Human blastocyst biopsi og Forvitrifikation
Summary
Blastocyst biopsi og forvitrifikation er forpligtet til effektivt at udføre præimplantations genetiske test. En fremgangsmåde, der medfører sekventiel åbning af zona pellucida og genfinding af 7-8 trophectoderm-celler i dag 5-7 efter inseminering, begrænser både antallet af nødvendige manipulationer og embryoernes eksponering for suboptimale miljøforhold.
Abstract
Blastocyst biopsi udføres for at opnå en pålidelig genetisk diagnose under IVF-cyklusser med præimplantations genetisk testning. Derefter, den ideelle arbejdsgang indebærer en sikker og effektiv forglasning protokol, på grund af ekspeditionstid af diagnostiske teknikker og til at overføre de udvalgte embryoer (r) på en fysiologisk endometriet i en efterfølgende naturlige cyklus. En biopsi tilgang, der omfatter den sekventielle åbning af zona pellucida og hentning af 5-10 trophectoderm celler (ideelt 7-8) begrænser både antallet af manipulationer kræves og eksponeringen af embryonet til sub-optimale miljøforhold. Efter korrekt træning, var teknikken reproducerbar på tværs af forskellige operatører med hensyn til timing af biopsi (~ 8 min, spænder 3-22 min baseret på antallet af embryoner til biopsi per skål), afgørende diagnoser opnået (~ 97,5%) og levende fødselsrater efter vitrificeret-varmet euploid blastocyst Transfer (> 40%). Overlevelsesraten efter biopsi, forvitrifikation og opvarmning var så høj som 99,8%. Re-ekspansion sats på 1,5 h fra opvarmning var så højt som 97%, i vid udstrækning afhængig af timing mellem biopsi og forvitrifikation (ideelt ≤ 30 min), blastocyst morfologiske kvalitet og dag af biopsi. Generelt er det bedre at vitrificere en kollapset blastocyst; i ikke-PGT-cyklusser kan der derfor udføres laser assisteret kunstig krympning for at inducere embryo kollaps før kryopreserveringen. Det mest lovende fremtidsperspektiv er den ikke-invasive analyse af IVF-kultur medierne efter blastocyst-kulturen som en formodet kilde til embryonale DNA. Denne potentielle avantgarde er imidlertid stadig under efterforskning, og der skal dog fastlægges og valideres en pålidelig protokol.
Introduction
Hovedformålet med moderne menneskelig embryologi er at maksimere antallet levende fødsler pr stimuleret cyklus og reducere omkostninger, tid og indsats for at opnå en graviditet. For at nå dette mål bør der anvendes validerede tilgange til embryo udvælgelse for at identificere reproduktivt kompetente embryoner i en kohorte, som er opnået under en IVF-cyklus. Ifølge de seneste beviser er blastocyst Culture1 kombineret med omfattende kromosomal testning og vitrificeret-opvarmet euploid Embryo Transfer (et) den mest effektive ramme til at øge IVF Efficiency2. Det er klart, at aneuploidi-testning kræver en embryonal prøve, som for øjeblikket for det meste er repræsenteret fra få celler, der er hentet fra trophectoderm (te), dvs den del af blastocyst, som giver oprindelse til embryonale bilag (f. eks. placenta) under graviditet . Ud over karyotype analyse kan også enkelt genmutationer vurderes ud fra en TE biopsi som en del af en klinisk strategi kendt som præimplantation genetisk testning (PGT;-A for aneuploidies,-SR for strukturelle kromosomale rearrangementer,-M for monogene sygdomme). Andre oocyte/embryo biopsi metoder er blevet teoretiseret og vedtaget klinisk i de sidste årtier, nemlig Polar kroppe biopsi og blastomerkerneoverførsel biopsi. Men deres anvendelse reduceres i dag, da deres proceduremæssige ulemper (f. eks. højere arbejdsbyrde og risiko for reproduktiv påvirkning) og diagnostiske begrænsninger (f. eks. problemer med enkelt celle analyse) implicit hindrer en tilstrækkelig balance mellem omkostninger, risici og fordele (for en gennemgang Se3).
I dette dokument er en af de vigtigste protokoller for TE biopsi grundigt beskrevet sammen med de efterfølgende forvitrifikation, opvarmning og overførsel procedurer, der kræves. Den beskrevne arbejdsgang er ideel til en travl PGT-enhed.
Som allerede beskrevet af vores gruppe4,5, omfatter proceduren den sekventielle åbning af zona pellucida af fuldt ekspanderede blastocyster og fjernelse af få te celler (i gennemsnit 7-8). Sammenlignet med den dag 3 laser-assisteret rugeæg-baseret blastocyst biopsi metode6, denne procedure kan lette den daglige tidsplan for en IVF-enhed, hvor sarte procedurer, såsom blastocyst biopsi og forvitning, skal være rettidig udføres. Så snart blastocyst når sin fulde ekspansion, biopsi kan udføres ved at vælge TE celler til at fjerne, og dermed forhindre risikoen for herniation af den indre cellemasse (ICM), som ellers ville gøre proceduren udfordrende. I litteraturen er der også beskrevet en tredje protokol af blastocyst biopsi, som involverer laser assisteret ruge, der udføres, når embryonet allerede har nået blastocyst-stadiet, få timer før proceduren5,7. Denne fremgangsmåde er imidlertid mere tidskrævende og passer hovedsagelig til IVF-enheder, der implementerer TE biopsi i hænderne på ubegrænsede erfarne operatører og i lyset af en moderat lav daglig arbejdsbyrde.
Intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI)8 bør være en konsolideret teknik, hvis der sigtes mod at udføre genetiske analyser i IVF. Tilsvarende er en ordentlig kultur system til sikkert at høste embryoner til blastocyst fase afgørende for gennemførelsen af TE biopsi strategi. Et tilstrækkeligt antal inkubatorer, samt brugen af lav ilt spændinger er vigtige forudsætninger for dette formål, ikke at kompromittere blastocyst sats9. Samtidig er det nødvendigt med et effektivt cryopreservations program for at kunne administrere en PGT-cyklus på en sikker måde. I det sidste årti har gennemførelsen af forvitrifikation boostet embryon kryo-overlevelsesrater selv op til > 99%10,11. Dette gav tilstrækkelig tid til at udføre genetisk testning og udsætte embryo overførsel til følgende menstruationscyklus, på en ikke-stimuleret og sandsynligvis mere modtagelig endometriet12.
Både TE biopsi og vitrificering er krævende opgaver, der kræver strenge færdigheder, og deres effektivitet kan variere på tværs af uerfarne operatører. Der anbefales derfor en særlig uddannelsesperiode, inden hver operatør får mulighed for at udføre disse procedurer klinisk. Desuden bør vedligeholdelsen af operatørernes færdigheder vurderes periodisk ved at overvåge nøgleresultatindikatorer (KPI) for kryopreserverings-og biopsi-procedurer. Hver IVF klinik bør fastsætte interne KPI’er med henblik herpå, som skal tilnærme dem, der offentliggøres af internationale konsortier og/eller resultaterne offentliggjort af referencelaboratorier.
TE biopsi, forvitrifikation-opvarmning og vidne procedurer er validerede teknikker på vores enhed, der er blevet standardiseret på tværs af alle de involverede aktører som rapporteret i tre tidligere publikationer11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Kun velerfarne, dygtige embryologer, der har afsluttet deres træningsperiode, skal udføre både TE biopsi og blastocyst vitrification. Endvidere er et vidne forpligtet til at overvåge procedurerne og sikre en effektiv sporbarhed under i) flytninger af biopsieret blastocyst fra biopsi skålen (supplerende figur 1) til post-biopsi skålen (supplerende figur 1 ), derefter til forvitrifikationpladen (supplerende figur 1) og til sidst til Forvitrifikation (supplere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG og RM indsamlede data og udarbejdede manuskriptet. DC analyserede dataene, udarbejdede de repræsentative resultater, udførte statistikken og reviderede manuskriptet. FMU og LR gav en kritisk drøftelse af resultaterne og af hele manuskriptet.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
