13,14,15. La débil SpoT (p)ppGpp sintetasa se activa mientras que la fuerte (p)ppGpp hidrolasa se inhibe en respuesta a otras condiciones de estrés y a través de otros mecanismos. En algunas condiciones, proteínas como ACP o Rsd pueden unirse a SpoT, que también cambian el equilibrio entre hidrólisis y síntesis16,17. En Gram positivos, la síntesis y la hidrólisis reflejan un equilibrio más complejo entre una sola proteína de homólogo RelA SpoT (RSH) con fuertes actividades de síntesis e hidrólisis, así como hidrolasas más pequeñas y/o síntesis12.
Los nucleótidos (p)ppGpp fueron descubiertos por primera vez como inusuales manchas etiquetadas de 32P que aparecieron en autoradiogramas de cromatogramas de capa delgada (TLC) durante una respuesta estricta inducida por la inanición de aminoácidos3. Se han revisado los protocolos de etiquetado 18. El protocolo descritoaquí (Figura 1) es una modificación de estos protocolos que permite monitorear el crecimiento de múltiples muestras en placas de microtíter. Esto facilita múltiples estimaciones biológicas y técnicas de (p)ppGpp cambios en la abundancia y fue desarrollado inicialmente para estudios de cambios diauxicos19. El etiquetado de (p)ppGpp con 32P y la detección por TLC también permite mediciones de las tasas de degradación (p)ppGpp. Se han desarrollado métodos alternativos para determinar (p)niveles de ppGpp tales como espectrometría de masas, HPLC20, quimiosensores fluorescentes21,22,y fusiones de genes GFP a promotores afectados por ppGpp23, 24. Los quimiosensores fluorescentes tienen actualmente un uso limitado debido a pequeños cambios espectrales después de la unión de ppGpp, así como problemas de distinción entre ppGpp y pppGpp21. Este método es eficiente para detectar (p)ppGpp in vitro, pero no en extractos celulares. Los métodos que implican HPLC se han mejorado20 pero requieren equipos caros y no están bien adaptados a la alta puesta a través. Por último, las fusiones GFP pueden dar una estimación de la activación o inhibición dependiente de ppGpp, pero no miden ppGpp en sí. Si bien cada uno de estos métodos alternativos son valiosos, requieren equipos costosos o un tiempo de práctica sustancial, o de lo contrario no son susceptibles a múltiples muestreos cinéticos y procesamientos posteriores. Con el método descrito aquí, se pueden aplicar 96 muestras a seis placas TLC en aproximadamente 20 min (18 muestras por placa), resueltas por el desarrollo de TLC en menos de un par de horas, con datos cuantitativos obtenidos después de varias horas o durante la noche, dependiendo del etiquetado Intensidad.
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Protocol
1. Preparación de medios
-
Para los medios MOPS (3-(N-morpholino)ácido propanesulfónico)25, utilice 1/10 volumen de sales MOPS 10x, 1/100 volumen de solución de micronutrientes 100x, fosfato sódico de 3 mM para cultivos nocturnos o fosfato sódico de 0,2 mM para etiquetado uniforme con 32P, 0,2% de glucosa y 1 g/ml de tiamina (vitamina B1). Añadir aminoácidos a 40 g/ml si es necesario.
- Para sales MOPS, utilice MOPS de 400 mM, Tricina de 40 mM, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 M CaCl2, 10,56 mM MgCl2y 500 mM NaCl. Añadir los diferentes componentes en el orden escrito para evitar la precipitación. Ajuste a pH 7.4 con KOH y esterilizar por filtración.
- Para una solución de micronutrientes de 100x, utilice 3 m (NH4)6(MO7)24, 0,4 mM H3BO4, 30 m CoCl2, 10 m CuSO4, 80 MnCl2y 10 m ZnSO4. Esterilice mediante autoclave.
- Para glucosa (20%) y soluciones de fosfato sódico (300 mM), esterilizar como medias separadas de 100x mediante autoclave. Esterilizar 100x reservas de tiamina y aminoácidos mezclas por filtración. Prepare medios frescos a partir de soluciones de stock estériles para cada experimento.
2. Etiquetado con 32P
- Cultivar cultivos nocturnos en medios MOPS con fosfato sódico de 3 mM.
- En una placa de 24 pocillos, añadir 550 ml de medios MOPS que contengan 0,2 ml de portador de fosfato sódico y 30 ml de cada inóculo bacteriano (dilución 1/20). Esto producirá un inóculo inicial de OD600nm 0.1. Use un pozo con medios frescos como control de esterilidad.
- Coloque la placa en una incubadora de agitación a 37 oC agitando a 900 rpm durante 30 minutos. Fije la placa firmemente con cinta adhesiva para evitar inclinaciones o derrames. El crecimiento se puede monitorear con una placa de replicación en paralelo en medios que carecen de 32P utilizando un lector de placas e incubando en las mismas condiciones.
- Añadir 100 oC a cada pozo de ortofosfato de 32P (20 l a partir de un stock de 5 mCi/ml).
NOTA: La cantidad de radiactividad también se puede ajustar para satisfacer las necesidades experimentales. Para niveles basales bajos de 100 oC con fosfato portador de 0,2 mM funciona bien, pero para medir (p)ppGpp niveles que se espera que se conviertan en equivalentes a las piscinas GTP, la etiqueta se puede bajar a 25 o 50 oC. No se recomienda bajar el fosfato portador por debajo de 0,2 mM para evitar que los niveles de fosfato se conviertan en limitadores para el crecimiento.
ADVERTENCIA: 32P es un isótopo emisor, por lo que utilice el blindaje adecuado especificado para la seguridad. Todo el material radiactivo debe eliminarse adecuadamente tomando todas las precauciones posibles. - Crecer en la incubadora de temblores durante 1 a 2 duplicaciones (1 h o más) para permitir que la etiqueta externa se equilibre en gran medida con piscinas de nucleótidos intracelulares antes de inducir el estrés.
3. Inducción del estrés o el hambre
-
Inducir el estrés utilizando un método de su elección, dependiendo del tipo de estrés estudiado, por ejemplo, la adición de inhibidores de la vía metabólica, el cambio de temperatura, el agotamiento de los nutrientes necesarios, el cambio de los cambios de osmolaridad, la inducción del estrés oxidativo, la adición de toxinas, etc.
- Por ejemplo, agregue 100 g/mL L-vaina para inducir la inanición de isoleucina en cepas de E. coli K-12. Se observará un aumento de los niveles de ppGpp después de 5 minutos de inducción.
4. Muestreo y extracción ppGpp
- Añadir 20 l de cada muestra de célula etiquetada a un tubo de PCR de 0,2 ml que contenga 20 ml de frío helado de 6 M de ácido fórmico.
- Coloque inmediatamente las muestras en hielo seco.
- Mejore la eficiencia de extracción celular en 3 ciclos de congelación y descongelación.
- Justo antes de detectar cromatogramas de capa delgada de celulosa PEI, muestras de centrífuga durante 1 min a velocidad máxima a los desechos de células de pellets para evitar la mancha en los cromatogramas.
5. Cromatografía de capa delgada
- Con un lápiz suave, marque una línea de origen a 1 cm del borde de la placa TLC PEI-Cellulose de 20 cm x 20 cm que ha tenido 5 cm de sacada de la parte superior con tijeras. Aplicar 5 l como gota en la superficie PEI para cada muestra. Comienza el desarrollo ascendente sin permitir que este lugar se seque, lo que mejora la resolución minimizando el rayado.
- Realizar el desarrollo ascendente en un tanque con una capa de 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) solución lo suficientemente superficial como para que el líquido no toque el punto de muestra de origen. Cubra el tanque con un sello hermético y deje el ascenso del líquido a la parte superior de la lámina recortada, 15 cm. Para lograr el pH 3.4 para una solución de 1.5 M KH2PO4, es necesario ajustar el pH mediante la adición de H3PO4.
- Retire el cromatograma completamente desarrollado y séquelo al aire a temperatura ambiente.
- Cortar y desechar la parte superior (pH frontal) del cromatograma que contiene los 32P libres en residuos radiactivos. Esta porción se representa en color amarillo en la Figura 2 y se visualiza fácilmente bajo luz UV. Si la medición de sólo (p)ppGpp nucleótidos que migran más lento que GTP, se recomienda ejecutar un estándar GTP visible para UV y luego cortar y descartar una porción superior más grande (cualquier cosa por encima de GTP, como se muestra en la Figura2).
- Exponga las películas autoradiográficas durante la noche con una pantalla de fósforo.
- Desarrolle la película. Capturar y cuantificar la señal de la pantalla de fósforo con un fosfoimagen.
6. Cantidad de (p)ppGpp
- Cantidad de puntos radiactivos con Imagen J26,27.
NOTA: La cantidad de (p)ppGpp se puede normalizar a la cantidad total de nucleótidos G observados en cada muestra (Figura2). Si la cantidad de fondo es homogénea, se puede restar un solo espacio en blanco (cuadro 4 de la Figura2) para corregir el fondo. Total G es la suma de GTP + ppGpp + pppGpp detectado. Esta normalización supone que los niveles de GMP y PIB son insignificantes, lo que es cierto para E. coli. La relación de un nucleótido determinado con el total de G proporciona una manera importante de corregir las variaciones del volumen de la muestra aplicada.
7. Medición de la tasa de descomposición de ppGpp
NOTA: Una modificación de este protocolo permite mediciones de las tasas de decaimiento ppGpp.
- Después de provocar estrés o hambre durante un tiempo suficiente para permitir la acumulación de ppGpp (paso 3), invertir la tensión con el fin de bloquear la síntesis continua de ppGpp, que permite la detección de tasas hidrolíticas. El procedimiento de reversión dependerá de la tensión. Por ejemplo, agregue 200 g/ml de cloramphenicol para revertir cualquier inanición de aminoácidos.
- Las tasas de descomposición suelen ser rápidas, pero pueden variar, así que tome muestras cada 20-30 s hasta 2 min. Procesar muestras como en el paso 4.
- Una vez que el TLC se desarrolla (como en el paso 5) y los niveles de ppGpp obtenidos durante el curso de tiempo, trazar contenido residual de ppGpp en una gráfica semi-logarítmica vs tiempo para permitir la visualización de las tasas de orden cero de decaimiento, como una línea recta, y la estimación de la vida media ppGpp.
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Representative Results
En cepas E. coli K-12, la adición de valina provoca una inanicina endógena de isoleucina, lo que resulta un aumento de los niveles de ppGpp después de 5 min3. Las células cultivadas en MOPS que contienen todos los aminoácidos excepto ILV fueron etiquetadas con 32P como se indica en la Figura1. Una vez etiquetado, se añadieron 6 l de 10 mg/ml de L-valina (concentración final de 100 g/ml) para producir inanición de isoleucina. Las muestras se tomaron 0 y 5 minutos después de la adición de valina. Después de 5 min (Figura3A),se produjo un aumento de 2 y 2,5 veces en los niveles de ppGpp y pppGpp. Como control negativo, se utilizó una muestra etiquetada sin celda para detectar posibles compuestos que no eran ortofosfato en la fuente de 32P. Además, incluir una cepa deficiente de ppGpp (relA) como un control negativo podría ayudar a una mejor identificación de las manchas.
La reversión del hambre de isoleucina se puede lograr mediante el cloramphenicol, un inhibidor de la síntesis de proteínas, que reduce el consumo de ile-tRNA cargado y, a su vez, restaura altas proporciones de ARN cargado a no cargado. Se suprime la activación de la fuerte sintetasa ppGpp mediada por RelA, lo que permite una medida de la degradación de ppGpp sin perturbar por síntesis residual. Por lo tanto, se añadieron 200 g/ml de cloramphenicol a los cultivos hambrientos y se tomaron muestras a intervalos de 20 s a partir de entonces. En este caso, ppGpp se descomponía con una vida media de unos 64 s (Figura3B).
Figura 1: Medición del flujo de trabajo ppGpp por TLC. Representación esquemática del protocolo para extraer ppGpp forma cultivos bacterianos y su detección posterior por TLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis representativo de TLC. Representación esquemática de los resultados obtenidos después de la autoradiografía y la pantalla de fósforo durante la noche con el TLC. Las manchas a medir se muestran en rojo. También se muestra la fórmula para calcular la cantidad fraccionaria de ppGpp. Total G se refiere a la cantidad total de GTP + ppGpp + pppGpp detectado en la muestra. La banda amarilla representa el frente de pH visible bajo la luz UV. Las tijeras indican dónde recomendamos cortar el cromatograma para desechar la mayor parte de la radiactividad. La flecha indica la dirección del flujo durante el desarrollo ascendente con 1,5 M de búfer de fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: medición de la síntesis y descomposición de ppGpp. (A) Detección de ppGpp por TLC para muestras 0 y 5 minutos después de la adición de valina. Se marcan los puntos correspondientes a GTP, ppGpp y pppGpp. Se incluyó un cultivo libre de células como control negativo (C-). (B) Descomposición de ppGpp después de la adición de cloramphenicol para revertir la inanición de aminoácidos. La vida media de ppGpp se determina a partir de la tasa de decaimiento exponencial representada por líneas punteadas. Las barras de error reflejan SD de duplicados. El eje Y se representa en una escala semilogarítica (log2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Lograr un etiquetado casi uniforme de las células es un paso crítico para este protocolo. Por lo tanto, el uso de medios definidos, como los medios MOPS o Tris, es crucial para permitir la variación de las concentraciones de fosfato portador y la actividad específica. Los medios almacenados en búfer de fosfato, como M9 o los medios A, no se pueden utilizar. La mayoría de los medios indefinidos contienen cantidades variables de fosfato, como LB, triptona y ácidos casamino. El isótopo de fosfato 33P es un emisor más débil que se puede sustituir por 32P. Las ventajas de la sustitución son que es más seguro y tiene una vida media de 25 días en lugar de 14 días para 32P. Sin embargo, las emisiones más energéticas de 32P mejoran considerablemente la sensibilidad a la detección. Es importante destacar los peligros de trabajar con isótopos y la importancia de utilizar protecciones de blindaje y eliminación adecuadas. El reciente descubrimiento de un riboswitch capaz de detectar específicamente ppGpp28 puede conducir algún día a una manera más segura de detectar ppGpp in vitro e in vivo. Como se mencionó en la introducción, existen otros métodos, aunque el uso del etiquetado de fosfato sigue siendo un enfoque sensible, directo y rápido para las mediciones a través de la colocación de bacterias (p)ppGpp, así como otros compuestos etiquetados con fosfato, como ribo- piscinas deoxyribo-NTP, PRPP, PPi o fosfatos de azúcar.
Otro paso crítico es asegurar que el crecimiento de los cultivos paralelos (incubadora de temblores y lector de placas) sea similar. Cuando se estudia el agotamiento de nutrientes, como el cambio diónico19,la sincronía entre cultivos es crucial. La comparabilidad del crecimiento en placas etiquetadas y no etiquetadas puede evaluarse mediante mediciones de600 OD de un pozo sin etiquetar en la placa radioactiva. Para aumentar el número de muestras analizadas, se puede utilizar una placa de 96 pocillos en su lugar 19,pero la cantidad de medios necesarios para minimizar la evaporación reducirá la aireación del cultivo. Los niveles basales de (p)ppGpp serán ligeramente más altos durante el crecimiento en una placa de 96 pocillos en comparación con una placa de 24 pocillos debido a la reducción de la aireación. Por lo tanto, para medir los niveles basales, se recomienda un crecimiento de 24 placas de pozo. Para medir las variaciones de los niveles más fuertemente inducidos (p)ppGpp, se prefiere una placa de 96 pocillos. La elección entre 24 y 96 placas de microtíter de pozo depende del objetivo experimental.
Las variaciones de este protocolo tienen muchas aplicaciones potenciales para diferentes condiciones de estrés. Recientemente lo hemos aplicado para medir la acumulación y descomposición de ppGpp durante los cambios diauxicos clásicos de la glucosa a la lactosa y a otros azúcares alternativos. Estos estudios revelaron la afectación de la inanición de glucosa y la inanición de aminoácidos19. Aquí describimos la inanición de aminoácidos inducida por la valina en cepas de E. coli K12 como una condición de estrés más simple y bien estudiada3. Este ejemplo se puede utilizar como un control antes de realizar situaciones de inanición más complicadas. La inanición de aminoácidos puede ser provocada por la adición de cantidades limitadas de un aminoácido requerido que se agota durante el crecimiento; añadiendo un inhibidor de la aminoacilación o síntesis de tRNA (hidroxamato de serina, mupirocina o 3-aminotriazol) o para E. coli K12 añadiendo valina en ausencia de isoleucina). El hidroxamato de serina se utiliza a menudo para inhibir la aminoacilación tRNASer pero requiere altas concentraciones, lo que puede causar problemas debido a la reactividad del hidroxamato con otros compuestos. Reversión de efectos de hidroxamato de serina mediante la adición de grandes cantidades de serina puede tener efectos no deseados1. Aunque SHX ha demostrado ser eficaz como diagnóstico de la producción de ppGpp, no recomendamos su uso para estudios fisiológicos para producir inanición de aminoácidos, porque se suprimen los mecanismos normales de retroalimentación (p)ppGpp, como las consecuencias fisiológicas de reducir las actividades superfluas, pero permitiendo la activación de circuitos reguladores de supervivencia por estrés.
Las modificaciones de los procedimientos TLC descritos aquí son necesarias para separar adecuadamente los nucleótidos reguladores no canónicos, tales como (p)ppApp29, de muestras mixtas con (p)ppGpp. Se ha demostrado que pppApp tiene un papel antagónico a ppGpp in vitro30,31; por lo tanto, se requiere una mejor separación de ambos compuestos para futuros estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
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