Summary
हम संवहनी endothelial कोशिकाओं से राइबोसोम बाध्य MRNA शुद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत (ईसी) सीधे माउस मस्तिष्क में, फेफड़ों और दिल के ऊतकों में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विशिष्ट आनुवंशिक टैग के माध्यम से (EGFP) आरएनए शुद्धि के साथ संयोजन में ribosomes .
Abstract
कई अध्ययनों में इन विट्रो सेलुलर assays और पूरे ऊतकों का उपयोग करने के लिए सीमित किया गया है या में ट्रांसट्रो और जीन अभिव्यक्ति के in vitro विश्लेषण के लिए जानवरों से विशिष्ट सेल प्रकार के अलग-अलग QPCR और आरएनए अनुक्रमण द्वारा. जटिल ऊतकों और अंगों में विशिष्ट कोशिका प्रकार के व्यापक ट्रांसक्रिप्टोम और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण होंगे जिसके द्वारा जीन विनियमित होते हैं और ऊतक होमोस्टेसिस और अंग के साथ उनका संबंध होता है कार्यों. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में पशु फेफड़ों के संवहनी endothelia में सीधे vivo में ribosome बाध्य आरएनए के अलगाव के लिए पद्धति का प्रदर्शन. विशिष्ट सामग्री और ऊतक प्रसंस्करण और आरएनए शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाएगा, आरएनए गुणवत्ता और उपज के मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से arteriogenic जीन assays के लिए वास्तविक समय QPCR सहित. इस दृष्टिकोण, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक का अनुवाद के रूप में जाना जाता है, जीन अभिव्यक्ति और जटिल ऊतकों में किसी भी विशिष्ट प्रकार में सीधे विवो में कुछ सेल प्रकार के transcriptome विश्लेषण की विशेषता के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क, हृदय और फेफड़े जैसे जटिल ऊतकों में, सेलुलर विषमता के उच्च स्तर पूरे ऊतक नमूनों से प्राप्त जीन अभिव्यक्ति डेटा के विश्लेषण को जटिल बनाते हैं। विवो में एक विशेष सेल प्रकार में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का निरीक्षण करने के लिए, एक नई पद्धति हाल ही में विकसित किया गया है, जो किसी भी आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार के पूरे अनुवादित MRNA पूरक की पूछताछ की अनुमति देता है. इस पद्धति को अनुवाद ी राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक1,2के रूप में जाना जाता है। यह जानवरों में आनुवंशिक रूप से अन्य एंजियोजेनेसिस-संबद्ध जीनों के साथ संयुक्त होने पर एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान और एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
हमने दिखाया है कि एंजियोजेनिक पीकेडी-1 सिगनल और एंजियोजेनिक जीन सीडी36 का प्रतिलेखन एंडोथेलियल सेल (ईसी) विभेद और कार्यात्मक एंजियोजेनेसिस3,4,5,6के लिए महत्वपूर्ण है। जीन प्रतिलेखन और ईसी transdifferentiation में angiogenic और चयापचय संकेतन के आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए, हम TRAP तकनीक के आधार पर विशेष रूप से नष्ट angiogenic जीन के साथ आनुवंशिक रूप से इंजीनियर TRAP चूहों बनाया है1 , 2. इसके अलावा, हमारे TRAP जानवरों में, न केवल वे संवहनी endothelia या cd36 जीन के वैश्विक विलोपन में pkd-1 या cd36 जीन की कमी है, लेकिन एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) भी आनुवंशिक रूप से टैग किया गया है पर चुनाव आयोग राइबोसोम का अनुवाद कर रहा है। TRAP लक्षित ऊतकों के संवहनी endothelia से सीधे ribosome-बाउंड MRNA के आत्मीयता शुद्धि की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण और नए transcriptomes कि चुनाव आयोग भेदभाव के साथ जुड़े रहे हैं की पहचान को सक्षम करने और विवो स्थितियों में सीधे एंजियोजेनेसिस। हम सफलतापूर्वक इन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों में endothelia से राइबोसोम बाध्य आरएनए अलग है. शुद्ध आरएनए का उपयोग ईसी विभेदऔर कार्यों के विनियमन में एंजियोजेनिक या धमनीजन जीनों के आगे की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सीधे vivo में ECs में MRNA के अलगाव के लिए TRAP दृष्टिकोण को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रदान करता है.
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Protocol
पशु प्रयोगों के लिए, यहाँ वर्णित सभी तरीकों को विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. अभिकर्मकों को तैयार करें
- 10 एम एम हेप्स, पीएच 7.4, 150 एमएम केसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, 0.5 एमएम डीटीटी, 100 मिलीग्राम/एमएल साइक्लोहेमाइड, प्रोटीज़ अवरोधक, और रिकॉमबिनेंट RNase अवरोधकों की सांद्रता के लिए lysis बफर तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित सांद्रता के लिए।
- RNase मुक्त deionized पानी के 500 एमएल करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: 1.19 ग्राम HEPES,5.59 ग्राम KCl के प्रति, 0.24 ग्राम MgCl 2, 35 मिलीग्राम DTT के, cycloheximide के 0.5 एमएल, और NAOH के रूप में pH 7.4, ED-मुक्त ininhibitors 1 और NAOH के रूप में की जरूरत है 1 0 [L/mL)।
- 1 महीने के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर.
- 10 एमएम हैप, पीएच 7.4, 350 एमएम केसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल 2, 1%वॉल/वॉल सीए-630, 0.5 एमएम डीटीटी, और 100 मिलीग्राम/एमएलहाइ साइक्लोक्सीमाइड की सांद्रता के लिए एक उच्च नमक पॉलीसम वॉश बफर तैयार करें।
- RNase मुक्त deionized पानी के 500 एमएल करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: HEPES के 1.19 ग्राम, केसीएल के 13.05 ग्राम, MgCl के 0.24ग्राम, nonionic के 5 एमएल, गैर-denaturing डिटर्जेंट, डीटीटी के 7.7 मिलीग्राम ट्यूबों में से 5, और 0.5 एमएल cyclohemide, और NaOH की जरूरत है 4.
- 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर।
- प्रयोग शुरू करने से पहले प्रोटीन जी चुंबकीय मोती के लिए विरोधी GFP एंटीबॉडी बाइंड.
- प्रोटीन जी मोती के लिए पीबीएस के 200 एमएल में पतला विरोधी GFP एंटीबॉडी के 10 मिलीग्राम जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंत रोटेशन पर अंत के साथ इनक्यूबेट।
- एक चुंबकीय रैक पर मोती प्लेस और supernatant हटा दें.
- पीबीएस के 200 एमएल में मोती को निलंबित करें और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर करें।
- 100 मिलीग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड के साथ बर्फ-ठंडा पीबीएस तैयार करें।
- बर्फ-ठंडा पीबीएस के 99 खंडों में साइक्लोहेक्सीमाइड विलयन (100 मिलीग्राम/एमएल) की 1 मात्रा जोड़ें।
2. अलग और lyse वांछित ऊतकों
- केटामाइन (500 मिलीग्राम/किलोग्राम/शरीर वजन) और xylazine (10 मिलीग्राम/kg/body वजन) के आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें और वांछित ऊतकों (यानी, दिल, फेफड़े) को अलग करें। तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना.
- वांछित ऊतकों को 500 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस में 100 मिलीग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड के साथ रखें।
- एक मोटर चालित homogenizer या एक छोटे से मंजूरी ग्लास homogenizer के साथ एक सेल निलंबन में ऊतक छोटा. यदि एक मोटर चालित homogenizer का उपयोग कर, कम आवृत्ति पर कम से कम 1 मिनट के लिए homogenization सीमा (lt;15,000 हर्ट्ज) आरएनए विकृतीकरण से बचने के लिए.
- पाइपिंग और बफर कई बार redrawing द्वारा lysis बफर के 200 एमएल में सेल गोली निलंबित. इसके अलावा एक मोटर चालित homogenizer में एक छोटे से मंजूरी गिलास homogenizer में 10 स्ट्रोक के साथ या कम आवृत्ति पर 15 सेकंड के लिए सेल निलंबन homogenize.।
- सेंट्रीफ्यूज homogenates के लिए 10 मिनट पर 2,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस गोली नाभिक और बड़े सेल मलबे के लिए, और supernatant रखने के लिए.
- सुपरनेंट में 30 एमएम के लिए nonionic, गैर-डेनेटिंग डिटर्जेंट को 1% vol/vol और DHPC जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
- सेंट्रीफ्यूज lysate के लिए 10 मिनट पर 16,000 x ग्राम गोली अघुलनशील सामग्री के लिए. स्थानांतरण और भविष्य के चरणों के लिए इनपुट के रूप में स्पष्ट lysate के 15% रहते हैं।
3. आइसोलेट राइबोसोम/
- सेल-lysate supernatant और 30 मिनट के लिए अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट मिश्रण करने के लिए एंटीबॉडी-बाउंड मोती के 50 एमएल जोड़ें। यह वह जगह है जहाँ विरोधी GFP एंटीबॉडी GFP-टैग ribosomes बाध्य करेंगे, हमें आगे इन ribosomes से आरएनए को अलग करने के लिए अनुमति देता है.
- एक चुंबकीय रैक पर मोती ले लीजिए और उच्च नमक polysome धोने बफर के साथ 5 बार धो लें।
- एक बार मोती ट्यूब के किनारे पर एकत्र किया है तरल ड्रा और त्यागें। फिर पिपेट और उच्च नमक polysome धोने बफर के 200 एमएल को फिर से बनाना कई बार. इस चरण को 5 बार दोहराएँ और अंतिम पुनरावृत्ति के बाद सभी बफ़र छोड़ ें. तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना.
4. अलग MRNA
- आरएलटी बफर में मोती रखें। निम्नलिखित कदम सीधे RNeasy मिनी किट प्रोटोकॉल से लिया जाता है और किसी भी तरह से पर विस्तार नहीं किया गया.
चेतावनी: RLT बफर guanidine लवण शामिल हैं; ब्लीच के साथ मिश्रण नहीं है. - सेंट्रीफ्यूज lysate के लिए 3 मिनट पूरी गति से 13,000 आरपीएम या 16,000 ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर। सावधानी से पाइपिंग द्वारा 350 एमएल के supernatant निकालें और यह एक नया microfuge ट्यूब में स्थानांतरित. बाद के चरणों में केवल इस सुपरनेंट (lysate) का उपयोगकरें।
- माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 70% इथेनॉल की बराबर मात्रा जोड़ें।
- नमूना के 700 एमएल तक स्थानांतरण, किसी भी वेग है कि गठन किया है हो सकता है सहित, एक स्पिन कॉलम के लिए एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखा. स्पिन कॉलम झिल्ली को धोने के लिए ढक्कन को धीरे से बंद करें और 15 s के लिए $ 8,000 x g पर अपकेंद्रण करें। प्रवाह के माध्यम से छोड़ें.
- स्पिन स्तंभ में 350 एमएल बफ़र RW1 जोड़ें. स्पिन कॉलम झिल्ली को धोने के लिए ढक्कन को धीरे से बंद करें और 15 s के लिए $ 8,000 x g पर अपकेंद्रण करें। प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और अगले चरण में संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें।
चेतावनी: बफर RW1 guanidine लवण शामिल हैं; ब्लीच के साथ मिश्रण नहीं है. - स्पिन स्तंभ में 350 एमएल बफ़र RW1 जोड़ें. ढक्कन को धीरे से बंद करें और अपकेंद्रण के लिए $8,000 x ग्राम पर 15 s. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें.
- स्पिन स्तंभ में 500 एमएल बफ़र RPE जोड़ें. स्पिन कॉलम झिल्ली को धोने के लिए ढक्कन को धीरे से बंद करें और 15 s के लिए $ 8,000 x g पर अपकेंद्रण करें। प्रवाह के माध्यम से छोड़ें.
- स्पिन स्तंभ में 500 एमएल बफ़र RPE जोड़ें. स्पिन कॉलम झिल्ली को धोने के लिए ढक्कन को धीरे से बंद करें और $ 8,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रण। फिर ध्यान से संग्रह ट्यूब से स्पिन स्तंभ निकालें, यह सुनिश्चित करना है कि स्तंभ प्रवाह के माध्यम से संपर्क नहीं करताहै।
- स्पिन कॉलम को एक नए 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें और प्रवाह के माध्यम से पुरानी ट्यूब को त्याग ें। अवशिष्ट बफर को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए पूरी गति से ढक्कन को धीरे से बंद करें और अपकेंद्रित्र।
- स्पिन स्तंभ को एक नया 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें. स्पिन कॉलम झिल्ली के लिए सीधे RNase मुक्त पानी के 30-50 एमएल जोड़ें. ढक्कन को धीरे-धीरे बंद करें और आरएनए को हल करने के लिए $8,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रण।
- यदि अपेक्षित आरएनए उपज है और 30 मिलीग्राम है, तो एक और 30-50 एमएल RNase-मुक्त जल के साथ चरण 4.10 दोहराएँ, या चरण 4.10 से एल्यूट का उपयोग करें (यदि उच्च [RNA] की आवश्यकता है)। चरण 4.10 से पुन: उपयोग संग्रह ट्यूब।
- 1 वर्ष तक के लिए आरएनए-सेकन्सिंग या वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर या स्टोर आरएनए को RNase-मुक्त H2O में भंग कर दिया सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए शुद्ध आरएनए का उपयोग करें।
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Representative Results
हमारे पिछले अध्ययन4,7 सुझाव है कि CD36 LPA/PKD-1 संकेतन मार्ग के माध्यम से धमनी भेदभाव और केशिका धमनी के लिए एक स्विच के रूप में कार्य कर सकते हैं. यह अध्ययन करने के लिए कि क्या LPA/PKD-1-CD36 संकेतन अक्ष विवो में धमनीजनन के लिए आवश्यक है, हमने उपन्यास ट्रैप लाइनों की स्थापना की है जिसमें न केवल वैश्विक सीडी36 की कमी है या एंडोथेलियल-विशिष्ट-cd36- या pkd-1-कमी है बल्कि चयनात्मक अलगाव की अनुमति भी दी गई है GFP द्वारा cre-marked सेल वंशों से रिबोसोम-बाउंड आरएनए की, और एक cre-सक्रिय फ्लोरोसेंट रिपोर्टर2के रूप में उपयोगी होते हैं।
जीनोटाइपिंग करके, हमने देखा कि cd36 जीन विश्व स्तर पर या endothelial-विशिष्ट cd36 नल चूहों के लिए संवहनी endothelia में नष्ट कर दिया गया था (डेटा नहीं दिखाया), और pkd-1 जीन भी संवहनी endothelia में नष्ट कर दिया गया था. चित्र 1 बनाया वैश्विक cd36 TRAP या endothelial-विशिष्ट pkd-1 TRAP माउस लाइन दिखा एक प्रतिनिधि परिणाम है। इम्यूनोफ्लोरेसीमाइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने यह प्रदर्शित किया कि एक उन्नत जीएफपी को वावो में एंडोथेलियल कोशिकाओं के राइबोसोमपर आनुवंशिक रूप से टैग किया गया है (चित्र 2)। तब हमने राइबोसोम बाउंड एमआरएनए को सीधे विवो में अलग किया और 260 दउ और 230 दउ के अनुपात द्वारा दर्शाए अनुसार गुणवत्ता आरएनए को सफलतापूर्वक प्राप्त किया (चित्र 3)। आगे वास्तविक समय QPCR का उपयोग कर विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि कुछ arteriogenic जीन की अभिव्यक्ति cd36 नल चूहों के फेफड़ों endothelia में विनियमित थे (चित्र 4), यह दर्शाता है कि अलग आरएनए सीधे संवहनी endothelia में वीवो में TRAP का उपयोग कर प्रौद्योगिकी डाउनस्ट्रीम अध्ययन के लिए योग्य हैं। इन अध्ययनों में एमआरएनए स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत उपन्यास ट्रांसक्रिप्टम की पहचान शामिल है, जो संवहनी एंडोथेलियल सेल विभेद के विनियमन को समझने के लिए आवश्यक हैं और कार्यात्मक एंजियोजेनेसिस।
चित्र 1: आनुवंशिक रूप से इंजीनियर TRAP चूहों के लिए जीनोटाइपिंग का एक उदाहरण. वैश्विक cd36 नल TRAP चूहों या सशर्त ऊतक-विशिष्ट pkd-1 नल TRAP चूहों के जीनोटाइपिंग के लिए प्रतिनिधि परिणाम. वीईसी-क्रे ट्रांसजेनिक चूहों एक Cdh5 प्रमोटर B6 के नियंत्रण में Cre combinase एक्सप्रेस; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J चूहों B6.129S4-Gt(ROSA)26Sor TM1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/ डबल उत्परिवर्ती cd36 TRAP (ए) और pkd-1 TRAP (बी) चूहों प्राप्त किए गए थे, जिसमें एक बढ़ाया GFP संवहनी endothelial कोशिकाओं में राइबोसोम के एल10a पर टैग किया गया है, और cd36 जीन विश्व स्तर पर नष्ट कर दिया है और pkd-1 जीन विशेष रूप से संवहनी endothelia में. माउस पूंछ एक किट का उपयोग कर डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए थे और निर्माता से निर्देश के आधार पर, और सभी नमूनों में डीएनए polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा परिलक्षित किया गया था, और फिर द्वारा मूल्यांकन 1-2% agarose-जेल electrophoresis. तस्वीरें के साथ cd36 या pkd-1 म्यूटेंट के प्रवर्धन के परिणाम दिखा agarose जेल छवि कर रहे हैं / माउस जीनोटाइप पैनल ए: लेन 1, cd36-/-; TRAP+/-; लेन 2, जाल+/ लेन 3, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; लेन 4, जाल+/ Cdh5+/-; लेन 5, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; लेन 6, cd36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; लेन 7, जाल+/ Cdh5+/-; लेन 8, TRAP+/-; लेन 9, डीएनए सीढ़ी. माउस जीनोटाइप पैनल बी: लेन 1, pkd-1fl/ TRAP+/-; Cdh5+/-; लेन 2, pkd-1fl/ TRAP+/+; Cdh5+/-; लेन 3, pkd-1fl/ TRAP+/+; लेन 4, pkd-1fl/ TRAP+/+; Cdh5+/-; लेन 5, pkd-1fl/ TRAP+/+; Cdh5+/-; लेन 6, pkd-1fl/ लेन 7, डीएनए सीढ़ी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र2: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत एंडोथेलियल-विशिष्ट बढ़ाया GFP अभिव्यक्ति का एक उदाहरण. सीडी36 नॉकआउट TRAP चूहों के फेफड़ों के ऊतकों में रक्त संवहनी endothelia इम्यूनोफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप के तहत EGFP सकारात्मक (हरा रंग, ऊपरी पैनल) थे। प्राथमिक GFP एंटीबॉडी गुम एक नकारात्मक नियंत्रण (नीचे पैनल) के रूप में इस्तेमाल किया गया था. माउस के ऊतकों को जीएफपी और सीडी31 एंटीबॉडी का उपयोग करके उचित माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (लाल रंग) के साथ सह-सना हुआ था। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि छवियों. बार - 200 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एंडोथेलियल कोशिकाओं के राइबोसोमल-बाउंड एमआरएनए की गुणवत्ता और मात्रा शुद्ध और सीधे TRAP चूहों के ऊतकों से निकाले गए। गुणवत्ता और एक cd36 में फेफड़ों के ऊतकों से शुद्ध आरएनए की एकाग्रता के लिए एक उदाहरण TRAP माउस बाहर दस्तक. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की राशि और निकाले आरएनए की शुद्धता के आकलन के लिए इस्तेमाल किया गया था. जैसा कि इस चित्र में दर्शाया गया है, आरएनए की सांद्रता 51ण्2 एनजी/जेडएल है। 260 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषण का अनुपात 1.87 है, जबकि 260 एनएम और 230 एनएम का अनुपात 2.40 है, जो निकाले गए आरएनए नमूनों की शुद्धता को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: वास्तविक समय ुपीसीआर परख द्वारा एंडोथेलियल कोशिकाओं के राइबोसोम-बाउंड आरएनए में एंजियोजेनिक जीन और नोच लिगन्ड्स की अभिव्यक्ति का एक उदाहरण। TRAP नियंत्रण और ईसी-विशिष्ट CD36 कमी TRAP चूहों में फेफड़ों के endothelial ribosome से अलग MRNA वास्तविक समय QPCR परख के अधीन किया गया था, Hey2 सहित एक जैव प्रौद्योगिकी कंपनी से खरीदा प्राइमर का उपयोग कर, ephrin B2, और डेल्टा की तरह लिगेंड 4 (DLL4). घर रखने जीन पीपीआईए सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था। छात्र टी-परीक्षण सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. *पी एंड टी एल ; 0.05; ** पी एंड टी एल टी;0.01|
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Discussion
एंजियोजेनेसिस एक जटिल बहुचरणी प्रक्रिया है, जिसमें ईसी-विशिष्ट एंजियोजेनिक जीन प्रतिलेखन और अभिव्यक्तिईसी विभेद न होने और एंजियोजेनिक रीप्रोग्रामिंग 3, 4 में एक अनिवार्य भूमिका निभातीहै। बेहतर vivo में एक आणविक स्तर पर स्तनधारी संवहनी प्रणाली के समारोह को समझने के लिए सेलुलर विविधता और वास्तु जटिलता से बाधाओं को दूर करने के लिए, हम चुनाव आयोग विशेष TRAP चूहों बनाया है, ईसी-विशिष्ट cd36 के साथ , ईसी-विशिष्ट pkd-1 की कमी या वैश्विक cd36 की कमी एक बहुमुखी floxed TRAP माउस मॉडल या EGFP-TRAP अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस लाइनों के साथ संयोजन में पु प्रयोगशाला2 में उत्पन्न का उपयोग करके. यह ईसी के तहत vivo में बरकरार ऊतकों से संवहनी MCS के पूरे अनुवाद MRNA पूरक की परीक्षा की अनुमति देगा PKD-1 में विशेष या cd36 जीन अभिव्यक्ति8में वैश्विक कमी, जो में जांच के लिए महत्वपूर्ण है शारीरिक और रोगजन्य एंजियोजेनेसिस4,7,9,10से जुड़ा जीन प्रतिलेखन . अन्य अध्ययनों के अनुरूप1,2, ईसी-विशिष्ट MRNA के अलगाव के लिए हमारे दृष्टिकोण ऊतक निर्धारण की जरूरत नहीं है, ऊतकों के वियोजन, या ऊतकों से एकल कोशिकाओं के अलगाव और इस तरह संभावित कलाकृतियों से बचा जाता है कि इन उपचार से परिणाम. हम भी TRAP शुद्धि प्रदर्शन और जमे हुए ऊतकों से गुणवत्ता ribosome बाध्य MRNA निकालने में सक्षम थे. इसके अतिरिक्त, क्या शुद्ध किया गया था सीधे vivo में ECs के अनुवाद MRNA सामग्री है, जो बेहतर जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए कुल आरएनए का उपयोग करने की तुलना में प्रोटीन सामग्री का प्रतिनिधित्व करेंगे. इसके अलावा, TRAP ट्रांसजीन आनुवंशिक रूप से ईजीएफपी के साथ ईसी लेबल, यह भी न केवल राइबोसोम-बाउंड MRNA के निष्कर्षण के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन में दृश्य के लिए।
हालांकि, दृष्टिकोण कम आरएनए पैदावार से पता चला, विशेष रूप से दिल के ऊतकों से या पहले से जमे हुए ऊतकों से शुद्ध MRNA के साथ. इस प्रकार हमें पैदावार बढ़ाने के लिए शर्तों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। हालांकि, हम ईसी-विशिष्ट cd36 कमी चूहों में मनाया, ephrin B2 और DLL4 के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी दोनों फेफड़ों में (चित्र ा04) और दिल (डेटा नहीं दिखाया) endothelia जब नियंत्रण के साथ तुलना में. ये परिणाम हमारे पिछले इन विट्रो अध्ययनों3,4के अनुरूप थे, जिससे पता चलता है कि आर.ए.नए स्वरूप का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। संभवत: कड़े शर्तों के कारण उपज कम थी। इस सीमा पर काबू पाने और उपज में सुधार करने के लिए, यह एक RNase मुक्त काम क्षेत्र स्थापित करने और काम सतहों और उपकरण है कि RNase के साथ दूषित हो सकता है decontaminate और दस्ताने अक्सर बदलने के क्रम में गुणवत्ता आरएनए निकालने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी आत्मीयता मैट्रिक्स में GFP एंटीबॉडी के उपयुक्त सांद्रता खोजने के लिए और ऊतक lysis बफर में RNase अवरोध करनेवाला के उपयुक्त सांद्रता का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. RNase मुक्त प्लास्टिक के बर्तन और अभिकर्मकों का उपयोग लक्षित ऊतकों के endothelial राइबोसोम से आरएनए निष्कर्षण के लिए फायदेमंद है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
डॉ रेन काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (13SDG14800019) द्वारा समर्थित है; बीआर), एन की आशा फाउंडेशन (FP00011709; बीआर), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (86-004-26; MCW कैंसर केंद्र बीआर के लिए), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL136423; बीआर; जॉर्डन Palmer द्वारा समर्थित है 2018 MCW CTSI 500 सितारे इंटर्नशिप कार्यक्रम; पी मोरन NHLBI (5T35 HL072483-34) से एक संस्थागत अनुसंधान प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
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