Summary
Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .
Abstract
Muchos estudios se han limitado al uso de ensayos celulares in vitro y tejidos enteros o el aislamiento de tipos celulares específicos de animales para el análisis in vitro del transcriptoma y la expresión génica mediante la secuenciación de qPCR y ARN. El análisis exhaustivo del transcriptoma y la expresión génica de tipos específicos de células en tejidos y órganos complejos será fundamental para comprender los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales se regulan los genes y su asociación con la homeostasis tisular y el órgano Funciones. En este artículo, demostramos la metodología para el aislamiento del ARN ligado a ribosoma directamente in vivo en la endotelia vascular de los pulmones de animales como ejemplo. Se describirán los materiales y procedimientos específicos para el procesamiento de tejidos y la purificación del ARN, incluida la evaluación de la calidad y el rendimiento del ARN, así como el qPCR en tiempo real para ensayos genéticos arteriogénicos. Este enfoque, conocido como la técnica de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP), se puede utilizar para la caracterización de la expresión génica y el análisis del transcriptoma de ciertos tipos de células directamente in vivo en cualquier tipo específico en tejidos complejos.
Introduction
En tejidos complejos como el cerebro, el corazón y el pulmón de los mamíferos, los altos niveles de heterogeneidad celular complican el análisis de los datos de expresión génica derivados de muestras de tejidos enteros. Para observar perfiles de expresión génica en un tipo de célula en particular in vivo, recientemente se ha desarrollado una nueva metodología, que permite el interrogatorio de todo el complemento de ARNm traducido de cualquier tipo de célula definida genéticamente. Esta metodología se conoce como la técnica de purificación de afinidad ribosoma de traducción (TRAP)1,2. Es una herramienta útil para estudiar la biología de las células endoteliales y la angiogénesis cuando se combina con la manipulación genética de otros genes asociados a la angiogénesis en animales.
Hemos demostrado que la señalización angiogénica PKD-1 y la transcripción del gen angiogénico CD36 son fundamentales para la diferenciación de células endoteliales (EC) y la angiogénesis funcional3,4,5,6. Para determinar los mecanismos moleculares de señalización angiogénica y metabólica en transcripción de genes y transdiferenciación EC, hemos creado ratones TRAP genéticamente diseñados con genes angiogénicos específicamente eliminados sobre la base de la técnica TRAP1 , 2. Además, en nuestros animales TRAP, no sólo tienen deficiencia de genes pkd-1 o cd36 en la endotelia vascular o deleción global del gen cd36, sino que una proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) también está genéticamente etiquetada en La EC está traduciendo ribosomas. TRAP permite la purificación de afinidad de ARNm ligada a ribosomas directamente de la endotelia vascular de los tejidos específicos, lo que permite el análisis de la expresión génica y la identificación de nuevos transcriptomes asociados con la diferenciación de la CE y angiogénesis directamente en condiciones in vivo. Hemos aislado con éxito el ARN ligado al ribosoma de la endotelia en estos animales genéticamente diseñados. El ARN purificado se puede utilizar para una mayor caracterización de genes angiogénicos o arteriogénicos en la regulación de la diferenciación y las funciones de la CE. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para implementar el enfoque TRAP para el aislamiento de arNM en los CE directamente in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Para experimentos con animales, todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Wisconsin.
1. Preparar reactivos
- Preparar el tampón de lisis a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL cicloheximida, inhibidores de la proteasa e inhibidores de rNase recombinante a las concentraciones como se describe a continuación.
- Añadir los siguientes reactivos a 500 ml de agua desionizada libre de RNase: 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de TDT, 0,5 ml de cicloheximida y NaOH según sea necesario hasta pH 7,4, inhibidores de la proteasa libre de EDTA (un mini comprimido por 10 ml) e inhibidor de la rnalosa (1 0 L/ml).
- Conservar en nevera de 4oC durante un máximo de 1 mes.
- Preparar un tampón de lavado de polisome de alta sal a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 mM DTT, y 100 mg/mL cicloheximida.
- Añadir los siguientes reactivos a 500 ml de agua desionizada libre de RNase: 1,19 g de HEPES, 13,05 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 5 ml de detergente no iónico y no desnaturalizante, 5 de 7,7 mg de tubos de TDT y 0,5 ml de cicloximida y NaOH según sea necesario pH 7.4.
- Conservar en nevera de 4oC durante un máximo de 1 mes.
- Enlazar anticuerpoanti-GFP a las perlas magnéticas de la proteína G antes de iniciar el experimento.
- Añadir 10 mg de anticuerpo anti-GFP diluido en 200 ml de PBS a cuentas de proteína G.
- Incubar con rotación final sobre extremo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque las perlas en un bastidor magnético y retire el sobrenadante.
- Suspenda las perlas en 200 ml de PBS y guárdelas en nevera de 4 oC durante un máximo de 1 semana.
- Preparar PBS helado con 100 mg/ml de cicloheximida.
- Añadir 1 volumen de solución de cicloheximida (100 mg/ml) a 99 volúmenes de PBS helado.
2. Aísle y lise los tejidos deseados
- Euantalice ratones mediante inyección IP de ketamina (500 mg/kg/peso corporal) y xilazina (10 mg/kg/peso corporal) y aísle los tejidos deseados (es decir, corazón, pulmón). Proceda inmediatamente al siguiente paso.
- Coloque los tejidos deseados en 500 ml de PBS helado con 100 mg/ml de cicloheximida.
- Tejido de picado en una suspensión celular con un homogeneizador motorizado o un homogeneizador de vidrio de pequeño espacio libre. Si utiliza un homogeneizador motorizado, limite la homogeneización a menos de 1 minuto a baja frecuencia (<15.000 Hz) para evitar la desnaturalización del ARN.
- Suspenda el gránulos celulares en 200 ml de tampón de lisis pipeteando y redibujando el tampón varias veces. Homogeneizar aún más la suspensión celular con 10 golpes en un homogeneizador de vidrio de separación pequeña o durante 15 segundos a baja frecuencia (<15.000 Hz) en un homogeneizador accionado por motor.
- La centrifugadora homogeneiza durante 10 min a 2.000 x g a 4 oC a núcleos de pellets y residuos de células grandes, y mantener el sobrenadante.
- Agregue detergente no iónico y no desnaturalizante a 1% vol/vol y DHPC a 30 mM al sobrenadante. Incubar sobre hielo durante 5 min.
- Lisato de centrífuga durante 10 min a 16.000 x g para pellets de material insoluble. Transfiera y mantenga el 15% de lisado claro como entrada para pasos futuros.
3. Aislar los complejos ribosoma/arnm
- Añadir 50 ml de perlas ligadas a anticuerpos al sobrenadante de lisado celular e incubar la mezcla a 4 oC con rotación de extremo sobre extremo durante 30 min. Aquí es donde los anticuerpos anti-GFP unirán los ribosomas etiquetados por gFP, lo que nos permite aislar aún más el ARN de estos ribosomas.
- Recoger las perlas en un estante magnético y lavar 5 veces con tampón de lavado de polisome de alta sal.
- Elaborar y desechar el líquido una vez que las perlas se hayan acumulado en el lado del tubo. A continuación, pipetear y volver a dibujar 200 ml de tampón de lavado de polisome de alta sal varias veces. Repita este paso 5 veces y descarte todo el búfer después de la repetición final. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
4. Aislar el ARNm
- Coloque los cordones en el búfer RLT. Los siguientes pasos se toman directamente desde el protocolo RNeasy mini kit y no se ampliaron de ninguna manera.
ADVERTENCIA: El tampón RLT contiene sales de guanidina; NO mezcle con lejía. - Lisato de centrífuga durante 3 min a velocidad máxima 13.000 rpm o 16.000 g a 4oC. Retire con cuidado el sobrenadante de 350 ml pipeteando y transfieralo a un nuevo tubo de microfófuga. Utilice sólo este sobrenadante (lysate) en los pasossiguientes.
- Agregue un volumen igual de etanol al 70% en el tubo de microfusión.
- Transfiera hasta 700 ml de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a una columna de espín colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo.
- Agregue 350 ml de búfer RW1 a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo y reutilice el tubo de recogida en el siguiente paso.
ADVERTENCIA: Buffer RW1 contiene sales de guanidina; NO mezcle con lejía. - Agregue 350 ml de búfer RW1 a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo.
- Agregue 500 mL de buffer RPE a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo.
- Agregue 500 mL de buffer RPE a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 2 minutos a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. A continuación, retire cuidadosamente la columna de giro del tubo de recogida, asegurándose de que la columna no entre en contacto con el flujo a través.
- Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y deseche el tubo viejo con el flujo. Cierre la tapa suavemente y centrifugar a toda velocidad durante 1 min para eliminar el tampón residual.
- Coloque la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Agregue 30-50 ml de agua libre de RNase directamente a la membrana de la columna de centrifugado. Cierre suavemente la tapa y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g para eluir el ARN.
- Si el rendimiento esperado del ARN es >30 mg, repita el paso 4.10 con otros 30-50 ml de agua libre de RNase, o utilizando eluido del paso 4.10 (si se requiere un alto [ARN]). Reutilice el tubo de recogida del paso 4.10.
- Utilice ARN purificado para análisis aguas abajo, incluyendo la secuenciación de ARN o PCR cuantitativo en tiempo real o arn disuelto en H2O libre de RNase a -80 oC durante un máximo de 1 año.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuestros estudios anteriores4,7 sugieren que CD36 puede funcionar como un interruptor para la diferenciación arteriolar y la arterial capilar a través de la vía de señalización LPA/PKD-1. Para estudiar si el eje de señalización LPA/PKD-1-CD36 es esencial para la arteriogénesis in vivo, hemos establecido las nuevas líneas TRAP que no sólo tienen deficiencia global cd36 o deficiencia endotelial-específica-cd36- o pkd-1-deficiencia, sino que también permiten el aislamiento selectivo de ARN ligado a ribosomas de linajes celulares marcados con cre por GFP, y son útiles como un reportero fluorescente activado por cre2.
Al realizar el genotipado, observamos que el gen cd36 se eliminó globalmente o en la endotelia vascular para ratones nulos cd36 específicos endoteliales (datos no mostrados), y el gen pkd-1 también se eliminó en la endotelia vascular. La Figura 1 es un resultado representativo que muestra la línea de ratón trap cd36 global creada o pkd-1 específica endotelial. Utilizando la microscopía de inmunofluorescencia, demostramos que un GFP mejorado está genéticamente etiquetado en los ribosomas de las células endoteliales in vivo (Figura 2). Luego aislamos el ARNm límite de ribosoma directamente in vivo y obtuvimos con éxito ARN de calidad como se muestra mediante la medición de la relación de 260 nm y 230 nm (Figura 3). Un análisis adicional utilizando qPCR en tiempo real demostró que la expresión de ciertos genes arteriogénicos fueron reguladas en la endotiedad pulmonar de ratones nulos cd36 (Figura 4), lo que indica que el ARN aislado directamente in vivo en la endotelia vascular utilizando el TRAP tecnología están calificadas para estudios posteriores. Estos estudios incluyen el análisis de la expresión génica a niveles de ARNm y la identificación de transcriptomas novedosos en condiciones fisiológicas y patológicas, que son esenciales para entender la regulación de la diferenciación de células endoteliales vasculares y la angiogénesis funcional.
Figura 1: Un ejemplo de genotipado para ratones TRAP genéticamente diseñados. Resultados representativos para el genotipado de ratones TRAP nulos globales cd36 o ratones TRAP nulos pkd-1 específicos del tejido condicional. Los ratones transgénicos VEC-cre expresan la recombinación bajo el control de un promotor DeCdh5 B6; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J ratones eran pan con B6.129S4-Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/J, y más adelante con B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J o pkd-1loxP/loxP. Se obtuvieron los ratones dobles mutantes cd36 TRAP (A) y pkd-1 TRAP (B), en los que se etiqueta un GFP mejorado en L10a del ribosoma en células endoteliales vasculares, y el gen cd36 se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y se elimina el gen cd36 a nivel mundial y se elimina el gen cd36 y se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y se elimina el gen cd36 y se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y el gen cd36 se elimina globalmente y se elimina el gen cd36 y se elimina pkd-1 específicamente en la endotelia vascular. Las colas de ratón se recogieron para la extracción de ADN utilizando un kit y sobre la base de la instrucción del fabricante, y el ADN en todas las muestras fue amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego evaluado por 1-2% de electroforesis de agarosa-gel. Las fotografías son la imagen de gel de agarosa que muestra los resultados de la amplificación de cd36 o pkd-1 mutantes con / sin TRAP o ratones de tipo salvaje (WT). Panel de genotipo del ratón A: carril 1, cd36-/-; TRAP+/-; carril 2, TRAP+/+; carril 3, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 4, TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 5, cd36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 6, cd36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; carril 7, TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 8, TRAP+/-; carril 9, escalera de ADN. Panel del genotipo del ratón B: carril 1, pkd-1fl/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; carril 2, pkd-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 3, pkd-1fl/-; TRAP+/+; carril 4, pkd-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 5, pkd-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; carril 6, pkd-1fl/-; carril 7, escalera de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un ejemplo de expresión GFP mejorada específica endotelial bajo microscopio de fluorescencia. La endotelia vascular sanguínea en los tejidos pulmonares de los ratones trap cd36 knockout fue positiva de EGFP (color verde, panel superior) bajo microscopio de inmunofluorescencia. Faltar el anticuerpo GFP primario se utilizó como un control negativo (panel inferior). Los tejidos del ratón se teñiron mediante el uso de anticuerpos GFP y CD31 con anticuerpos secundarios adecuados de fluorescencia (color rojo). Imágenes representativas adquiridas mediante el uso de un sistema de imágenes por microscopía de fluorescencia. Barra de 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La calidad y cantidad de ARNm ligado ribosomal de células endoteliales purificadas y extraídas directamente de los tejidos de ratones TRAP. Un ejemplo de calidad y concentración de ARN purificado de tejidos pulmonares en un ratón TRAP cd36. Se utilizó un espectrofotómetro para evaluar la cantidad y pureza del ARN extraído. Como se muestra en esta figura, la concentración de ARN es de 51,2 ng/L. La relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm es de 1,87 mientras que la relación de 260 nm y 230 nm es de 2,40, lo que indica la pureza de las muestras de ARN extraídas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Un ejemplo de expresión de genes angiogénicos y ligandos de muesca en el ARN ligado al ribosoma de las células endoteliales mediante ensayos qPCR en tiempo real. El ARNm aislado del ribosoma endotelial del pulmón en el control TRAP y los ratones TRAP deficientes de CD36 específicos de CE fue sometido a ensayos qPCR en tiempo real, utilizando imprimaciones compradas a una empresa biotecnológica incluyendo Hey2, ephrin B2, y delta como ligando 4 (DLL4). Los genes de mantenimiento de la casa PPIA se utilizaron para la normalización. La prueba tdel estudiante se utilizó para el análisis estadístico. *P < 0.05; **P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La angiogénesis es un complejo proceso de varios pasos, en el que la transcripción y expresión de genes angiogénicos específicos de la CE desempeñan un papel esencial en la diferenciación EC y la reprogramación angiogénica3,4. Para superar las barreras de la diversidad celular y la complejidad arquitectónica para comprender mejor la función del sistema vascular de mamíferos a nivel molecular in vivo, hemos creado ratones TRAP específicos de la CE, acompañados de cd36 específico de la CE , deficiencia de pkd-1 específica de EC o deficiencia global de cd36 mediante el uso de un modelo de ratón TRAP con floxed versátil o EGFP-TRAP generado en el laboratorio Pu2 en combinación con otras líneas de ratón de ingeniería genética. Esto permitirá el examen de todo el complemento mRNA traducido de los CIE vasculares a partir de tejidos in vivo sin tesis en la expresión pkd-1 o global en la expresión génica cd36 8, que es fundamental para la investigación transcripción genética asociada a la angiogénesis fisiológica y patológica4,7,9,10. Consistente con otros estudios1,2, nuestro enfoque para el aislamiento de ARNm específico de la CE no necesita fijación de tejidos, disociación de tejidos, o aislamiento de células individuales de los tejidos y por lo tanto evita los artefactos potenciales que resultado de estos tratamientos. También pudimos realizar purificaciones TRAP y extraer mRNA de calidad ligada a ribosomas de los tejidos congelados. Además, lo que se purificó es el contenido de ARNm traducido de las CE directamente in vivo, lo que representará mejor el contenido de proteínas en comparación con el uso del ARN total para el perfil de expresión génica. Además, el transgén TRAP etiqueta genéticamente los PEC con EGFP, permitiendo también no sólo la extracción de ARNm ligada a ribosoma, sino también para la visualización en estudios inmunohistoquímicos o electrofisiológicos.
Sin embargo, el enfoque mostró bajos rendimientos de ARN, especialmente con ARNm purificado de tejidos cardíacos o de tejidos previamente congelados. Por lo tanto, necesitamos optimizar las condiciones para aumentar los rendimientos. Sin embargo, observamos en ratones con deficiencia de cd36 específicos de las CE, los nivelesde ephrin B2 y DLL4 aumentaron significativamente tanto en la endosela pulmonar (Figura 4) como en la endotelia del corazón (datos no mostrados) en comparación con el control. Estos resultados fueron consistentes con nuestros estudios in vitro anteriores3,4, lo que sugiere que la calidad del ARN es suficiente para el análisis posterior. El rendimiento fue bajo posiblemente debido a las estrictas condiciones. Para superar esta limitación y mejorar el rendimiento, es fundamental establecer una zona de trabajo libre de RNase y descontaminar superficies de trabajo y equipos que puedan contaminarse con RNase y cambiar los guantes con frecuencia para extraer ARN de calidad. También es fundamental encontrar concentraciones adecuadas de anticuerpos GFP en la matriz de afinidad y utilizar concentraciones adecuadas de inhibidor de RNase en el tampón de lisis tisular del tejido. El uso de material escalofráneo y reactivos de plástico libres de RNase es beneficioso para la extracción de ARN a partir de ribosomas endoteliales de los tejidos objetivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
El trabajo del Dr. Ren es apoyado por la Asociación Americana del Corazón (13SDG14800019; BR), la Ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), la Sociedad Americana contra el Cáncer (86-004-26; el McW Cancer Center to BR), y el Instituto Nacional de Salud (HL136423; BR); Jordan Palmer cuenta con el apoyo del Programa de Pasantías MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran cuenta con el apoyo de una Beca de Formación en Investigación Institucional de NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
