Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruke mikrotiterbrønnene Dish Radiolabeling for flere in vivo målinger av Escherichia coli (p) ppGpp etterfulgt av tynne lag kromatografi

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59595
Automatic Translation
1, 1
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Summary

Veksten av radiolabeled bakteriell kulturen inne mikrotiterbrønnene fat Letter høy produksjon prøving det innrømmer mangfoldig teknisk og Biological duplisere analyser av nukleotid basseng overflod, inkluderer det av (pencen) ppGpp. Effektene av vekst overganger provosert av kilder til fysiologisk stress, samt utvinning fra stress kan overvåkes.

Abstract

The (p) ppGpp nukleotid fungerer som en global regulator i bakterier som svar på en rekke fysiske og ernæringsmessige stress. Den har en rask debut, i sekunder, noe som fører til opphopning av nivåer som nærmer eller overskrider de av GTP bassenger. Stress reversering anledninger en rask forsvinningen av (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre enn et minutt. Tilstedeværelsen av (p) ppGpp resulterer i endringer av cellulære genuttrykk og metabolisme som motvirke de skadelige virkningene av stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskjellige reaksjons mekanismer, men begge avhenger av (p) ppGpp konsentrasjon. I alle tilfelle, det er en nød å samtidig dataskjerm mange radiolabeled bakteriell kulturen for tid intervaller det kanskje variere fra 10 sekunder å timene i løpet av betenkelig trykk overgang perioder. Denne protokollen løser denne tekniske utfordringen. Metoden utnytter temperatur-og shaker-kontrollerte mikrotiterbrønnene parabolen inkubatorer som tillater parallell overvåking av vekst (absorbansen) og rask prøvetaking av jevnt fosfat-radiolabeled kulturer å løse og quantitate nukleotid bassenger ved tynt lag kromatografi på PEI-cellulose. Små mengder utvalg er nødvendig for flere tekniske og biologiske replikerer av analyser. Komplekse vekst overganger, slik som diauxic vekst og rask (p) ppGpp omløpshastighet kan kvantitativt vurderes av denne metoden.

Introduction

The (p) ppGpp andre Messenger er en global regulator som modulerer uttrykk for et stort antall gener, inkludert gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om utgangspunktet oppdaget i Escherichia coli3, (p) ppGpp kan finnes i både gram positive og gram negative bakterier så vel som i anlegget Chloroplasts4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppGpp samhandler direkte med RNA polymerase på to forskjellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppGpp hemmer GTP overflod, som er følt av CodY, en GTP-bindende protein med Gen-spesifikke DNA-anerkjennelse motiver som fører til regulering9,10. (p) ppGpp akkumuleres som svar på sult for ulike næringsstoffer og stress forhold, noe som resulterer i langsom vekst og justeringer av genet uttrykk for å tillate tilpasning til stress11,12.

Nettobeløpet for ppGpp akkumulert reflekterer en balanse mellom syntetase og Hydrolase aktiviteter. I E. coli forholdet er en sterk Syntetase og SpoT er bifunctional, med en sterk Hydrolase og en svak syntetase, som hver kan være regulert forskjellig i en stress avhengig måte. Den sterke forholdet syntetase aktiveres når tilgjengeligheten av Codon-spesifiserte ladet tRNA bundet til ribosomal et område når den ikke klarer å holde tritt med kravene til proteinsyntese13,14,15. Det svake punktet (p) ppGpp-syntetase aktiveres mens den sterke (p) ppGpp-Hydrolase blir hemmet som følge av andre stress forhold og gjennom andre mekanismer. Under noen forhold kan proteiner som ACP eller RSD bindes til SpoT, som også endrer balansen mellom hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver reflekterer syntese og hydrolyse en mer kompleks balanse mellom et enkelt forholdet SpoT homologe (RSH) protein med sterk syntese og hydrolyse aktiviteter så vel som mindre hydrolases og/eller synthetases12.

The (p) ppGpp nukleotider ble først oppdaget som uvanlige 32p merket flekker som dukket opp på autoradiograms av tynne-lags KROMATOGRAMMENE (TLC) under en streng respons indusert av aminosyre sult3. Mer detaljerte merking protokoller har gjennomgått 18. Protokollen som beskrives her (figur 1) er en modifikasjon av disse protokollene som gjør det mulig å overvåke vekst av flere prøver på mikrotiterbrønnene plater. Dette forenkler flere biologiske og tekniske anslag over (p) ppGpp overflod endringer og ble opprinnelig utviklet for studier av diauxic Skift19. Merking av (p) ppGpp med 32p og deteksjon av TLC tillater også målinger av (p) ppGpp ned brytnings rater. Alternative metoder er utviklet for å bestemme (p) ppGpp nivåer som masse massespektrometri, HPLC20, fluorescerende chemosensors21,22, og GFP gen fusjoner til arrangører berørt av ppGpp23, 24. fluorescerende chemosensors for tiden har en begrenset bruk på grunn av små Spectral Skift etter binding ppGpp samt problemer skille mellom PpGpp og pppGpp21. Denne metoden er effektiv for å oppdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder som involverer HPLC har blitt forbedret20 , men krever dyrt utstyr og er ikke godt tilpasset til høy gjennom-PUT. Til slutt kan GFP fusjoner gi et anslag på ppGpp avhengig aktivering eller hemming, men ikke måle ppGpp selv. Mens hver av disse alternative metoder er verdifulle, de krever dyrt utstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke mottagelig for flere kinetisk prøvetaking og påfølgende prosessering. Med metoden beskrevet her, 96 prøver kan brukes på seks TLC plater i ca 20 min (18 prøver per plate), løst av TLC utvikling på mindre enn et par timer, med kvantitative data innhentet etter flere timer eller over natten, avhengig av merking Intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargjøring av medier

  1. For MOPPER (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid) Media25, bruk 1/10 volum på 10x mopper alter, 1/100 volum på 100 x mikronæringsstoffer løsning, 3 mm natrium fosfat for overnatting kulturer eller 0,2 mm natrium fosfat for ensartet merking med 32P, 0,2% glukose og 1 μg/mL Thiamin (vitamin B1). Tilsett aminosyrer ved 40 μg/mL ved behov.
    1. For MOPPER alter, bruk 400 mM MOPPER, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4CL, 2,6 mm K2so4, 5 μM CaCl2, 10,56 mm MgCl2og 500 mm NaCl. Legg til de ulike komponentene i den rekkefølgen som er skrevet for å unngå nedbør. Juster til pH 7,4 med KOH og sterilisere ved filtrering.
    2. For 100-mikronæringsstoffer løsning, bruk 3 μM (NH4)6(Mo7)24, 0,4 mm H3bo4, 30 μm CoCl2, 10 μm CuSO4, 80 μM MnCl2og 10 μM ZnSO4. Steriliseres med autoklavering.
    3. For glukose (20%) og natrium fosfat (300 mM) løsninger, steriliseres som separate 100-aksjer ved autoklavering. Sterilisere 100% av bestandene av Tiamin og aminosyre blandinger ved filtrering. Forbered ferske medier fra sterile lager løsninger for hvert eksperiment.

2. merking med 32P

  1. Grow overnatter kulturer i MOPPER medier med 3 mM natrium fosfat.
  2. I en 24 brønn plate legger du til 550 μL av MOPPER-medier som inneholder 0,2 mM natrium fosfat bærer og 30 μL av hver bakteriell inokulum (fortynning 1/20). Dette vil gi en innledende inokulum av OD600nm 0,1. Bruk en brønn med friskt Media som en sterilitet kontroll.
  3. Plasser platen på en risting inkubator ved 37 ° c risting ved 900 RPM i 30 min. kulturer varmes opp fra under og risting gir lufting. Fest platen godt med tape for å unngå å vippe eller søle. Veksten kan overvåkes med en gjenskape plate parallelt i Media mangler 32P ved hjelp av en plate leser og incubating under samme forhold.
  4. Tilsett 100 μCi til hver brønn på 32P ortofosfat (20 μL fra en 5 MCI/ml lager).
    Merk: Mengden av radioaktivitet kan også justeres for å dekke eksperimentelle behov. For lave basal nivåer 100 μCi med 0,2 mM carrier fosfat fungerer godt, men for å måle (p) ppGpp nivåer som er forventet å bli tilsvarende GTP bassenger, kan etiketten bli droppet til 25 eller 50 μCi. Senking carrier fosfat under 0,2 mM er ikke anbefalt å unngå fosfat nivåer bli begrensende for vekst.
    Forsiktig: 32P er en β-emitting isotop så bruk riktig skjerming spesifisert for sikkerhet. Alt radioaktivt materiale må avhendes på riktig måte og tar alle mulige forholdsregler.
  5. Vokse i risting inkubator for 1 til 2 doublings (1 t eller mer) for å tillate ekstern etikett til stor grad likevekt med intracellulære nukleotid bassenger før indusere stress.

3. induksjon av stress eller sult

  1. Indusere stress ved hjelp av en metode for å velge, avhengig av hva slags stress studert, for eksempel legge metabolske sti hemmere, skiftende temperatur, utmattende nødvendige næringsstoffer, skiftende OSMOLARITETSSYSTEM SKIFT, inducing oksidativt stress, legge giftstoffer, etc.
    1. Legg for eksempel til 100 μg/mL L-Valin for å indusere isoleucin sult i E. coli K-12 stammer. Økte nivåer av ppGpp vil bli observert etter 5 minutter med induksjon.

4. prøvetaking og ppGpp-ekstraksjon

  1. Tilsett 20 μL av hver merket celleprøve til et 0,2 mL PCR-rør som inneholder 20 μL av iskald 6 M maursyre syre.
  2. Umiddelbart plassere prøvene i tørr is.
  3. Forbedre mobilnettet utvinning effektivitet med 3 sykluser av frysing og tine.
  4. Like før spotting PEI cellulose tynt lag kromatogrammene, sentrifuger prøver for 1 min med maksimal hastighet til pellets celle rusk å unngå spotting det på kromatogrammene.

5. tynt lag kromatografi

  1. Med en myk blyant, markere en opprinnelse linje 1 cm fra kanten av den 20 cm x 20 cm PEI-cellulose TLC plate som har hatt 5 cm fjernet fra toppen med saks. Påfør 5 μL som en dråpe i PEI overflaten for hver prøve. Begynn stigende utvikling uten å la dette stedet tørke, noe som forbedrer oppløsningen ved å minimere striper.
  2. Gjør stigende utvikling i en tank med et lag med 1,5 M KH2PO4 (pH 3,4) løsning grunt nok slik at væsken ikke berører opprinnelsen prøven stedet. Dekk til tanken med en lufttett forsegling og la væske oppstigning til toppen av trimmet arket, 15 cm. For å oppnå pH 3,4 for en 1,5 M KH2PO4 løsning, er det nødvendig justere pH ved tilsetning av H3PO4.
  3. Fjern det fullt utviklede kromatogram og lufttørke ved romtemperatur.
  4. Klipp og kast toppen (pH foran) delen av kromatogram som inneholder den frie 32P til radioaktivt avfall. Denne delen er representert med gul farge i figur 2 og er lett å VISUALISERE under UV-lys. Hvis måling kun (p) ppGpp nukleotider som migrerer langsommere enn GTP, anbefales det å kjøre en UV-synlig GTP-standard og deretter klippe og forkaste en større øvre del (noe over GTP, som vist i figur 2).
  5. Utsett autoradiographic filmer over natten med en fosfor skjerm.
  6. Utvikle filmen. Fang og quantitate fosfor skjerm signalet med en phosphoimager.

6. kvantifisering av (p) ppGpp

  1. Quantitate radioaktive flekker med bilde J26,27.
    Merk: Mengden (p) ppGpp kan bli normalisert til total mengde G nukleotider observert i hvert utvalg (figur 2). Hvis mengden bakgrunn er homogen, kan en enkelt blank (boks 4 fra figur 2) trekkes fra for å korrigere for bakgrunnen. Total G er summen av GTP + ppGpp + pppGpp oppdaget. Dette normalisering forutsetter at GMP og BNP nivåer er ubetydelig, noe som er sant for E. coli. Forholdet mellom en gitt nukleotid og total G gir en viktig metode for å korrigere for variasjoner av brukt prøvevolum.

7. måling av frekvensen av ppGpp Decay

Merk: En modifikasjon av denne protokollen tillater målinger av ppGpp forfall.

  1. Etter provoserte stress eller sult i en tid tilstrekkelig til å tillate ppGpp akkumulering (trinn 3), reversere stress for å blokkere fortsatt ppGpp syntese, som tillater påvisning av hydrolytisk priser. Prosedyren for reversering vil avhenge av stress. Du kan for eksempel legge til 200 μg/mL av kloramfenikol for å reversere all aminosyre-sult.
  2. Decay priser er vanligvis raske, men kan variere, så ta prøver hver 20-30 s opp til 2 min. prosess prøver som i trinn 4.
  3. Når TLC er utviklet (som i trinn 5) og nivåene av ppGpp innhentet i løpet av tiden kurset, plot resterende ppGpp innhold på en semi-logaritmisk plot vs tid til å tillate visualisering av null ordre rater av forfall, som en rett linje, og estimering av ppGpp halveringstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I E. coli K-12 stammer, tillegg av Valin provoserer en endogene sult isoleucin, noe som resulterer en økning på ppGpp nivåer etter 5 min3. Celler dyrket i MOPPER inneholder alle aminosyrer unntatt ILV ble merket med 32P som indikert i figur 1. Når merket, ble 6 μL av 10 mg/mL L-Valin (100 μg/mL endelig konsentrasjon) tilsatt for å produsere isoleucin sult. Prøvene ble tatt 0 og 5 min etter tilsetning av Valin. Etter 5 min (figur 3a), en 2 og 2,5-fold økning i nivåene av PpGpp og pppGpp oppstod. Som en negativ kontroll ble en celle fri merket prøve brukt til å påvise mulige forbindelser som ikke var ortofosfat i 32P-kilden. Også, inkludert en ppGpp mangelfull belastning (Δforholdet ΔspoT) som en negativ kontroll kan bidra til en bedre identifisering av flekkene.

Reversering av isoleucin sult kan oppnås ved kloramfenikol, en hemmer av proteinsyntese, som reduserer forbruket av ladet Ile-tRNA og i sin tur, gjenoppretter høye prosenter av ladet til uncharged tRNA. Aktivering av den sterke forholdet-mediert ppGpp syntetase er avskaffet, som tillater et mål på ppGpp degradering Uaffisert av gjenværende syntese. Derfor ble 200 μg/mL av kloramfenikol tilsatt til de sultet kulturene, og prøvene ble tatt ved 20 s intervaller etterpå. I dette tilfellet, ppGpp forfalt med en halveringstid på ca 64 s (figur 3b).

