Summary
La crescita di colture batteriche radioetichettate nei piatti microtiteri facilita il campionamento ad alta produttività che consente molteplici analisi tecniche e biologiche di abbondanza di piscine nucleotidiche, tra cui quella di (p)ppGpp. Gli effetti delle transizioni di crescita provocati da fonti di stress fisiologico e di recupero dallo stress possono essere monitorati.
Abstract
Il nucleotide (p)ppGpp funziona come regolatore globale nei batteri in risposta a una varietà di stress fisico e nutrizionale. Ha un rapido insorgenza, in secondi, che porta ad accumulo di livelli che si avvicinano o superano quelli dei pool GTP. L'inversione dello stress è una rapida scomparsa di (p)ppGpp, spesso con un'emivita di meno di un minuto. La presenza di (p)ppGpp provoca alterazioni dell'espressione genica cellulare e del metabolismo che contrastano gli effetti dannosi dello stress. I batteri Gram-negativi e Gram-positivi hanno meccanismi di risposta diversi, ma entrambi dipendono dalla concentrazione (p)ppGpp. In ogni caso, è necessario monitorare contemporaneamente molte colture batteriche radioetichettate a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore durante i periodi di transizione allo stress critico. Questo protocollo affronta questa sfida tecnica. Il metodo si avvale di incubatori di microtitori a temperatura e a scossore che consentono un monitoraggio parallelo della crescita (assorbimento) e di un rapido campionamento di colture uniformemente radioetichettate con fosfato per risolvere e quantitare le pool di nucleotidi cromatografia a strato sottile sulla cellulosa PEI. Piccole quantità di campione sono necessarie per molteplici repliche tecniche e biologiche delle analisi. Con questo metodo è possibile valutare quantitativamente transizioni complesse di crescita, come la crescita diaustica e i tassi di rotazione rapidi (p)ppGpp.
Introduction
Il secondo messaggero (p)ppGpp è un regolatore globale che modula l'espressione di un gran numero di geni, compresi i geni per sintetizzare ribosomi e amminoacidi1,2. Anche se inizialmente scoperto in Escherichia coli3, (p)ppGpp può essere trovato sia nei batteri Gram positivi e Gram negativi, così come nelle cloroplasti vegetali4,5. Per E. coli e altri batteri Gram-negativi, (p)ppGpp interagisce direttamente con la polimerasi dell'RNA in due siti diversi6,7,8. In Gram positivi, (p)ppGpp inibisce l'abbondanza GTP, che viene percepita da CodY, una proteina legante GTP con motivi di riconoscimento del DNA gene-specifici che portano al regolamento9,10. (p)ppGpp si accumula in risposta alla fame di diversi nutrienti e condizioni di stress, con conseguente crescita lenta e aggiustamenti dell'espressione genica per consentire l'adattamento allo stress11,12.
La quantità netta di ppGpp accumulata riflette un equilibrio tra le attività di sintetasi e idrolasi. In E. coli RelA è una forte sintetasi e SpoT è bifunzionale, con una forte idrolasi e una sintetasi debole, ognuna delle quali potrebbe essere regolata in modo diverso in modo dipendente dallo stress. La forte sintetasi RelA si attiva quando la disponibilità di tRNA carico carica specificato codone legato al sito ribosomal A quando non riesce a tenere il passo con le esigenze di sintesi proteica13,14,15. La debole sintetasi SpoT (p)ppGpp viene attivata mentre l'idrolasi forte (p)ppGpp è inibita in risposta ad altre condizioni di stress e attraverso altri meccanismi. In alcune condizioni, proteine come ACP o Rsd possono legarsi a SpoT, che cambia anche l'equilibrio tra idrolisi e sintesi16,17. Nei positivi Gram, sintesi e idrolisi riflettono un equilibrio più complesso tra una singola proteina relA SpoT (RSH) con forti attività di sintesi e idrolisi, nonché idrolasi e/o sintetasi più piccole12.
I nucleotidi (p)ppGpp sono stati scoperti per la prima volta come insoliti punti etichettati da 32P che sono apparsi sugli autoradiogrammi dei cromotrigrammi a strato sottile (TLC) durante una risposta rigorosa indotta dalla fame di amminoacido3. Sono stati esaminati protocolli di etichettatura più dettagliati 18. Il protocollo descritto qui (Figura 1) è una modifica di questi protocolli che consente di monitorare la crescita di più campioni su piastre di microtiteri. Questo facilita molteplici stime biologiche e tecniche dei cambiamenti di abbondanza (p)ppGpp ed è stato inizialmente sviluppato per studi sui cambiamenti diauxici19. L'etichettatura di (p)ppGpp con 32P e rilevamento da parte di TLC consente anche misurazioni dei tassi di degradazione (p)ppGpp. Sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare i livelli (p)ppGpp come la spettrometria di massa, HPLC20, chemiosensori fluorescenti21,22e le fusioni geniali GFP per i promotori affetti da ppGpp23, 24. I chemiosensori fluorescenti hanno attualmente un uso limitato a causa di piccoli spostamenti spettrali dopo il legame ppGpp così come problemi che distinguono tra ppGpp e pppGpp21. Questo metodo è efficace per rilevare (p)ppGpp in vitro, ma non in estratti cellulari. I metodi che coinvolgono HPLC sono stati miglioratia 20 ma richiedono attrezzature costose e non sono ben adattati all'elevata velocità. Infine, le fusioni GFP possono fornire una stima dell'attivazione o dell'inibizione dipendente da ppGpp, ma non misurano la ppGpp stessa. Sebbene ciascuno di questi metodi alternativi sia prezioso, richiedono attrezzature costose o tempi di pratica sostanziali oppure non sono suscettibili di campionamento cinetico multiplo e di successiva elaborazione. Con il metodo qui descritto, 96 campioni possono essere applicati a sei piastre TLC in circa 20 min (18 campioni per piastra), risolti dallo sviluppo di TLC in meno di un paio d'ore, con dati quantitativi ottenuti dopo diverse ore o durante la notte, a seconda dell'etichettatura intensità.
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Protocol
1. Preparazione dei supporti
-
Per moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) media25, utilizzare 1/10 volume di sali 10x MOPS, 1/100 volume di soluzione 100x micronutrienti, 3 mM fosfato di sodio per colture notturne o 0,2 mM di fosfato di sodio per un'etichettatura uniforme con 32P, 0,2% di glucosio e 1 g/mL di tiano (vitamina B1). Se necessario, aggiungere gli amminoacidi a 40 g/mL.
- Per i salti MOPS, utilizzare 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 CaCl2, 10,56 mM MgCl2e 500 mM NaCl. Aggiungere i diversi componenti nell'ordine scritto per evitare precipitazioni. Regolare a pH 7.4 con KOH e sterilizzare per filtrazione.
- Per la soluzione di micronutrienti 100x, utilizzare 3 M (NH4)6(MO7)24, 0,4 mM H3BO4, 30 M CoCl2, 10 CuSO4, 80M MnCl2, e 10 M nSO4. Sterilizzare autoclaving.
- Per il glucosio (20%) e soluzioni di fosfato di sodio (300 mM), sterilizzare come scorte 100x separate autoclaving. Sterilizzare 100 volte le scorte di tiamina e miscele di amminoacidi per filtrazione. Preparare supporti freschi da soluzioni sterili per ogni esperimento.
2. Etichettatura con 32P
- Coltiva le colture notturne con i media MOPS con 3 mM di fosfato di sodio.
- In una piastra di 24 pozzetti, aggiungere 550 - L di molo DI MOPS contenente 0,2 mM di portafosato di sodio e 30 di ogni inoculum batterico (diluizione 1/20). Questo produrrà un inoculum iniziale di OD600nm 0.1. Utilizzare un pozzo con supporti freschi come controllo di sterilità.
- Posizionare la piastra su un'incubatrice agitazione a 37 gradi centigradi tremando a 900 giri/mm per 30 min. Fissare saldamente la piastra con del nastro adesivo per evitare inclinazioni o fuoriuscite. La crescita può essere monitorata con una piastra replicante in parallelo su supporti privi di 32P utilizzando un lettore di lastre e incubando si incubano nelle stesse condizioni.
- Aggiungete 100 Ci ad ogni pozzetto da 32P orthophosphate (20 -L da un'azione di 5 mCi/mL).
NOT: La quantità di radioattività può anche essere regolata per soddisfare le esigenze sperimentali. Per i bassi livelli basali 100 -Ci con 0,2 mM di fosfato portante funziona bene, ma per misurare i livelli (p)ppGpp che dovrebbero diventare equivalenti a piscine GTP, etichetta può essere sceso a 25 o 50 Ci. Abbassare il fosfato portante al di sotto di 0,2 mM non è raccomandato per evitare che i livelli di fosfato diventino limitanti per la crescita.
AGGIORNAMENTO: 32P è un isotopo che emette, quindi usa una schermatura adeguata specificata per la sicurezza. Tutto il materiale radioattivo deve essere smaltito correttamente prendendo tutte le precauzioni possibili. - Coltivare in incubatrice acquosa per 1 o 2 raddoppi (1 h o più) per consentire all'etichetta esterna di eclarare in gran parte con pool di nucleotidi intracellulari prima di indurre lo stress.
3. Induzione di stress o di fame
-
Indurre lo stress utilizzando un metodo di vostra scelta, a seconda del tipo di stress studiato, ad esempio l'aggiunta di inibitori della via metabolica, cambiamento della temperatura, estenuante nutrienti necessari, spostamento di spostamento degli spostamenti di osmolarità, indurre stress ossidativo, aggiunta di tossine, ecc.
- Ad esempio, aggiungere 100 g/mL L-valine per indurre la fame di isoleoucina nei ceppi di E. coli K-12. I livelli aumentati di ppGpp saranno osservati dopo 5 minuti di induzione.
4. Campionamento e estrazione ppGpp
- Aggiungere 20 l di ogni campione di cellule etichettate a un tubo PCR da 0,2 mL contenente 20 -L di ghiaccio freddo 6 M di acido formicico.
- Mettere immediatamente i campioni nel ghiaccio secco.
- Migliora l'efficienza dell'estrazione cellulare di 3 cicli di congelamento e scongelamento.
- Poco prima di avvistare i cromatogrammi a strato sottile di cellulosa PEI, centrifugare campioni per 1 min alla massima velocità per pellet detriti cellulari per evitare di avvistarlo su cromatogrammi.
5. Cromatografia a strato sottile
- Con una matita morbida, segnare una linea di origine a 1 cm dal bordo della piastra PEI-Cellulose TLC da 20 cm x 20 cm che ha avuto 5 cm di rimozione dalla parte superiore con le forbici. Applicare 5 -L come goccia nella superficie PEI per ogni campione. Iniziare lo sviluppo ascendente senza lasciare che questo punto si asciughi, migliorando la risoluzione riducendo al minimo le striature.
- Fai lo sviluppo ascendente in un serbatoio con uno strato di 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) soluzione abbastanza superficiale in modo che il liquido non tocchi il punto campione di origine. Coprire il serbatoio con una guarnire a tenuta d'aria e lasciare che la salita liquida alla parte superiore del foglio tagliato, 15 cm. Per ottenere il pH 3.4 per una soluzione da 1,5 M KH2PO4, è necessario regolare il pH aggiungendo H3PO4.
- Rimuovere lo cromatogramma completamente sviluppato e l'aria si asciugano a temperatura ambiente.
- Tagliare e scartare la parte superiore (pH anteriore) del cromatogramma contenente il libero 32P in scorie radioattive. Questa porzione è rappresentata in colore giallo nella Figura 2 e facilmente visualizzabile sotto la luce UV. Se si misurano solo i nucleotidi (p)ppGpp che migrano più lentamente di GTP, si consiglia di eseguire uno standard GTP visibile ai raggi UV e quindi tagliare e scartare una porzione superiore più grande (qualsiasi elemento sopra GTP, come mostrato nella Figura 2).
- Esponi le pellicole radiografiche durante la notte con uno schermo di fosforo.
- Sviluppare il film. Catturare e quantificare il segnale dello schermo del fosforo con un fosforo.
6. Quantitazione di (p)ppGpp
- Quantitate spot radioattivi con l'immagine J26,27.
NOT: La quantità di (p)ppGpp può essere normalizzata alla quantità totale di nucleotidi G osservati in ogni campione (Figura 2). Se la quantità di sfondo è omogenea, è possibile sottrarre un singolo spazio vuoto (casella 4 della Figura 2) per correggere lo sfondo. Total G è la somma di GTP - ppGpp - pppGpp rilevato. Questa normalizzazione presuppone che i livelli di GMP e PIL siano trascurabili, il che è vero per E. coli. Il rapporto tra un determinato nucleotide e G totale fornisce un modo importante per correggere le variazioni del volume del campione applicato.
7. Misurazione del tasso di decadimento ppGpp
NOT: Una modifica di questo protocollo consente misurazioni dei tassi di decadimento ppGpp.
- Dopo aver provocato stress o fame per un tempo sufficiente a consentire l'accumulo di ppGpp (passaggio 3), invertire lo stress per bloccare la sintesi continua del ppGpp, che consente il rilevamento dei tassi idrolitici. La procedura di inversione dipenderà dallo stress. Ad esempio, aggiungere 200 g/mL di cloramfenicolo per invertire qualsiasi amminoacido di fame.
- I tassi di decadimento sono di solito rapidi, ma possono variare, quindi preleva campioni ogni 20-30 s fino a 2 min.
- Una volta che il TLC è sviluppato (come nel passaggio 5) e i livelli di ppGpp ottenuti durante il corso temporale, tracciare il contenuto di ppGpp residuo su una trama semi-logaritmica vs tempo per consentire la visualizzazione di zero tassi di decadimento di ordine, come una linea retta, e stima dell'emivita ppGpp.
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Representative Results
Nei ceppi E. coli K-12, l'aggiunta di valina provoca una fame endogena di isoleucina, che si traduce in un aumento dei livelli di ppGpp dopo 5 min3. Le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli aminoacidi ad eccezione di ILV sono state etichettate con 32P come indicato nella Figura 1. Una volta etichettato, sono stati aggiunti 6 L di 10 mg/mL L-valine (100 g/mL di concentrazione finale) per produrre la fame di isole. I campioni sono stati prelevati 0 e 5 min dopo l'aggiunta di valine. Dopo 5 min (Figura 3A), si è verificato un aumento di 2 e 2,5 volte dei livelli di ppGpp e pppGpp. Come controllo negativo, è stato utilizzato un campione etichettato senza cellule per rilevare possibili composti che non erano ortoposphate nella fonte 32P. Inoltre, includendo un ceppo carente di ppGpp (zrelA - spoT) come un controllo negativo potrebbe aiutare una migliore identificazione delle macchie.
L'inversione della fame isoleucina può essere ottenuta con il cloramfemicolo, un inibitore della sintesi proteica, che riduce il consumo di il-tRNA caricato e, a sua volta, ripristina alti rapporti di tRNA caricato e non caricato. L'attivazione della forte sintetasi ppGpp mediata RelA è abolita, il che consente una misura della degradazione del ppGpp imperturbabile dalla sintesi residua. Di conseguenza, sono stati aggiunti 200 g/mL di cloramenico alle colture affamate e i campioni sono stati prelevati a intervalli di 20 s in seguito. In questo caso, ppGpp decaduto con un'emivita di circa 64 s (Figura 3B).
Figura 1: Misurazione di ppGpp dal flusso di lavoro TLC. Rappresentazione schematica del protocollo per estrarre le colture batteriche della forma ppGpp e il rilevamento posteriore da parte del TLC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi TLC rappresentativa. Rappresentazione schematica dei risultati ottenuti dopo l'autoradiografia e lo screening fosforo durante la notte con il TLC. Le macchie da misurare sono mostrate in rosso. Viene visualizzata anche la formula per calcolare la quantità frazionaria di ppGpp. Total G si riferisce alla quantità totale di GTP , ppGpp , pppGpp rilevata nel campione. La banda gialla rappresenta il frontale del pH visibile sotto la luce UV. Le forbici indicano dove si consiglia di tagliare il cromatogramma per scartare la maggior parte della radioattività. La freccia indica la direzione del flusso durante lo sviluppo crescente con buffer fosfato da 1,5 M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: misurazione della sintesi e decadimento di ppGpp. (A) Rilevamento di ppGpp da parte del TLC per i campioni 0 e 5 minuti dopo l'aggiunta di valine. I punti corrispondenti a GTP, ppGpp e pppGpp sono contrassegnati. Una coltura senza cellule è stata inclusa come controllo negativo (C-). (B) Decadimento di ppGpp dopo l'aggiunta di cloramhenicol per invertire la fame di amminoacidi. L'emivita ppGpp è determinata dal tasso di decadimento esponenziale rappresentato da linee tratteggiate. Le barre di errore riflettono SD dai duplicati. L'asse Y è rappresentato in unascala semilogaritmica (log 2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Raggiungere un'etichettatura quasi uniforme delle cellule è un passo fondamentale per questo protocollo. Pertanto, l'uso di supporti definiti, come i supporti MOPS o Tris, è fondamentale per consentire la variazione delle concentrazioni di fosfato del vettore e dell'attività specifica. Non è possibile utilizzare supporti memorizzati nel buffer del fosfato, ad esempio M9 o A. La maggior parte dei supporti indefiniti contiene quantità variabili di fosfato, come LB, tryptone e acidi casamino. L'isotopo fosfato 33P è un emettitore più debole che può essere sostituito da 32P. I vantaggi della sostituzione sono che è più sicuro e ha un'emivita di 25 giorni invece di 14 giorni per 32P. Tuttavia, le emissioni più energetiche di 32P migliorano considerevolmente la sensibilità al rilevamento. È importante sottolineare i pericoli di lavorare con gli isotopi e l'importanza di utilizzare adeguate protezioni e smaltimento di schermatura. La recente scoperta di un riboswitch in grado di rilevare specificamente ppGpp28 può un giorno portare a un modo più sicuro per rilevare ppGpp in vitro e in vivo. Come accennato nell'introduzione, esistono altri metodi, anche se l'uso dell'etichettatura fosfata rimane un approccio sensibile, diretto e rapido per le misurazioni attraverso-put di batteri (p)ppGpp e di altri composti etichettati con fosfato, come il ribo o deoxyribo-NTP, PRPP, Pipi o fosfati dello zucchero.
Un altro passo critico è quello di garantire che la crescita delle colture parallele (incubatore e lettore di lamiere) sia simile. Quando si studia l'esaurimento dei nutrienti, come lo spostamento diauxic19, la sincronia tra le culture è fondamentale. La comparabilità della crescita su piastre etichettate e non etichettate può essere valutata mediante misurazioni OD600 di un pozzo non etichettato sulla lastra altrimenti radioattiva. Per aumentare il numero di campioni testati, è possibile utilizzare invece una piastra da 96 pozzetti 19, ma la quantità di supporti necessari per ridurre al minimo l'evaporazione ridurrà l'aerazione della coltura. I livelli basali di (p)ppGpp saranno leggermente più alti durante la crescita in una piastra di 96 pozzi rispetto a una piastra di 24 po' a causa della ridotta aerazione. Pertanto, per misurare i livelli basali, si raccomanda una crescita della piastra di 24 pozzi. Per misurare variazioni dei livelli di p)ppGpp più fortemente indotti, è preferibile un pozzo 96. La scelta tra 24 e 96 piastre ben microtiter dipende dall'obiettivo sperimentale.
Le variazioni di questo protocollo hanno molte potenziali applicazioni per diverse condizioni di stress. Recentemente l'abbiamo applicato per misurare l'accumulo e il decadimento di ppGpp durante i classici spostamenti diauxici dal glucosio al lattosio e ad altri zuccheri alternativi. Questi studi hanno rivelato il coinvolgimento della fame di glucosio e della fame di aminoacido19. Qui descriviamo la fame di aminoacido indotta dalla valina nei ceppi di E. coli K12 come una condizione di stress più semplice e ben studiata3. Questo esempio può essere utilizzato come controllo prima di eseguire situazioni di fame più complicate. La fame di amminoacidi può essere provocata aggiungendo quantità limitate di un aminoacido richiesto che si esaurisce durante la crescita; l'aggiunta di un inibitore di aminoacylazione o sintesi del tRNA (idrossido di serino, mupirocina o 3 aminotriazole) o per E. coli K12 aggiungendo valina in assenza di isoleucina). L'idramato serino è spesso usato per inibire l'amminoacylazione del tRNA Ser, ma richiede alte concentrazioni, che possono causare problemi a causa della reattività dell'idrossima con altri composti. L'inversione degli effetti di idrossima serina con l'aggiunta di una grande quantità di serina può avere effetti non desiderati1. Anche se SHX ha dimostrato di essere efficace come diagnostica della produzione di ppGpp, non raccomandiamo il suo uso per studi fisiologici per produrre la fame di aminoacido, perché i normali meccanismi di feedback (p)ppGpp sono aboliti, come le conseguenze fisiologiche dell'abbassamento delle attività superflue, ma che consente l'attivazione di circuiti regolatori di sopravvivenza allo stress.
Le modifiche delle procedure TLC qui descritte sono necessarie per separare correttamente i nucleotidi normativi non canonici, come (p)ppApp29, da campioni misti con (p)ppGpp. È stato dimostrato che pppApp ha un ruolo antagonistico per ppGpp in vitro30,31; pertanto, è necessaria una migliore separazione di entrambi i composti per studi futuri.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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