Summary
我们通过结合RNA纯化结合的增强绿色荧光蛋白(EGFP)的EC特异性遗传标记,直接在小鼠脑、肺和心脏组织中直接从小鼠脑、肺和心脏组织中从血管内皮细胞(EC)中纯化核糖体结合体mRNA的mRNA。.
Abstract
许多研究仅限于使用体外细胞测定和整组织,或从动物中分离特定细胞类型,通过qPCR和RNA测序对转录组和基因表达进行体外分析。对复杂组织和器官中特定细胞类型的全面转录和基因表达分析对于了解基因调控的细胞和分子机制及其与组织平衡和器官的关系至关重要功能。本文以动物肺血管内皮内皮直接在体内分离核糖体结合RNA的方法为例。将描述组织处理和RNA纯化的具体材料和程序,包括RNA质量和产量的评估以及动脉生成基因测定的实时qPCR。这种方法,称为翻译核糖体亲和纯化(TRAP)技术,可用于基因表达的表征和转录组分析某些细胞类型直接在体内任何特定类型的复杂组织。
Introduction
在哺乳动物大脑、心脏和肺等复杂组织中,细胞异质性水平高使从整个组织样本中提取的基因表达数据分析复杂化。为了观察体内特定细胞类型的基因表达图谱,最近开发了一种新方法,允许对任何基因定义的细胞类型的整个翻译的mRNA补充进行查询。这种方法被称为翻译核糖体亲和纯化(TRAP)技术1,2。当与基因操纵动物中其他血管生成相关基因时,它是研究内皮细胞生物学和血管生成的有用工具。
我们已经表明,血管生成PKD-1信号和血管生成基因CD36的转录对内皮细胞(EC)分化和功能血管生成3,4,5,6至关重要。为了确定基因转录和EC转导中血管生成和代谢信号的分子机制,我们根据TRAP技术1创建了具有特定删除血管生成基因的转基因TRAP小鼠。,2.此外,在我们的TRAP动物中,它们不仅在血管内皮瘤或CD36基因的全局缺失中缺乏pkd-1或cd36基因,而且增强的绿色荧光蛋白(EGFP)也基因标记到EC正在翻译核糖体。TRAP允许直接从靶向组织的血管内皮内,对核糖体结合的mRNA进行亲亲化纯化,从而能够分析基因表达和识别与EC分化相关的新转录体,血管生成直接在体内条件。我们已经成功地从这些基因工程动物的内皮内皮体中分离出核糖体结合的RNA。纯化RNA可用于在调节EC分化和功能方面进一步描述血管生成或动脉生成基因。该协议提供了一个分步指南,用于实现TRAP方法,用于直接在体内的EC中分离mRNA。
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Protocol
对于动物实验,这里描述的所有方法都已获得威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 制备试剂
- 制备解液缓冲液,浓度为10 mM HEPES,pH 7.4,150 mM KCl,5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL 环己酰胺, 蛋白酶抑制剂, 和重组RNase抑制剂的浓度如下所述.
- 将以下试剂添加到 500 mL 的无 RNase 脱离子水:1.19 克 HEPES, 5.59 g KCl,0.24g MgCl 2,35毫克DTT,0.5 mL环氧西米,和NaOH根据需要,直到pH 7.4,无EDA蛋白酶抑制剂(每10mL一个迷你片剂)和RNase抑制剂(10 μL/mL)。
- 存放在 4°C 冰箱中长达 1 个月。
- 制备高盐多体洗涤缓冲液,浓度为10 mM HEPES、pH 7.4、350 mM KCl、5mM MgCl 2、1% vol/vol CA-630、0.5 mM DTT 和 100 mg/mL 环氧西米。
- 在500 mL无RNase脱离子水中加入以下试剂:1.19克的HEPES、13.05克的KCl、0.24克的MgCl2、5 mL的非离子、非变性洗涤剂、5个7.7毫克的DTT管中的5个、0.5 mL的环和甲酰胺,以及需要到PH 7.4的NaOH。
- 储存在4°C冰箱长达1个月。
- 在开始实验之前,将抗GFP抗体结合到蛋白G磁珠中。
- 在200 mL的PBS中加入10毫克的抗GFP抗体,加入蛋白G珠。
- 在室温下,在结束端旋转下孵育10分钟。
- 将磁珠放在磁性机架上并取出上清液。
- 将珠子悬浮在 200 mL 的 PBS 中,并储存在 4°C 冰箱中长达 1 周。
- 用100毫克/mL环氧西米制备冰冷的PBS。
- 将1卷环己酰胺溶液(100mg/mL)加入99卷冰冷的PBS。
2. 分离和莱沙所需的组织
- 通过IP注射氯胺酮(500毫克/千克/体重)和木拉津(10毫克/千克/体重)对小鼠实施安乐死,并分离所需的组织(即心脏、肺)。立即继续下一步。
- 将所需组织放入500 mL的冰冷PBS中,加入100mg/mL环氧西米。
- 使用电机驱动的均质器或小间隙玻璃均质器将薄荷组织放入细胞悬浮液中。如果使用电机驱动的均质器,在低频(<15,000 Hz)下将均质化限制在1分钟以下,以避免RNA变性。
- 通过移液和多次重绘缓冲液,在200 mL的赖沙缓冲液中悬浮细胞颗粒。在小间隙玻璃均质器中,在 10 冲程下,或在电机驱动均质器中,在低频(<15,000 Hz)下,使用 10 冲程进一步均匀化电池悬架。
- 离心在4°C下在2000 x g下与质同质10分钟,与颗粒核和大细胞碎片分离,并保持上清液。
- 将非离子、非变性洗涤剂添加到 1% vol/vol 和 DHPC 到 30 mM 到上清液。在冰上孵育5分钟。
- 在16,000 x g颗粒不溶性材料下,离心溶酶10分钟。并保留 15% 的明确莱沙,作为未来步骤的输入。
3. 分离核糖体/mRNA复合物
- 在细胞解毒液上清液中加入50 mL的抗体结合珠,并在4°C下孵育混合物,在端端旋转30分钟。这是抗GFP抗体将结合GFP标记核糖体,使我们能够进一步分离RNA从这些核糖体。
- 在磁性机架上收集珠子,用高盐聚体洗涤缓冲液洗涤5次。
- 收集并丢弃液体后,珠子已收集到管的一侧。然后移液器,重新绘制200 mL的高盐聚体洗涤缓冲液几次。重复此步骤 5 次,并在最后重复后丢弃所有缓冲区。立即继续下一步。
4. 分离 mRNA
- 将珠子放入 RLT 缓冲液中。以下步骤直接从 RNasy 迷你套件协议中执行,并且未以任何方式展开。
注意:RLT缓冲液含有瓜尼丁盐;请勿与漂白剂混合。 - 离心性莱沙在全速13,000rpm或16,000g4°C下,3分钟。通过移液小心地去除350 mL的上清液,并将其转移到新的微熔管中。在后续步骤中仅使用此上清液(利沙)。
- 在微熔管中加入同等体积的70%乙醇。
- 将高达 700 mL 的样品(包括可能形成的任何沉淀物)转移到放置在 2 mL 收集管中的旋转柱上。轻轻合上盖子,以±8,000 x g的速度离心15s,以清洗旋转柱膜。丢弃流通过。
- 将 350 mL 的缓冲区 RW1 添加到旋转列。轻轻合上盖子,以±8,000 x g的速度离心15s,以清洗旋转柱膜。在下一步中放弃流通并重用收集管。
注意:缓冲RW1含有瓜尼丁盐;请勿与漂白剂混合。 - 将 350 mL 的缓冲区 RW1 添加到旋转列。轻轻合上盖子,以 ±8,000 x g的速度离心 15 s。丢弃流通过。
- 将 500 mL 的缓冲 RPE 添加到旋转列。轻轻合上盖子,以±8,000 x g的速度离心15s,以清洗旋转柱膜。丢弃流通过。
- 将 500 mL 的缓冲 RPE 添加到旋转列。轻轻合上盖子,以±8,000 x g从心2分钟清洗旋转柱膜。然后小心地从收集管中取出旋转柱,确保该柱不接触流通。
- 将旋转柱放入新的 2 mL 收集管中,然后丢弃带有流通的旧管。轻轻合上盖子,全速离心1分钟,取出残留缓冲液。
- 将旋转柱放入新的 1.5 mL 收集管中。将30-50 mL的无RNase水直接添加到自旋柱膜中。轻轻合上盖子,以±8,000 x g离心1分钟,使RNA排出。
- 如果预期RNA产量为>30 mg,则用另外30-50 mL的无RNase水重复步骤4.10,或使用步骤4.10(如果需要高[RNA])。从步骤 4.10 重用收集管。
- 使用纯化RNA进行下游分析,包括RNA测序或实时定量PCR,或储存溶解在无RNase H2O中的RNA,在-80°C下长达1年。
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Representative Results
我们先前的研究4,7表明CD36可能作为动脉分化和毛细管动脉化的开关通过LPA/PKD-1信号通路。为了研究LPA/PKD-1-CD36信号轴对体内动脉生成是否至关重要,我们建立了新的TRAP线,不仅具有全球cd36缺乏或内皮特异性cd36或pkd-1缺陷,而且还允许选择性隔离GFP从有克雷标记的细胞谱系中核糖体结合的RNA,作为活化荧光报告器2有用。
通过进行基因分型,我们观察到cd36基因在全球或血管内皮内切内切内切中被删除,用于内皮特异性cd36空小鼠(未显示数据),pkd-1基因也在血管内皮瘤中被删除。图 1 是显示创建的全局 cd36 TRAP 或内皮特 pkd-1 TRAP 鼠标行的代表性结果。使用免疫荧光显微镜,我们证明了增强的GFP在基因标记在体内内皮细胞的核糖体上(图2)。然后,我们直接在体内分离核糖体结合mRNA,并成功地获得了质量RNA,如260纳米和230纳米的比例测量所示(图3)。使用实时qPCR的进一步分析表明,cd36空小鼠的肺内皮瘤中某些动脉基因的表达得到调节(图4),表明使用TRAP在血管内皮内直接在体内分离的RNA技术有资格参加下游研究。这些研究包括分析mRNA水平的基因表达和在生理和病理条件下鉴定新转录体,这对于理解血管内皮细胞分化的调节至关重要和功能性血管生成。
图1:基因工程TRAP小鼠基因分型的例子。全球cd36空TRAP小鼠或条件组织特异性pkd-1空TRAP小鼠的基因分型代表性结果。VEC-cre转基因小鼠在Cdh5启动子B6的控制下表达Cre重组酶;129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J 小鼠是面包与 B6.129S4-Gt (ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a, -birA) Wtp/J,并进一步与 B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J 或pkd-1loxP/loxP / loxP.获得了双突变CD36 TRAP(A)和pkd-1 TRAP(B)小鼠,其中增强的GFP被标记在血管内皮细胞核糖体的L10a上,cd36基因在全球范围内被删除, pkd-1基因,具体在血管内皮内皮。用试剂盒收集小鼠尾巴进行DNA提取,并根据制造商的指示,所有样品中的DNA被聚合酶链反应(PCR)放大,然后经1-2%的甘蔗糖凝胶电泳评估。照片是agarose凝胶图像,显示cd36或pkd-1突变体扩增的结果,带/没有TRAP或野生类型(WT)小鼠。小鼠基因型面板A: 通道 1, cd36-/-;陷阱+/-;车道 2, TRAP[/];车道 3, cd36-/-;陷阱[/]Cdh5+/-;车道 4, 陷阱[ /];Cdh5+/-;车道 5, cd36-/-;陷阱[/]Cdh5+/-;车道 6, cd36-/-;陷阱+/-;Cdh5+/-;车道 7, TRAP[/];Cdh5+/-;车道 8, TRAP+/-;9号车道 DNA梯子小鼠基因型面板B: 通道 1, pkd-1fl/-;陷阱+/-;Cdh5+/-;车道 2, pkd-1fl/fl;陷阱[/]Cdh5+/-;车道 3, pkd-1fl/-;陷阱*/*;车道4,pkd-1fl/fl;陷阱*/*;Cdh5+/-;车道5,pkd-1fl/fl;陷阱[/]Cdh5+/-;车道 6, pkd-1fl/-;车道7,DNA梯子。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:荧光显微镜下内皮特异性增强GFP表达的例子。CD36敲除TRAP小鼠肺组织中的血管内皮瘤在免疫荧光显微镜下为EGFP阳性(绿色,上面板)。缺少主GFP抗体被用作负对照(底部面板)。使用GFP和CD31抗体与适当的二级荧光抗体(红色)共同染色小鼠组织。使用荧光显微镜成像系统获取的代表性图像。条形图 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:从TRAP小鼠组织直接提取的内皮细胞核糖体结合mRNA的质量和数量。cd36中肺组织中纯化RNA的质量和浓度示例敲出 TRAP 小鼠。分光光度计用于评估提取的RNA的量和纯度。如图所示,RNA的浓度为51.2纳克/μL。260 nm 和 280 nm 的吸收率为 1.87,而 260 nm 和 230 nm 的比率为 2.40,表明提取的 RNA 样品的纯度。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:通过实时qPCR测定,在内皮细胞核糖体结合RNA中表达血管生成基因和Notch配体的例子。在TRAP对照和EC特异性CD36缺陷TRAP小鼠的肺内皮核糖体中分离的mRNA,使用从包括Hey2、ephrin B2和配体等三角洲等生物技术公司购买的引物进行实时qPCR检测4 (DLL4)。房屋保持基因PPIA用于规范化。学生t-测试用于统计分析。 •P < 0.05;•P <0.01.
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Discussion
血管生成是一个复杂的多步骤过程,其中EC特异性血管原基因转录和表达在EC分化和血管生成重编程3,4中起着至关重要的作用。为了克服细胞多样性和结构复杂性的障碍,以更好地了解哺乳动物血管系统在体内分子水平上的功能,我们创建了EC特异性TRAP小鼠,并配以EC特异性cd36,EC特异性pkd-1缺乏或全球cd36缺乏,使用在Pu实验室2中生成的多功能絮状TRAP小鼠模型或EGFP-TRAP与其他基因工程小鼠线相结合。这将允许检查整个翻译的mRNA补充血管EC从完整的组织在免疫中在EC特异性在pkd-1或全球缺乏cd36基因表达8,这是调查的关键与生理和病理血管生成相关的基因转录4,7,9,10。与其他研究1,2一致,我们分离EC特异性mRNA的方法不需要组织固定,组织分离,或单细胞从组织分离,从而避免潜在的伪影,这些治疗的结果。我们还能够执行TRAP纯化,并从冷冻组织中提取高质量的核糖体结合mRNA。此外,被纯化的是直接在体内的ECs的翻译mRNA含量,与使用总RNA进行基因表达谱相比,可以更好地代表蛋白质含量。此外,TRAP转基因基因用EGFP标记ECs,不仅允许提取核糖体结合的mRNA,还可用于免疫组织化学或电生理学研究中的可视化。
然而,这种方法显示RNA产量较低,特别是从心脏组织或以前冷冻的组织中纯化的mRNA。因此,我们需要优化条件以提高产量。然而,我们在EC特异性cd36缺陷小鼠中观察到,与对照相比,肺内皮(图4)和心脏(未显示的数据)内皮内皮内膜的ephrin B2和DLL4水平显著增加。这些结果与我们以前的体外研究3,4一致,这表明RNA质量足以进行下游分析。产量较低可能是由于严格的条件。为了克服这一限制并提高产量,建立无RNase工作区并净化可能受到RNase污染的工作面和设备,并经常更换手套以提取高质量的RNA至关重要。在亲和基质中找到适当的GFP抗体浓度并在组织解液缓冲液中使用适当浓度的RNase抑制剂也至关重要。使用无RNase塑料ware和试剂有利于从靶中体内皮核糖体中提取RNA。
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Disclosures
提交人声明他们之间没有利益冲突。
Acknowledgments
任博士的工作得到了美国心脏协会(13SDG14800019)的支持;BR),安的希望基金会(FP00011709;BR)、美国癌症协会(86-004-26;MCW癌症中心至BR)和国家卫生研究院(HL136423;BR);乔丹·帕尔默得到2018年MCW CTSI 500明星实习计划的支持;P. Moran 得到 NHLBI (5T35 HL072483-34) 的机构研究培训资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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