Figure 1
Figur 1: måling av ppGpp med TLC-arbeidsflyt. Skjematisk fremstilling av protokollen for å trekke ut ppGpp form bakteriekulturer og dens bakre deteksjon av TLC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: REPRESENTATIV TLC-analyse. Skjematisk fremstilling av resultatene oppnådd etter autoradiografi og fosfor skjerm over natten med TLC. Flekkene som skal måles vises i rødt. Formelen for å beregne brøk mengden av ppGpp vises også. Total G refererer til den totale mengden av GTP + ppGpp + pppGpp oppdaget i prøven. Det gule båndet representerer pH-fronten som er synlig under UV-lys. Saks indikerer hvor vi anbefaler å kutte kromatogram for å kaste mesteparten av radioaktiviteten. Pilen indikerer retningen av flyten under stigende utvikling med 1,5 M fosfat buffer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: måling av syntese og forfall av ppGpp. (A) påvisning av PPGPP av TLC for prøver 0 og 5 minutter etter tilsetning av Valin. Punkter som tilsvarer GTP, ppGpp og pppGpp er merket. En celle-fri kultur ble inkludert som negativ kontroll (C-). (B) forfallet av ppGpp etter tilsetning av kloramfenikol å reversere aminosyre sult. Den ppGpp halveringstiden bestemmes av eksponentiell forfall representert med stiplede linjer. Feilfelt reflekterer SD fra duplikater. Y-aksen er representert i en semilogaritmic (log2) skala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å oppnå nær uniform merking av cellene er et kritisk trinn for denne protokollen. Derfor er bruken av definerte medier, for eksempel MOPPER eller Tris Media, avgjørende for å muliggjøre variasjon av fosfat konsentrasjoner av bærebølge og spesifikk aktivitet. Fosfat-bufrede medier, for eksempel M9 eller Media A, kan ikke brukes. De fleste udefinert medier inneholder variable mengder fosfat, slik som LB, tryptone og casamino syrer. Den fosfat isotop 33p er en svakere emitter som kan erstatte 32p. fordeler med substitusjon er at det er tryggere og har en halveringstid på 25 dager i stedet for 14 dager for 32P. Men de mer energiske utslippene av 32P betydelig øke deteksjonsfølsomheten. Det er viktig å understreke farene ved å arbeide med isotoper og viktigheten av å bruke riktig skjerming beskyttelse og avhending. Det nylig oppdagelsen av en riboswitch kjøpedyktig merker spesielt ppGpp28 kanskje en dag innlede å en pengeskap vei å merker ppGpp inne vitro og inne vivo. Som nevnt i innledningen, andre metoder finnes, selv om bruk av fosfat merking forblir en følsom, direkte og rask tilnærming for gjennom-putte målinger av bakteriell (p) ppGpp samt andre fosfat merket forbindelser, for eksempel Ribo-eller deoxyribo-NTP bassenger, PRPP, PPi eller sukker fosfater.

Et annet kritisk skritt er å sikre at veksten av parallelle kulturer (risting inkubator og plate leser) er lik. Når du studerer næringsstoff utmattelse, slik som diauxic Shift19, er Synchrony mellom kulturer avgjørende. Sammenlignbarhet av vekst på merket og umerkede plater kan vurderes av OD600 målinger av en umerkede brønn på den ellers radioaktive platen. For å øke antall prøver testet, en 96 brønn plate kan brukes i stedet 19, men mengden av medier som kreves for å minimere fordampning vil redusere kultur lufting. Basal nivåer av (p) ppGpp vil være litt høyere under veksten i en 96 brønn plate sammenlignet med en 24 brønn plate på grunn av redusert lufting. Derfor, for å måle basal nivåer, en 24 brønn plate vekst anbefales. Å måle variasjoner av sterkere indusert (p) ppGpp nivåer, en 96 brønn plate foretrekkes. Valget mellom 24 og 96 godt mikrotiterbrønnene plater avhenger av det eksperimentelle målet.

Variasjoner av denne protokollen har mange potensielle applikasjoner for ulike forhold av stress. Nylig har vi brukt den til å måle akkumulering og forfall av ppGpp under klassisk diauxic Skift fra glukose til laktose og til andre alternative sukker. Disse studiene avdekket involvering av både glukose sult og aminosyre sult19. Her beskriver vi aminosyre sult indusert av Valin i E. coli K12 stammer som en enklere og godt studert stress condition3. Dette eksempelet kan brukes som en kontroll før du utfører mer kompliserte sult situasjoner. Aminosyre sult kan bli provosert ved å legge til begrensede mengder av en nødvendig aminosyre som er oppbrukt under vekst; legge en hemmer av tRNA aminoacylation eller syntese (Serine hydroxamate, Mupirocin, eller 3-aminotriazole) eller for E. coli K12 legge Valin i fravær av isoleucin). Serine hydroxamate brukes ofte til å hemme tRNAser aminoacylation men krever høye konsentrasjoner, noe som kan føre til problemer på grunn av hydroxamate reaktivitet med andre forbindelser. Reversering av Serine hydroxamate effekter ved å legge til en stor mengde Serine kan ha ikke-ønsket effekt1. Selv om SHX har vist seg å være effektiv som en diagnostisk av ppGpp produksjon, anbefaler vi ikke bruk for fysiologiske studier for å produsere aminosyre sult, fordi normal (p) ppGpp feedback mekanismer er avskaffet, slik som fysiologiske konsekvenser av å senke overflødig virksomhet, men slik at aktivering av stress overlevelse regulatoriske kretser.

Modifikasjoner av TLC-prosedyrene som beskrives her, er nødvendige for å kunne skille noncanonical regulatoriske nukleotider, som (p) ppApp29, fra blandede prøver med (p) ppGpp. Det har vist seg at pppApp har en fiendtlig rolle til å ppGpp in vitro30,31; Derfor er bedre separasjon av begge forbindelsene nødvendig for fremtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)6(MO7)24 Fisher Scientifics A-674
Autoradiography film Denville scientific inc. E3218
CaCl2 J.T.Baker 1-1309
Chloramphenicol RPI C61000-25.0
CoCl2 Fisher Scientifics C-371
CuSO4 J.T.Baker 1843
FeSO4 Fisher Scientifics I-146
Formic acid Fisher Biotech BP1215-500
Glucose Macron 4912-12
H3BO4 Macron 2549-04
H3PO4 J.T.Baker 0260-02
K2SO4 Sigma P9458-250G
KH2PO4 Fisher Biotech BP362-500
L-Valine Sigma V-6504
MgCl2 Fisher Scientifics FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT Biotek Synergy HT
MnCl2 Sigma M-9522
MOPS Sigma M1254-1KG
Na2HPO4 Mallinckrodt 7892
NaCl J.T.Baker 3624-01
NaH2PO4 Mallinckrodt 7917
NH4Cl Sigma A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) Perkin Elmer NEX053005MC
Storage phosphor screen Kodak So230
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Thiamine Sigma T-4625
TLC PEI Cellulose F Merk-Millipore 1.05579.0001
Tricine RPI T2400-500.0
Typhoon 9400 imager GE Healthcare
ZnSO4 Fisher Scientifics Z-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
  2. Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
  3. Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
  4. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
  5. Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
  6. Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
  7. Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
  8. Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
  9. Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
  10. Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
  11. Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  12. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
  13. Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
  14. Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
  15. Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
  16. Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
  17. Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
  18. Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
  19. Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
  20. Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
  21. Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
  22. Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
  23. Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
  24. Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
  25. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
  29. Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
  30. Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
  31. Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).

Tags

Biologi (p) ppGpp tynne lag kromatografi 32p Escherichia coli høy gjennomstrømming andre Messenger
Bruke mikrotiterbrønnene Dish Radiolabeling for flere in vivo målinger av <em>Escherichia coli</em> (p) ppGpp etterfulgt av tynne lag kromatografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández-Coll, L., Cashel, M.… More

Fernández-Coll, L., Cashel, M. Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (148), e59595, doi:10.3791/59595 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter