Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Published: May 25, 2019 doi: 10.3791/59624
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,3, 1, 2, 3, 3,4,5
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

Summary

Мы представляем подход к очищению рибосомы связанных мРНК от сосудистых эндотелиальных клеток (ECs) непосредственно в мозге мыши, легких и тканей сердца через EC-специфический генетический тег расширенного зеленого белка флуоресценции (EGFP) в рибосомы в сочетании с РНК очистки .

Abstract

Многие исследования были ограничены использованием in vitro клеточных анализов и целых тканей или изоляции конкретных типов клеток от животных для анализа в пробирке транскриптома и экспрессии генов qPCR и секвенирования РНК. Всеобъемлющий анализ транскриптома и экспрессии генов конкретных типов клеток в сложных тканях и органах будет иметь решающее значение для понимания клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых регулируются гены, и их связь с гомеостазом тканей и органов Функции. В этой статье мы демонстрируем методологию изоляции рибосомной РНК непосредственно в виво в сосудистой эндофилии легких животных в качестве примера. Будут описаны конкретные материалы и процедуры для обработки тканей и очистки РНК, включая оценку качества и урожайности РНК, а также в режиме реального времени qPCR для атериогенных анализов генов. Этот подход, известный как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техники, могут быть использованы для характеристики экспрессии генов и транскриптома анализа некоторых типов клеток непосредственно in vivo в любом конкретном типе в сложных тканях.

Introduction

В сложных тканях, таких как мозг млекопитающих, сердце и легкие, высокий уровень клеточной неоднородности усложняет анализ данных экспрессии генов, полученных из образцов целых тканей. Для наблюдения за профилями экспрессии генов в определенном типе клеток in vivo недавно была разработана новая методология, которая позволяет дополнить весь переведенный мРНК любого генетически определенного типа клеток. Эта методология известна как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техника1,2. Это полезный инструмент для изучения эндотелиальной клеточной биологии и ангиогенеза в сочетании с генетически манипулирования другими ангиогенез-связанных генов у животных.

Мы показали, что ангиогенные PKD-1 сигнализации и транскрипции ангиогенного гена CD36 имеют решающее значение для эндотелиальной клеточной (EC) дифференциации и функционального ангиогенеза3,4,5,6. Для определения молекулярных механизмов ангиогенной и метаболической сигнализации в транскрипции генов и трансдифференцации ЕС мы создали генетически модифицированных тэктмы с специально удаленными ангиогенными генами на основе метода TRAP1 , 2. Кроме того, у наших животных TRAP, не только они имеют pkd-1 или cd36 дефицит генов в сосудистой эндактелии или глобального удаления гена CD36, но расширенный зеленый белок флуоресценции (EGFP) также генетически помечены на ЕК переводит рибосомы. TRAP позволяет очистки сродства рибосомы связаны мРНК непосредственно из сосудистой эндофелии целевых тканей, что позволяет анализ экспрессии генов и идентификации новых транскриптомов, которые связаны с дифференциацией ЕС и ангиогенез непосредственно под in vivo условиях. Мы успешно выделили рибосомную РНК из эндотелии у этих генетически модифицированных животных. Очищенная РНК может быть использована для дальнейшей характеристики ангиогенных или артериогенных генов в регуляции дифференциации и функций ЕС. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по внедрению подхода TRAP для изоляции мРНК в ECs непосредственно in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для экспериментов на животных, все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию Медицинского колледжа Висконсина.

1. Подготовка реагентов

  1. Приготовьте буфер лизиса к концентрациям 10 мМ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мм DTT, 100 мг/мл циклогексидида, ингибиторы протеазы и рекомбинантные ингибиторы RNase к концентрациям, описанным ниже.
    1. Добавить следующие реагенты до 500 мл безr деионизированной воды: 1,19 г HEPES, 5,59 г KCl, 0,24 г MgCl2, 35 мг DTT, 0,5 мл циклогексидида и NaOH по мере необходимости до pH 7.4, ингибиторы протеазы без EDTA (одна мини-таблетка на 10 мл) и ингибитор RNase (1 0 л/мл).
    2. Хранить в холодильнике 4 градусов по Цельсию до 1 месяца.
  2. Подготовьте буфер высокосолевого полисома для концентрации 10 мМ HEPES, pH 7.4,350 mM KCl, 5 мМ MgCl 2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 m DTT и 100 мг/мл циклогексидида.
    1. Добавьте следующие реагенты до 500 мл безрячной деионизированной воды: 1,19 г HEPES, 13,05 г КЛ, 0,24 г MgCl2, 5 мл необезвительного моющего средства, 5 из 7,7 мг труб ОкТ и 0,5 мл цикофсихи, и 7.
    2. Хранить в холодильнике в 4 градуса на срок до 1 месяца.
  3. Привязать антитела против GFP к магнитным бусинкам Protein G до начала эксперимента.
    1. Добавьте 10 мг анти-GFP антитела, разбавленного в 200 мл PBS в бусы протеина G.
    2. Инкубировать с концом над концом вращения в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Поместите бисер на магнитную стойку и снимите супернатант.
    4. Приостановить бисер в 200 мл PBS и хранить в холодильнике 4 кС на срок до 1 недели.
  4. Подготовка ледяной PBS с 100 мг /мл циклогексидида.
    1. Добавьте 1 том раствора циклогексида (100 мг/мл) к 99 объемам ледяного PBS.

2. Изолировать и лизировать желаемые ткани

  1. Эвтаназия мышей путем инъекций IP кетамина (500 мг/кг/вес тела) и ксилазина (10 мг/кг/масса тела) и изолировать желаемые ткани (т.е. сердце, легкие). Немедленно переходите к следующему шагу.
  2. Поместите желаемые ткани в 500 мл ледяного PBS с 100 мг/мл циклогексидида.
  3. Ткань фарша в клеточную подвеску с мотором-управляемым гомогенизатором или гомогенизатором стекла с небольшой очисткой. При использовании мотор-управляемого гомогенизатора, ограничьте гомогенизацию менее чем 1 минутой при низкой частоте (15 000 Гц), чтобы избежать денатурации РНК.
  4. Приостановить клеточные гранулы в 200 мл буфера из лисиса путем pipetting и перерисовки буфера несколько раз. Дальнейшее гомогенизировать клеточную подвеску 10 штрихами в гомогенизаторе с небольшим разрешением или в течение 15 секунд при низкой частоте (15 000 Гц) в моторном гомогенизаторе.
  5. Центрифуга гомогенаты в течение 10 мин при 2000 х г при 4 градусах Цельсия для ядер гранул и большого мусора клетки, и держать супернатант.
  6. Добавьте неионическое, неденатурное моющее средство до 1% вольт/вольт и DHPC до 30 мМ к супернатанту. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
  7. Центрифуге лизат в течение 10 мин при 16000 х г, чтобы гранулировать нерастворимый материал. Передача и сохранение 15% четкого lysate в качестве ввода для будущих шагов.

3. Комплексы изолировать рибосому/мРНК

  1. Добавьте 50 мл бусин, связанных с антителами, в клеточный лисат и инкубацию смеси при 4 градусах Цельсия с конечным вращением в течение 30 минут. Это где антитела против GFP свяжет GFP-тегами рибосомы, что позволяет нам еще больше изолировать РНК от этих рибосом.
  2. Соберите бусины на магнитной стойке и промыть 5 раз с высоким содержанием соли полисома мыть буфер.
    1. Нарисуйте и отбрасывая жидкость, как только шарики собрали на стороне трубки. Затем пипетка и перерисовывать 200 мл высокосолевого полисомного буфера для мытья несколько раз. Повторите этот шаг 5 раз и отбросьте весь буфер после окончательного повторения. Немедленно переходите к следующему шагу.

4. Изолят мРНК

  1. Поместите бусы в буфер RLT. Следующие шаги сделаны непосредственно из протокола мини-комплекта RNeasy и не были расширены в любом случае.
    ВНИМАНИЕ: RLT буфер содержит соли гуанидина; НЕ смешивайте с отбеливателем.
  2. Центрифуга лизат в течение 3 мин на полной скорости 13000 об/мин или 16000 г при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант 350 мл путем пайпетирования и перенесите его в новую микрофугую трубку. Используйте только этот супернатант (lysate) впоследующих шагах.
  3. Добавьте равный объем в 70% этанола в микрофугую трубку.
  4. Передача до 700 мл образца, включая любой осадок, который мог образоваться, в спин-колонку, помещенную в трубку сбора 2 мл. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Откажитесь от потока через.
  5. Добавьте 350 мл буфера RW1 в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Отбросьте поток через и повторно использовать трубку сбора в следующем шаге.
    ВНИМАНИЕ: Буфер RW1 содержит соли гуанидина; НЕ смешивайте с отбеливателем.
  6. Добавьте 350 мл буфера RW1 в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуги на 15 с на 8000 х г. Откажитесь от потока через.
  7. Добавьте 500 мл буфера RPE в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Откажитесь от потока через.
  8. Добавьте 500 мл буфера RPE в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга в течение 2 мин на 8000 х г, чтобы вымыть мембрану спин-колонки. Затем осторожно удалите колонку спина из трубки сбора, гарантируя, что столбец не контактирует с потокомчерез.
  9. Поместите колонку спина в новую трубку коллекции 2 мл и отбросить старую трубку с потоком через. Закройте крышку осторожно и центрифуги на полной скорости в течение 1 мин, чтобы удалить остаточный буфер.
  10. Поместите колонку спина в новую трубку коллекции 1,5 мл. Добавьте 30-50 мл безрычания воды прямо в мембрану вращающейся колонки. Закройте крышку осторожно и центрифуга в течение 1 мин при 8000 х г, чтобы уэлитировать РНК.
  11. Если ожидаемый выход РНК составляет 30 мг, повторите шаг 4.10 с другой 30-50 мл воды без RNase, или с помощью elute от шага 4.10 (если требуется высокая РНК). Повторное использование трубки для сбора от Step 4.10.
  12. Используйте очищенную РНК для анализа вниз по течению, включая РНК-секвенирование или в реальном времени количественные ПЦР или хранить РНК, растворенную в RNase-свободной H2O при -80 градусов по Цельсию на срок до 1 года.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наши предыдущиеисследования 4,7 предполагают, что CD36 может функционировать как переключатель для артериолярной дифференциации и капиллярной артериализации через LPA/PKD-1 сигнальный путь. Чтобы изучить, является ли LPA/PKD-1-CD36 сигнальной осью имеет важное значение для атериогенеза in vivo, мы установили новые линии TRAP, которые не только имеют глобальный дефицит CD36 или эндотелиального специфического-cd36- или pkd-1-дефицит, но и позволяют селективную изоляцию рибосомно-связанных РНК от cre-marked клеточных линий По GFP, и полезны в качестве креактивированного флуоресцентного репортера2.

Выполняя генотипирование, мы заметили, что ген CD36 был удален глобально или в сосудистой эндотелии для эндотелиальных конкретных cd36 null мышей (данные не показаны), и pkd-1 ген был также удален в сосудистой эндотелии. Рисунок 1 является репрезентативным результатом, показывающим созданную глобальную cd36 TRAP или эндотелиальную линию мыши pkd-1 TRAP. Используя иммунофлуоресцентную микроскопию, мы продемонстрировали, что усовершенствованный GFP генетически помечен на рибосомах эндотелиальных клеток in vivo (рисунок 2). Затем мы выделили рибосому связанную мРНК непосредственно в vivo и успешно получили качественную РНК, как показано при измерении соотношения 260 нм и 230 нм (рисунок 3). Дальнейший анализ с использованием в режиме реального времени qPCR показал, что экспрессия некоторых атерогенных генов были upregulated в легких эндотели cd36 нулевых мышей (рисунок 4), что свидетельствует о том, что изолированные РНК непосредственно в vivo в сосудистой эндафеелии с использованием TRAP технологии квалифицированы для исследований ниже по течению. Эти исследования включают анализ экспрессии генов на уровнях мРНК и выявление новых транскриптомов в физиологических и патологических условиях, которые необходимы для понимания регуляции дифференциации сосудистой эндотелиальной клетки и функциональный ангиогенез.

Figure 1
Рисунок 1: Пример генотипирования для генетически модифицированных мышей TRAP. Представитель результаты для генотипирования глобальных cd36 null TRAP мышей или условных тканей конкретных pkd-1 null TRAP мышей. VEC-cre трансгенных мышей выразить Cre рекомбиназы под контролем Cdh5 промоутер B6; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J мышей были хлеб с B6.129S4-Gt (ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/J, и далее с B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J или pkd-1loxP/PP. Двойной мутант CD36 TRAP (A) и pkd-1 TRAP (B) мышей были получены, в котором расширенный GFP помечены на L10a рибосомы в сосудистых эндотелиальных клеток, и cd36 ген удаляется во всем мире и ген pkd-1 конкретно в сосудистой эндотелии. Мышиные хвосты были собраны для извлечения ДНК с помощью комплекта и на основе инструкции производителя, а ДНК во всех образцах усиливалась полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем оценивалась на 1-2% агарозно-гель электрофорусис. Фотографии агарозного геля изображение, показывающее результаты усиления cd36 или pkd-1 мутантов с / без TRAP или дикого типа (WT) мышей. Панель генотипа мыши A: переулок 1, cd36-/-; ЛОВУШКАNo/-; переулок 2, TRAP/ ); переулок 3, cd36-/-; ЛОВУШКАNo /); Cdh5-/-; переулок 4, TRAP/ ); Cdh5-/-; переулок 5, cd36-/-; ЛОВУШКАNo /); Cdh5-/-; переулок 6, cd36-/-; ЛОВУШКАNo/-; Cdh5-/-; переулок 7, TRAP/ ); Cdh5-/-; переулок 8, TRAP-/-; переулок 9, ДНК лестница. Панель генотипа мыши B: полоса 1, pkd-1fl/-; ЛОВУШКАNo/-; Cdh5-/-; переулок 2, pkd-1fl/fl; ЛОВУШКАNo /); Cdh5-/-; переулок 3, pkd-1fl/-; ЛОВУШКА/КВ; переулок 4, pkd-1fl/fl; ЛОВУШКА/КВ; Cdh5-/-; переулок 5, pkd-1fl/fl; ЛОВУШКАNo /); Cdh5-/-; переулок 6, pkd-1fl/-; переулок 7, ДНК лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Пример эндотелиального экспрессии GFP под флуоресценционным микроскопом. Кровь сосудистых эндотелий в тканях легких CD36 нокаутОМ TRAP мышей были EGFP положительные (зеленый цвет, верхняя панель) под иммунофлюоресценционным микроскопом. Отсутствующие первичные антитела GFP был использован в качестве отрицательного контроля (нижняя панель). Мышиткани были совместно окрашены с помощью GFP и CD31 антител с соответствующими вторичными флуоресценции антител (красный цвет). Репрезентативные изображения, полученные с помощью системы визуализации флуоресцентной микроскопии. Бар No 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Качество и количество рибосомно-связанной мРНК эндотелиальных клеток, очищенных и непосредственно извлеченных из тканей тэм-мышей TRAP. Пример качества и концентрации очищенной РНК из тканей легких в CD36 выбивают TRAP мышь. Для оценки количества и чистоты извлеченной РНК использовался спектрофотометр. Как показано на этом рисунке, концентрация РНК составляет 51,2 нг/Л. Соотношение абсорбции на уровне 260 нм и 280 нм составляет 1,87, тогда как соотношение 260 нм и 230 нм составляет 2,40, что указывает на чистоту извлеченных образцов РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Пример выражения ангиогенных генов и лигандов нот в рибосомно-связанной РНК эндотелиальных клеток по анализу qPCR в реальном времени. Изолированные мРНК от эндотелиальной рибомы легких в TRAP управления и EC-специфических CD36 дефицитных тэк мышей был подвергнут в режиме реального времени qPCR анализы, используя праймеры, приобретенные у биотехнологической компании, включая Hey2, ephrin B2, и дельта, как лиганд 4 (DLL4). Для нормализации использовались гены учета в домашних хозяйствах PPIA. Для статистического анализа использовался тест студента t. -П Злт; 0,05; П.л.;0,01.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором EC-специфической ангиогенной транскрипции генов и экспрессии играют важную роль в дифференциации ЕС и ангиогенного перепрограммирования3,4. Чтобы преодолеть барьеры от клеточного разнообразия и архитектурной сложности для лучшего понимания функции сосудистой системы млекопитающих на молекулярном уровне in vivo, мы создали EC-специфических тэсных мышей, в сопровождении EC-специфических cd36 , EC-специфический дефицит pkd-1 или глобальный дефицит cd36 с помощью универсальной модели мыши trap флокса или EGFP-TRAP, генерируемой в лаборатории Pu2 в сочетании с другими генетически модифицированными линиями мыши. Это позволит изучить весь переведенный мРНК дополнение сосудистых ECs из нетронутых тканей in vivo под EC-специфическим в pkd-1 или глобальный дефицит в экспрессии гена cd36 8, который имеет решающее значение для исследования транскрипция гена, связанная сфизиологическим и патологическим ангиогенезом 4,7,9,10. В соответствии с другими исследованиями1,2, наш подход к изоляции EC-специфической мРНК не нуждается в фиксации тканей, диссоциации тканей, или изоляции одноклеточных от тканей и, таким образом, избегает потенциальных артефактов, которые результатом этих методов лечения. Мы также смогли выполнить TRAP очистки и извлечь качество рибосомы связаны мРНК из замороженных тканей. Кроме того, то, что было очищено, это переведенное содержание мРНК eCs непосредственно in vivo, которое будет лучше представлять содержание белка по сравнению с использованием общей РНК для профиля экспрессии генов. Кроме того, трансген TRAP генетически маркирует ЭК с помощью EGFP, что также позволяет не только извивать мРНК, связанную с рибосомой, но и визуализацию в иммуногистохимических или электрофизиологических исследованиях.

Однако, подход показал низкие урожаи РНК, особенно при очищенной мРНК из тканей сердца или из ранее замороженных тканей. Таким образом, нам необходимо оптимизировать условия для повышения урожайности. Тем не менее, мы наблюдали в EC-специфических cd36 дефицитных мышей, уровни ephrin B2 и DLL4 были значительно увеличены в обоих легких(Рисунок 4) и сердца (данные не показаны) эндотелии по сравнению с контролем. Эти результаты соответствовали нашим предыдущимисследованиям in vitro 3,4,что свидетельствует о том, что качество РНК достаточно для анализа вниз по течению. Урожайность была низкой, возможно, из-за жестких условий. Чтобы преодолеть это ограничение и повысить урожайность, очень важно создать свободную от RNas и обеззараживание рабочих поверхностей и оборудования, которые могут быть загрязнены RNase и часто менять перчатки для извлечения качественной РНК. Также важно найти подходящие концентрации антител GFP в матрице сродства и использовать соответствующие концентрации ингибитора RNase в буфере лизиса ткани. Использование безряльной пластиковой посуды и реагентов, свободных от РНК, полезно для извлечения РНК из эндотелиальных рибосом целевых тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Работа д-ра Рена поддерживается Американской ассоциацией сердца (13SDG148800019; BR), Фонд Надежды Анны (FP00011709; BR), Американское онкологическое общество (86-004-26; MCW онкологический центр в БР), и Национальный институт здравоохранения (HL136423; BR); Джордан Палмер поддерживается 2018 MCW CTSI 500 Звезды стажировки программы; . Моран поддерживается институциональным исследовательским грантом от NHLBI (5T35 HL072483-34).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips Agilent G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers Sarstedt 83.1832
Homogenizers Fisher Scientific K8855100020
Magnet (Dynamag-2) Invitrogen 123-21D Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer Thermo Scientific  ND-2000C
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5430R with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes Applied Biosystems  AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes Applied Biosystems  AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips Rainin RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips Rainin  RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips Rainin  RT-20F
Rotor for homogenizers Yamato  LT-400D
Tube rotator, Labquake brand Thermo Fisher 13-687-12Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

Tags

Биохимия Выпуск 147 Ангиогенез артериолярная дифференциация сосудистые эндотелиальные клетки перевод цибосомного сродства очистки экстракция РНК в реальном времени qPCR
Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R.,… More

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R., Barnekow, N., Palmer, J., Beck, A., Ren, B. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (147), e59624, doi:10.3791/59624 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter