Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Published: May 25, 2019 doi: 10.3791/59624
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,3, 1, 2, 3, 3,4,5
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi presenterar en metod för att rena ribosombunden mRNA från vaskulära endotelceller (ECs) direkt i mushjärna, lung-och hjärtvävnad via EC-specifika genetiska tag av Enhanced Green fluorescens protein (egfp) i ribosomer i kombination med RNA rening .

Abstract

Många studier har begränsats till att använda in vitro cellulära analyser och hela vävnader eller isolering av specifika celltyper från djur för in vitro-analys av transkriptome och genuttryck genom qPCR och RNA-sekvensering. Omfattande transkriptome och gen uttrycks analys av specifika celltyper i komplexa vävnader och organ kommer att vara avgörande för att förstå cellulära och molekylära mekanismer genom vilka gener regleras och deras samband med vävnad homeostas och orgel Funktioner. I denna artikel, vi visar metoden för isolering av ribosom-bundet RNA direkt in vivo i den vaskulära koppla av djur lungor som ett exempel. De specifika material och procedurer för vävnads bearbetning och RNA rening kommer att beskrivas, inklusive bedömning av RNA kvalitet och avkastning samt realtid qPCR för arteriogena Gene analyser. Denna metod, känd som översätter Ribosomen affinitetsrening (TRAP) teknik, kan utnyttjas för karakterisering av genuttryck och transkriptome analys av vissa celltyper direkt in vivo i någon specifik typ i komplexa vävnader.

Introduction

I komplexa vävnader som däggdjurs hjärnan, hjärtat och lungorna komplierar de höga nivåerna av cellulär heterogenitet analysen av gen uttrycks data som härrör från hela vävnadsprover. För att observera genuttrycksprofiler i en viss celltyp in vivo har en ny metodik utvecklats nyligen, vilket gör det möjligt att förhörs hela det översatta mRNA-komplementet av någon genetiskt definierad celltyp. Denna metod kallas för att översätta ribosom teknik för affinitetsrening (trap)1,2. Det är ett användbart verktyg för att studera endotelcellbiologi och angiogenes i kombination med genetiskt manipulerande andra angiogenicitetsassocierade gener hos djur.

Vi har visat att angiogen PKD-1 signalering och transkription av angiogen gen CD36 är avgörande för endotelcell (EC) differentiering och funktionell angiogenes3,4,5,6. För att bestämma molekylära mekanismer för angiogen och metabolisk signalering i gentranskription och EG-transdifferentiering har vi skapat genetiskt modifierade TRAP-möss med specifikt borttagna angiogena gener på grundval av TRAP-teknik1 , 2. Dessutom, i våra fälla djur, inte bara de har PKD-1 eller CD36 gen brist i vaskulär endotelia eller global radering av CD36 gen, men en förbättrad grön fluorescens protein (egfp) är också genetiskt märkta på EG: s översätta ribosomer. Trap tillåter affinitet rening av ribosom-bunden mRNA direkt från den vaskulära koppla av riktade vävnader, möjliggör analys av genuttryck och identifiering av nya transkriptom som är förknippade med EG differentiering och angiogenes direkt under in vivo-förhållanden. Vi har framgångsrikt isolerat ribosome-bundet RNA från koppla i dessa genetiskt modifierade djur. Det renade RNA kan användas för ytterligare karakterisering av angiogena eller arteriogena gener i regleringen av EG differentiering och funktioner. Detta protokoll ger en stegvis vägledning för att implementera TRAP-metoden för isolering av mRNA i ECs direkt in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

För djurförsök, alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Medical College of Wisconsin.

1. Förbered reagenser

  1. Bered lyseringsbufferten till koncentrationer av 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cykloheximid, proteashämmare och rekombinanta rnashämmare till koncentrationer enligt beskrivningen nedan.
    1. Tillsätt följande reagenser till 500 mL RNase-fritt avjoniserat vatten: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg dtt, 0,5 ml cykloheximid och NaOH vid behov tills pH 7,4, EDTA-fria proteashämmare (en mini tablett per 10 ml) och RNase hämmare (1 0 μL/mL).
    2. Förvaras i ett kylskåp på 4 ° c i upp till 1 månad.
  2. Förbered en högsalt polysome tvättbuffert till koncentrationer av 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% Vol/Vol CA-630, 0,5 mm DTT, och 100 mg/ml cycloheximide.
    1. Tillsätt följande reagenser till 500 mL RNase-fritt avjoniserat vatten: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2,5 ml nondenatserande rengöringsmedel, 5 av 7,7 mg rör av DTT, och 0,5 ml cykloheximid, och NaOH vid behov tills pH 7,4.
    2. Förvaras i 4 ° c kylskåp i upp till 1 månad.
  3. Bind anti-GFP antikropp till protein G magnetiska pärlor före start experiment.
    1. Tillsätt 10 mg anti-GFP-antikropp utspädd i 200 mL PBS till protein G-pärlor.
    2. Inkubera med änd över änden rotation i 10 minuter vid rumstemperatur.
    3. Placera pärlorna på ett magnetiskt rack och ta bort supernatanten.
    4. Suspendera pärlorna i 200 mL PBS och förvara i 4 ° c kylskåp i upp till 1 vecka.
  4. Förbered iskall PBS med 100 mg/mL cykloheximid.
    1. Tillsätt 1 volym cykloheximidlösning (100 mg/mL) till 99 volymer av iskall PBS.

2. isolera och lysera önskade vävnader

  1. Euthanize möss genom IP injektion av ketamin (500 mg/kg/kroppsvikt) och xylazin (10 mg/kg/kroppsvikt) och isolera önskade vävnader (dvs., hjärta, lunga). Fortsätt omedelbart till nästa steg.
  2. Placera önskade vävnader i 500 mL iskall PBS med 100 mg/mL cykloheximid.
  3. Finhacka vävnad i en cellsuspension med en motordriven homogenisator eller en liten clearance glas Homogenisatorer. Om du använder en motordriven Homogenisatorer, begränsa homogenisering till mindre än 1 minut vid låg frekvens (< 15000 Hz) för att undvika RNA-denaturering.
  4. Suspendera cellpelleten i 200 mL lyseringsbuffert genom att Pipettera och rita upp bufferten flera gånger. Ytterligare homogenisera cellsuspensionen med 10 stroke i en liten clearance glas Homogenisatorer eller i 15 sekunder vid låg frekvens (< 15000 Hz) i en motorisk Homogenisatorer.
  5. Centrifugera homogeniserar i 10 min vid 2 000 x g vid 4 ° c till pellets kärnor och stora Cellrester, och behåll supernatanten.
  6. Tillsätt nonionic, icke-denaturerande rengöringsmedel till 1% Vol/Vol och DHPC till 30 mM till supernatanten. Inkubera på isen i 5 min.
  7. Centrifugera lysate för 10 min vid 16 000 x g till pellets olösligt material. Överför och Behåll 15% av Clear lysate som indata för framtida steg.

3. isolera ribosom/mRNA-komplex

  1. Tillsätt 50 mL av antikroppar bundna pärlor till cell-lysate supernatanten och inkubera blandningen vid 4 ° c med slut-över-end rotation för 30 min. Det är här anti-GFP-antikropparna binder de GFP-märkta ribosomerna, vilket gör att vi kan isolera RNA från dessa ribosomer ytterligare.
  2. Samla pärlor på ett magnetiskt rack och tvätta 5 gånger med hög salt polysome tvättbuffert.
    1. Dra upp och kassera vätska när pärlorna har samlats på sidan av röret. Pipettera och rita om 200 mL högsalt polysome tvättbuffert flera gånger. Upprepa detta steg 5 gånger och kassera all buffert efter den slutgiltiga upprepningen. Fortsätt omedelbart till nästa steg.

4. isolera mRNA

  1. Placera pärlor i RLT buffert. Följande steg tas direkt från RNeasy mini kit-protokollet och utvidgades inte på något sätt.
    Varning: RLT-buffert innehåller guanidinsalter; Blanda inte med blekmedel.
  2. Centrifugera lysate i 3 min vid full fart 13 000 rpm eller 16 000 g vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten på 350 ml genom att Pipettera och överföra den till ett nytt mikrofugrör-rör. Använd endast denna supernatanten (lysate) i efterföljande steg.
  3. Tillsätt en lika volym på 70% etanol i mikrofugrör röret.
  4. Överför upp till 700 mL av provet, inklusive eventuell fällning som kan ha bildats, till en snurrande kolonn placerad i ett uppsamlings rör med 2 mL. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 15 s vid ≥ 8 000 x g för att tvätta rotations spalt membranet. Kassera genomflödet.
  5. Tillsätt 350 mL buffert RW1 till rotations kolumnen. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 15 s vid ≥ 8 000 x g för att tvätta rotations spalt membranet. Kassera genomflödet och återanvänd samlingsröret i nästa steg.
    Varning: buffert RW1 innehåller guanidin salter; Blanda inte med blekmedel.
  6. Tillsätt 350 mL buffert RW1 till rotations kolumnen. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 15 s vid ≥ 8 000 x g. Kassera genomflödet.
  7. Tillsätt 500 mL buffert RPE till rotations kolumnen. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 15 s vid ≥ 8 000 x g för att tvätta rotations spalt membranet. Kassera genomflödet.
  8. Tillsätt 500 mL buffert RPE till rotations kolumnen. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 2 min vid ≥ 8 000 x g för att tvätta rotations spalt membranet. Ta sedan försiktigt bort spinkolonnen från samlingsröret och se till att kolonnen inte kommer i kontakt med genomflödet.
  9. Placera spinkolonnen i ett nytt 2 mL samlingsrör och kassera det gamla röret med genomflödet. Stäng locket försiktigt och centrifugera med full hastighet i 1 min för att ta bort kvarvarande buffert.
  10. Placera spinkolonnen i ett nytt 1,5 mL samlingsrör. Tillsätt 30-50 mL Rase-fritt vatten direkt till spinkolonnmembranet. Stäng locket försiktigt och Centrifugera i 1 min vid ≥ 8 000 x g för att ELUERA RNA.
  11. Om förväntat RNA-utbyte är > 30 mg, upprepa steg 4,10 med en annan 30-50 ml RNase-fritt vatten, eller med hjälp av eluera från steg 4,10 (om hög [RNA] krävs). Återanvänd samlingsröret från steg 4,10.
  12. Använd renat RNA för nedströms analys inklusive RNA-sekvensering eller realtid kvantitativ PCR eller lagra RNA upplöst i RNase-fri H2O vid-80 ° c i upp till 1 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Våra tidigare studier4,7 tyder på att CD36 kan fungera som en switch för arteriolär differentiering och kapillär arterialization via LPA/PKD-1 signalering väg. För att studera om den LPA/PKD-1-CD36 signalering axeln är avgörande för arteriogenes in vivo, vi har etablerat den nya FÄLLAN linjer som inte bara har global CD36 brist eller endotelial-specifik-CD36-eller PKD-1-brist men också tillåta selektiv isolering av ribosom-bundet RNA från CRE-märkta celllineages av GFP, och är användbara som en CRE-aktiverad fluorescerande reporter2.

Genom att utföra genotypning, observerade vi att CD36 Gene ströks globalt eller i vaskulär koppla för endothelial-specifika CD36 null möss (data som inte visas), och PKD-1 gen togs också bort i den vaskulära koppla. Figur 1 är ett representativt resultat som visar den skapade global CD36 TRAP eller endothelial-specifika PKD-1 TRAP Mouse line. Med hjälp av immunofluorescensmikroskopi visade vi att en förstärkt GFP är genetiskt Taggad på ribosomerna i endotelcellerna in vivo (figur 2). Vi isolerade sedan ribosom bunden mRNA direkt in vivo och framgångsrikt erhållits kvalitet RNA som visas genom mätning av förhållandet 260 Nm och 230 nm (figur 3). Ytterligare analys med realtid qPCR visade att uttrycket av vissa arteriogena gener var uppreglerad i lungan endotelia av CD36 null möss (figur 4), vilket indikerar att det isolerade RNA direkt in vivo i den vaskulära koppla med hjälp av fällan tekniken är kvalificerad för studier i senare led. Dessa studier omfattar analys av genuttryck på mRNA nivåer och identifiering av nya transkriptomer under fysiologiska och patologiska förhållanden, som är nödvändiga för att förstå regleringen av vaskulär endotelcell differentiering och funktionell angiogenes.

Figure 1
Figur 1: ett exempel på genotypning för genetiskt modifierade trap-möss. Representativa resultat för genotypning av global CD36 null TRAP MICE eller villkorsstyrda vävnadsspecifika PKD-1 null trap-möss. VEC-CRE transgena möss Express CRE driver under kontroll av en Cdh5 promotor B6; 129-TG (Cdh5-CRE) 1Spe/J möss var bröd med B 6.129 S4-gt (rosa) 26Sor TM1(CAG-egfp/Rpl10a,-bira) WTP/j, och vidare med b 6.129 S1tm1Mfe-CD36 /j eller PKD-1loxP/loxP. Den dubbla Mutant CD36 trap (a) och PKD-1 trap (B) möss erhölls, där en förbättrad GFP är taggad på L10a av ribosom i vaskulära endotelceller, och CD36 gen raderas globalt och PKD-1- genen specifikt i vaskulära endotelier. Mus svansar samlades för DNA-extraktion med hjälp av ett kit och baserat på instruktion från tillverkaren, och DNA i alla prover förstärkallades av polymeras kedjereaktion (PCR), och sedan utvärderas av 1-2% aguppstod-gel elektrofores. Fotografier är Agros gel bild som visar resultaten av amplifiering av CD36 eller PKD-1 mutanter med/utan fällor eller Wild Type (WT) möss. Mus genotyp panel A: Lane 1, CD36-/-; TRAP+/-; Lane 2, fälla+/+; Lane 3, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 4, fälla+/+; Cdh5+/-; Lane 5, CD36-/-; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 6, CD36-/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; Lane 7, fälla+/+; Cdh5+/-; Lane 8, fälla+/-; Lane 9, DNA-stege. Musen genotyp panel B: Lane 1, PKD-1fl/-; TRAP+/-; Cdh5+/-; Lane 2, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 3, PKD-1fl/-; TRAP +/+; Lane 4, PKD-1fl/fl; TRAP +/+; Cdh5+/-; Lane 5, PKD-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; Lane 6, PKD-1fl/-; Lane 7, DNA-stege. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: ett exempel på endotelspecifikt förbättrat GFP-uttryck under fluorescensmikroskop. Blod vaskulär endotelia i lungorna vävnader av cd36 knockout trap möss var egfp positiva (grön färg, övre panelen) under immunofluorescenscens Mikroskop. Saknas den primära GFP antikroppen användes som en negativ kontroll (bottenpanelen). Mus vävnader var samfärgas genom att använda GFP och CD31 antikroppar med lämpliga sekundära fluorescens antikroppar (röd färg). Representativa bilder förvärvade med hjälp av ett fluorescensmikroskopi avbildningssystem. Bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvalitet och kvantitet av ribosomal-bunden mRNA av endotelceller renas och direkt extraheras från vävnader av fällor möss. Ett exempel för kvalitet och koncentration av renat RNA från lungvävnad i en CD36 knock out trap Mouse. En spektrofotometer användes för att bedöma mängden och renheten hos det extraherade RNA. Som framgår av denna siffra, är koncentrationen av RNA 51,2 ng/μL. Kvoten av absorbans vid 260 Nm och 280 nm är 1,87 medan förhållandet 260 Nm och 230 Nm är 2,40, vilket indikerar renheten hos de extraherade RNA-proverna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: ett exempel på uttryck av angiogena gener och skålligander i det ribosom-bundna RNA av endotelceller av qPCR-analyser i realtid. Den isolerade mRNA från endotelial ribosom i lungorna i FÄLLAN kontroll och EC-specifika CD36 bristfällig fälla möss utsattes för realtid qPCR analyser, med primers köps från ett bioteknikföretag inklusive Hey2, Ephrin B2, och delta som ligand 4 (DLL4). Huset håller gener PPIA användes för normalisering. Studenten t-test användes för statistisk analys. *P < 0,05; * *P < 0,01.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Angiogenes är en komplex i flera steg process, där EG-specifik angiogen gentranskription och uttryck spelar en viktig roll i EG-differentiering och angiogen omprogrammering3,4. För att övervinna hindren från den cellulära mångfalden och arkitektonisk komplexitet för att bättre förstå funktionen av däggdjurs vaskulära systemet på molekylär nivå in vivo, har vi skapat EC-specifika TRAP möss, åtföljd av EG-specifika CD36 , EG-specifik PKD-1- brist eller global CD36 -brist genom att använda en mångsidig floxed trap Mouse modell eller egfp-trap som genereras i PU Laboratory2 i kombination med andra genetiskt modifierade mus linjer. Detta kommer att göra det möjligt att undersöka hela det översatta mRNA-komplementet av vaskulära ECs från intakt vävnad in vivo enligt EG-specifik i PKD-1 eller global brist i CD36 genuttryck8, som är kritisk för utredning av gentranskription associerad med fysiologisk och patologisk angiogenes4,7,9,10. I enlighet med andra studier1,2, vår inställning till isolering av EG-specifika mRNA behöver inte vävnadfixering, dissociation av vävnader, eller isolering av enstaka celler från vävnader och därmed undviker de potentiella artefakter som resultat från dessa behandlingar. Vi kunde också utföra fälla reningar och extrahera kvalitet ribosome-bunden mRNA från frysta vävnader. Dessutom, det som renades är det översatta mRNA-innehållet i ECs direkt in vivo, vilket bättre kommer att representera proteinhalten jämfört med att använda det totala RNA för gen uttrycks profil. Dessutom, FÄLLAN transgenens genetiskt etiketter ECs med EGFP, också tillåter inte bara för utvinning av ribosom-bunden mRNA men också för visualisering i immunohistokemiska eller elektrofysiologiska studier.

Men, tillvägagångssättet visade låga RNA-avkastningen, särskilt med renad mRNA från hjärtat vävnader eller från tidigare frysta vävnader. Vi behöver alltså optimera förutsättningarna för att öka avkastningen. Men vi observerade i EG-specifika CD36 bristfällig möss, nivåerna av Ephrin B2 och DLL4 ökades signifikant i både lung (figur 4) och hjärta (data som inte visades) endotelia jämfört med kontrollen. Dessa resultat överensstämde med våra tidigare in vitro-studier3,4, vilket tyder på att RNA-kvaliteten är tillräcklig för nedströms analys. Avkastningen var låg möjligen på grund av de stränga villkoren. För att övervinna denna begränsning och förbättra avkastningen, är det viktigt att inrätta en RNase-fri arbetszon och sanera arbetsytor och utrustning som kan bli förorenat med RNase och byta handskar ofta för att extrahera kvalitet RNA. Det är också viktigt att hitta lämpliga koncentrationer av GFP-antikroppar i affinitetsmatrisen och använda lämpliga koncentrationer av RNase-hämmare i vävnads lyseringsbufferten. Användning av RNase-fri plast porslin och reagens är fördelaktigt för RNA extraktion från endoteliala ribosomer i riktade vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Dr ren arbete stöds av den amerikanska Heart Association (13SDG14800019; BR), Ann ' s Hope Foundation (FP00011709; BR), American Cancer Society (86-004-26, MCW Cancer Center till BR), och National Institute of Health (HL136423; BR). Jordan palmer stöds av 2018 MCW CTSI 500 Stars praktik program; P. Moran stöds av ett institutionellt forsknings utbildningsstipendium från NHLBI (5T35 HL072483-34).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips Agilent G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers Sarstedt 83.1832
Homogenizers Fisher Scientific K8855100020
Magnet (Dynamag-2) Invitrogen 123-21D Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer Thermo Scientific  ND-2000C
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5430R with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes Applied Biosystems  AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes Applied Biosystems  AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips Rainin RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips Rainin  RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips Rainin  RT-20F
Rotor for homogenizers Yamato  LT-400D
Tube rotator, Labquake brand Thermo Fisher 13-687-12Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

Tags

Biokemi angiogenes arteriolär differentiering vaskulära endotelceller översätta Ribosomen affinitetsrening RNA-extraktion realtid qPCR
Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R.,… More

Moran, P., Guo, Y., Yuan, R., Barnekow, N., Palmer, J., Beck, A., Ren, B. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (147), e59624, doi:10.3791/59624 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter