Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Published: May 25, 2019 doi: 10.3791/59624
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,3, 1, 2, 3, 3,4,5
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi presenterer en tilnærming for å rense ribosom-bundet mRNA fra vaskulær endothelial celler (ECs) direkte i mus hjernen, lunge og hjerte vev via EC-spesifikk genetisk kode av forbedret grønt fluorescens protein (EGFP) i ribosomer i kombinasjon med RNA rensing .

Abstract

Mange studier har vært begrenset til å bruke in vitro cellulære analyser og hele vev eller isolere bestemte celletyper fra dyr for in vitro analyse av transcriptome og genuttrykk ved qPCR og RNA sekvensering. Omfattende transcriptome og genuttrykk analyse av bestemte celletyper i komplekse vev og organer vil være avgjørende for å forstå cellulære og molekylære mekanismer som gener er regulert og deres tilknytning til vev homeostase og organ Funksjoner. I denne artikkelen viser vi metodikken for isolering av ribosom RNA direkte in vivo i vaskulær endothelia av animalsk lunger som et eksempel. De spesifikke materialene og prosedyrene for vevs behandling og RNA-rensing vil bli beskrevet, inkludert vurderingen av RNA-kvalitet og-utbytte i tillegg til sanntids qPCR for arteriogenic genanalyser. Denne tilnærmingen, kjent som å oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) teknikk, kan benyttes for karakterisering av genuttrykk og transcriptome analyse av enkelte celletyper direkte i vivo i en bestemt type i komplekse vev.

Introduction

I komplekse vev som pattedyr hjernen, hjerte og lunge, de høye nivåene av cellulære heterogenitet komplisere analyse av genuttrykk data avledet fra hele vevsprøver. For å observere gen uttrykks profiler i en bestemt celle type in vivo, har en ny metodikk blitt utviklet nylig, noe som gjør at avhør av hele oversatte mRNA komplement av genetisk definert celle type. Denne metodikken er kjent som oversette ribosom affinitet rensing (Trap) teknikk1,2. Det er et nyttig redskap for å studere endothelial cellebiologi og angiogenese kombinert med genetisk manipulering av andre angiogenese gener hos dyr.

Vi har vist at angiogenic PKD-1 signalering og transkripsjon av angiogenic Gene CD36 er avgjørende for endothelial celle (EC) differensiering og funksjonell angiogenese3,4,5,6. For å bestemme molekylære mekanismer for angiogenic og metabolske signalering i gen transkripsjon og EC transdifferentiation, har vi skapt genetisk konstruert TRAP mus med spesielt slettet angiogenic gener på grunnlag av TRAP teknikk1 , 2. videre, i våre Trap dyr, ikke bare har de PKD-1 eller cd36 gen mangel i vaskulær endothelia eller global sletting av cd36 Gene, men en forbedret grønn fluorescens protein (EGFP) er også genetisk tagget på EC ' s oversette ribosomer. TRAP tillater affinitet rensing av ribosom-bundet mRNA direkte fra vaskulær endothelia av målrettede vev, slik at analyse av genuttrykk og identifisering av nye transcriptomes som er forbundet med EC differensiering og angiogenese direkte under in vivo-forhold. Vi har med hell isolert ribosom-bundet RNA fra endothelia i disse genetisk konstruerte dyrene. Den renset RNA kan brukes for ytterligere karakterisering av angiogenic eller arteriogenic gener i regulering av EC differensiering og funksjoner. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning for å implementere TRAP-tilnærmingen for isolering av mRNA i ECs direkte in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For dyr eksperimenter, har alle metoder som er beskrevet her blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee av Medical College of Wisconsin.

1. klargjøre reagenser

  1. Klargjør lyseringsbuffer til konsentrasjoner på 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm DTT, 100 mg/ml cycloheximide, protease hemmere og rekombinant RNase-hemmere til konsentrasjoner som beskrevet nedenfor.
    1. Tilsett følgende reagenser til 500 mL RNase deionisert vann: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg DTT, 0,5 ml cycloheximide, og NaOH etter behov til pH-7,4, EDTA-fri protease hemmere (en mini tablett per 10 ml) og RNase-inhibitor (1 0 μL/mL).
    2. Oppbevares i et kjøleskap på 4 ° c i opptil 1 måned.
  2. Forbered en høy-salt polysome vaskebuffer til konsentrasjoner av 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% Vol/Vol CA-630, 0,5 mm DTT, og 100 mg/ml cycloheximide.
    1. Tilsett følgende reagenser til 500 mL RNase-Free deionisert vann: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2, 5 ml ioniske, ikke-denaturering vaskemiddel, 5 av 7,7 mg rør av DTT, og 0,5 ml av cycloheximide, og NaOH etter behov til pH 7,4.
    2. Oppbevares i 4 ° c kjøleskap i opptil 1 måned.
  3. Bind anti-GFP antistoff mot protein G magnetiske perler før du starter eksperimentet.
    1. Tilsett 10 mg anti-GFP antistoff fortynnet i 200 mL av PBS til protein G perler.
    2. Ruge med ende over ende rotasjon i 10 minutter ved romtemperatur.
    3. Plasser perlene på et magnetisk stativ og fjern supernatanten.
    4. Suspendere perlene i 200 mL av PBS og oppbevares i 4 ° c kjøleskap i opptil 1 uke.
  4. Forbered iskald PBS med 100 mg/mL cycloheximide.
    1. Tilsett 1 bind av cycloheximide løsning (100 mg/mL) til 99 volumer av iskald PBS.

2. Isoler og lyse ønsket vev

  1. Euthanize mus ved IP-injeksjon av ketamin (500 mg/kg/kroppsvekt) og xylazine (10 mg/kg/kroppsvekt) og Isoler ønsket vev (dvs. hjerte, lunge). Gå umiddelbart videre til neste trinn.
  2. Plasser ønsket vev i 500 mL iskaldt PBS med 100 mg/mL cycloheximide.
  3. Hakke vev inn i en celle suspensjon med en motor-drevet homogenisator eller en liten-klaring glass homogenisator. Hvis du bruker en motor drevet homogenisator, må du begrense homogenisering til mindre enn 1 minutt ved lav frekvens (< 15000 Hz) for å unngå RNA-denaturering.
  4. Suspendere celle pellet i 200 mL lyseringsbuffer ved pipettering og redrawing opp buffer flere ganger. Ytterligere homogenisere celle fjæring med 10 slag i en liten klaring glass homogenisator eller i 15 sekunder ved lav frekvens (< 15000 Hz) i en motor drevet homogenisator.
  5. Sentrifuger homogenater i 10 min ved 2 000 x g ved 4 ° c til pellets kjerner og store celle rusk, og holde supernatanten.
  6. Legg ioniske, ikke-denaturering vaskemiddel til 1% Vol/Vol og DHPC til 30 mM til supernatanten. Ruge på isen i 5 min.
  7. Sentrifuger lysat i 10 min ved 16 000 x g til pellets uløselig materiale. Forflytning og oppbevare 15% av helt lysat idet input for fremtid skritt.

3. isolere ribosom/mRNA komplekser

  1. Tilsett 50 mL antistoffer-bundet perler til celle-lysat supernatanten og ruge blanding ved 4 ° c med ende-over-ende-rotasjon i 30 min. Det er her de anti-GFP antistoffer vil binde GFP-Tagged ribosomer, slik at vi kan ytterligere isolere RNA fra disse ribosomer.
  2. Samle perler på en magnetisk rack og vask 5 ganger med høy salt polysome vaskebuffer.
    1. Tegn opp og kast væske når perlene har samlet seg på siden av røret. Deretter pipette og tegne opp 200 mL av høy-salt polysome vask buffer flere ganger. Gjenta dette trinnet 5 ganger og Forkast all buffer etter siste gjentakelse. Gå umiddelbart videre til neste trinn.

4. isolere mRNA

  1. Plasser perler i RLT buffer. Følgende trinn er hentet direkte fra RNeasy mini Kit-protokollen og ble ikke utvidet på noen måte.
    FORSIKTIG: RLT buffer inneholder guaniniumtiocyanat alter; IKKE bland med blekemiddel.
  2. Sentrifuger lysat i 3 minutter ved full hastighet 13 000 RPM eller 16 000 g ved 4 ° c. Fjern forsiktig supernatanten av 350 mL ved pipettering og overfør den til et nytt microfuge rør. Bruk bare denne supernatanten (lysat) i etterfølgende trinn.
  3. Legg til et lik volum på 70% etanol i microfuge røret.
  4. Overfør opp til 700 mL av prøven, inkludert eventuelle utfelling som kan ha dannet, til en spin kolonne plassert i en 2 mL samling tube. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 15 s ved ≥ 8 000 x g for å vaske sentrifuge Kol onne membranen. Kast flyten gjennom.
  5. Legg til 350 mL buffer RW1 i Spin-kolonnen. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 15 s ved ≥ 8 000 x g for å vaske sentrifuge Kol onne membranen. Kast flyten gjennom og bruk innsamlings røret på nytt i neste trinn.
    FORSIKTIG: buffer RW1 inneholder guaniniumtiocyanat alter; IKKE bland med blekemiddel.
  6. Legg til 350 mL buffer RW1 i Spin-kolonnen. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 15 s ved ≥ 8 000 x g. Kast flyten gjennom.
  7. Tilsett 500 mL buffer RPE til Spin-kolonnen. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 15 s ved ≥ 8 000 x g for å vaske sentrifuge Kol onne membranen. Kast flyten gjennom.
  8. Tilsett 500 mL buffer RPE til Spin-kolonnen. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 2 minutter ved ≥ 8 000 x g for å vaske sentrifuge Kol onne membranen. Deretter forsiktig fjerne spin kolonnen fra samlingen røret, slik at kolonnen ikke kontakte gjennomstrømning.
  9. Plasser spin-kolonnen i et nytt 2 mL oppsamlings rør og kast det gamle røret med gjennomstrømning. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i full fart i 1 min for å fjerne gjenværende buffer.
  10. Plasser spin-kolonnen i et nytt 1,5 mL prøvetakingsrør. Tilsett 30-50 mL RNase fritt vann direkte til den roterende spalte membranen. Lukk lokket forsiktig og sentrifuger i 1 min ved ≥ 8 000 x g til eluere RNA-en.
  11. Hvis forventet RNA-utbytte er > 30 mg, gjentar du trinn 4,10 med en annen 30-50 mL RNase vann, eller bruker eluere fra trinn 4,10 (Hvis høy [RNA] er nødvendig). Gjenbruk samling tube fra trinn 4,10.
  12. Bruk renset RNA for nedstrøms analyse inkludert RNA-sekvensering eller sann tids kvantitativ PCR eller lagre RNA oppløst i RNase-Free H2O at-80 ° c i opptil 1 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Våre tidligere studier4,7 tyder på at CD36 kan fungere som en bryter for arterioler differensiering og kapillær arterialization via LPA/PKD-1 signalveien. For å studere om LPA/PKD-1-CD36 er essensielt for arteriogenesis in vivo, har vi etablert romanen TRAP-linjer som ikke bare har global CD36-mangel eller endothelial-spesifikk-CD36-eller PKD-1-mangel, men som også tillater selektiv isolering av ribosom-bundet RNA fra grobunn-merket cellelinjene av GFP, og er nyttig som en grobunn-aktivert fluorescerende reporter2.

Ved å utføre genotyperingteknologi observerte vi at cd36-genet ble slettet globalt eller i vaskulær endothelia for endothelial-spesifikke cd36 null mus (data ikke vist), og PKD-1-genet ble også slettet i den vaskulære endothelia. Figur 1 er et representativt resultat som viser den opprettede globale cd36 TRAP-eller endothelial-spesifikke PKD-1 TRAP-mus linjen. Ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi, viste vi at en forbedret GFP er genetisk merket på ribosomer av endothelial cellene in vivo (figur 2). Deretter isolerte vi ribosom bundet mRNA direkte in vivo og oppnådde kvalitets RNA som vist ved måling av forholdet mellom 260 NM og 230 NM (figur 3). Videre analyse ved hjelp av sanntids qPCR demonstrerte at uttrykket av visse arteriogenic gener ble upregulated i lunge endothelia av cd36 null mus (figur 4), noe som indikerer at den isolerte RNA direkte in vivo i den vaskulære endothelia ved hjelp av TRAP teknologi er kvalifisert for nedstrøms studier. Disse studiene inkluderer analyse av genuttrykk på mRNA nivåer og identifisering av romanen transcriptomes under fysiologiske og patologiske tilstander, som er avgjørende for å forstå regulering av vaskulær endothelial celle differensiering og funksjonell angiogenese.

Figure 1
Figur 1: et eksempel på genotyperingteknologi for genetisk KONSTRUERTE Trap-mus. Representative resultater for genotyperingteknologi av global cd36 null TRAP-mus eller betinget vevs spesifikk PKD-1 null Trap-mus. VEC-grobunn transgene mus uttrykker grobunn recombinase under kontroll av en Cdh5 promoter B6; 129-TG (Cdh5-grobunn) 1Spe/J-mus var brød med B 6.129 s4-gt (rosa) 26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-BirA) WTP/J, og videre med b 6.129 S1tm1Mfe-cd36 /J eller PKD-1loxP/loxP. Den doble mutant cd36 Trap (A) og PKD-1 Trap (B) mus ble innhentet, der en forbedret GFP er merket på L10a av ribosom i vaskulære endothelial celler, og cd36 genet slettes globalt og PKD-1 Gene spesielt i vaskulær endothelia. Mus haler ble samlet for DNA-ekstraksjon ved hjelp av et kit og basert på instruksjon fra produsenten, og DNA i alle prøvene ble forsterket av polymerase kjedere reaksjon (PCR), og deretter evaluert av 1-2% agarose-gel elektroforese. Fotografier er agarose gel bilde som viser resultatene av forsterkning av cd36 eller PKD-1 MUTANTER med/uten felle eller Wild type (WT) mus. Mus genotype panel A: Lane 1, cd36-/-; TRAP+/-; kjørefelt 2, TRAP+/+; kjørefelt 3, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 4, TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 5, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 6, cd36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; kjørefelt 7, TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 8, TRAP+/-; Lane 9, DNA stige. Mus genotype panel B: kjørefelt 1, PKD-1fl/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; kjørefelt 2, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 3, PKD-1fl/-; TRAP +/+; kjørefelt 4, PKD-1fl/fl; TRAP +/+; Cdh5+/-; kjørefelt 5, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; kjørefelt 6, PKD-1fl/-; Lane 7, DNA stige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: et eksempel på endothelial FORSTERKET GFP-uttrykk under fluorescens mikroskop. Blod vaskulær endothelia i lunge vev av cd36 knockout felle mus var EGFP positive (grønn farge, øvre panel) under immunofluorescence mikroskop. Manglende det primære GFP-antistoff ble brukt som en negativ kontroll (nederste panel). Mouse vev ble co-beiset ved hjelp GFP og CD31 antistoffer med passende sekundære fluorescens antistoffer (rød farge). Representative bilder ervervet ved hjelp av en fluorescens mikroskopi Imaging system. Bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvaliteten og mengden av ribosomal-bundet mRNA av endothelial celler renset og direkte utvunnet fra vev av Trap mus. Et eksempel på kvalitet og konsentrasjon av renset RNA fra lunge vev i en cd36 Knock Out felle mus. En spektrofotometer ble brukt til vurdering av mengden og renheten til den utpakkede RNA-en. Som vist i dette tallet er konsentrasjonen av RNA 51,2 ng/μL. Forholdet mellom absorbansen ved 260 NM og 280 NM er 1,87 mens forholdet mellom 260 NM og 230 NM er 2,40, noe som indikerer renheten av utdraget RNA prøvene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: et eksempel på uttrykk for angiogenic gener og hakk ligander i den RIBOSOM RNA av endothelial celler ved sanntids qPCR analyser. Den isolerte mRNA fra endothelial ribosom av lunge i TRAP kontroll og EC-spesifikke cd36 mangelfull Trap mus ble utsatt for sanntids qPCR analyser, ved hjelp av primere kjøpt fra et bioteknologisk selskap, inkludert Hey2, ephrin B2, og deltaet som ligand 4 (DLL4). Huset holder gener PPIA ble brukt for normalisering. Studenten t-test ble brukt til statistisk analyse. *P < 0,05; * *P < 0.01.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Angiogenese er en kompleks flertrinnsprosess, der EC-spesifikke angiogenic genet transkripsjon og uttrykk spiller en viktig rolle i EC differensiering og angiogenic omprogrammering3,4. For å overkomme barrierene fra det cellulære mangfoldet og arkitektoniske kompleksiteten for bedre å forstå funksjonen til pattedyr vaskulære system på et molekylnivå i Vivo, har vi opprettet EC-spesifikke FELLE mus, ledsaget av EC-spesifikke cd36 , EC-spesifikk PKD-1- mangel eller global cd36 -mangel ved hjelp av en allsidig FLOXED felle musemodell eller EGFP-Trap generert i PU laboratorium2 i kombinasjon med andre genetisk konstruerte muse linjer. Dette vil tillate undersøkelse av hele oversatte mRNA komplement av vaskulær ECs fra intakt vev in vivo under EC-spesifikke i PKD-1 eller global mangel i cd36 Gene Expression8, som er avgjørende for etterforskning Gene transkripsjon forbundet med fysiologiske og patologiske angiogenese4,7,9,10. I samsvar med andre studier1,2, vår tilnærming til isolering av EC-spesifikke mRNA ikke trenger vev fiksering, dissosiasjon av vev, eller isolering av enkeltceller fra vev og dermed unngår de potensielle gjenstander som følge av disse behandlingene. Vi var også i stand til å utføre TRAP renselser og ekstrakt kvalitet ribosom-bundet mRNA fra frosne vev. I tillegg, det som ble renset er det oversatte mRNA-innholdet i ECs direkte in vivo, noe som vil bedre representere proteininnholdet sammenlignet med å bruke den totale RNA for gen uttrykks profilen. Videre har TRAP transgene genetisk etiketter av ECs med EGFP, også tillater ikke bare for ekstraksjon av ribosom-bundet mRNA men også for visualisering i immunhistokjemiske eller elektrofysiologisk studier.

Imidlertid viste tilnærmingen lav RNA gir, spesielt med renset mRNA fra hjertet vev eller fra tidligere frosset vev. Vi må derfor optimalisere forholdene for å øke avkastningen. Men vi observerte i EC-spesifikke cd36 mangelfull mus, nivåene av ephrin B2 og DLL4 var betydelig økt i både lunge (Figur 4) og hjerte (data ikke vist) endothelia sammenlignet med kontrollen. Disse resultatene var i samsvar med våre tidligere in vitro studier3,4, noe som tyder på at RNA kvaliteten er tilstrekkelig for nedstrøms analyse. Utbyttet var lav muligens på grunn av de strenge forholdene. For å overkomme denne begrensningen og øke utbyttet, er det avgjørende å sette opp en RNase-fri arbeidssone og decontaminate arbeidsflater og utstyr som kan bli forurenset med RNase og skifte hansker ofte for å trekke ut kvalitet RNA. Det er også viktig å finne egnede konsentrasjoner av GFP-antistoffer i affinitet matrise og bruke egnede konsentrasjoner av RNase-hemmer i vevs lyseringsbufferen. Bruk av RNase-fri plast ware og reagenser er gunstig for RNA-ekstraksjon fra endothelial ribosomer av det målrettede vevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dr. ren arbeid er støttet av American Heart Association (13SDG14800019; BR), Ann ' s Hope Foundation (FP00011709; BR), American Cancer Society (86-004-26, den MCW Cancer Center til BR), og National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan palmer er støttet av 2018 MCW CTSI 500 Stars internship program; P. Moran er støttet av en institusjonell Research Training Grant fra NHLBI (5T35 HL072483-34).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips Agilent G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers Sarstedt 83.1832
Homogenizers Fisher Scientific K8855100020
Magnet (Dynamag-2) Invitrogen 123-21D Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer Thermo Scientific  ND-2000C
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5430R with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes Applied Biosystems  AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes Applied Biosystems  AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips Rainin RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips Rainin  RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips Rainin  RT-20F
Rotor for homogenizers Yamato  LT-400D
Tube rotator, Labquake brand Thermo Fisher 13-687-12Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

Tags

Biokjemi angiogenese arterioler differensiering vaskulær endothelial celler oversette ribosom affinitet rensing RNA utvinning sanntid qPCR
Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R.,… More

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R., Barnekow, N., Palmer, J., Beck, A., Ren, B. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (147), e59624, doi:10.3791/59624 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter