Summary

Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Published: July 26, 2019
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Summary

A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.

Abstract

A biópsia do Blastocyst é executada para obter um diagnóstico genético de confiança durante ciclos de IVF com teste genético do pré-implante. Em seguida, o fluxo de trabalho ideal implica um protocolo de vitrificação seguro e eficiente, devido ao tempo de resposta das técnicas diagnósticas e à transferência do (s) embrião (es) selecionado em um endométrio fisiológico em um ciclo natural seguinte. Uma aproximação da biópsia que abrange a abertura seqüencial do pelúcida da zona e a recuperação de 5-10 pilhas do trofectoderma (idealmente 7-8) limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal. Após o treinamento adequado, a técnica foi reprodutível em diferentes operadores em termos de tempo de biópsia (~ 8 min, variando de 3-22 min com base no número de embriões para biópsia por prato), diagnósticos conclusivos obtidos (~ 97,5%) e taxas de natalidade ao vivo após a transferência de blastocisto de euplóide vitrificado-aquecido (> 40%). A taxa de sobrevida após biópsia, vitrificação e aquecimento foi tão alta quanto 99,8%. A taxa da re-expansão em 1,5 h do aquecimento era tão elevada quanto 97%, pela maior parte dependente do sincronismo entre a biópsia e a vitrificação (idealmente ≤ 30 minutos), a qualidade morfológica do blastocisto e o dia da biópsia. Em geral, é melhor vitrificar um blastocist colapsado; Conseqüentemente, em ciclos da não-PGT, o encolhimento artificial laser-ajudado pôde ser executado para induzir o colapso do embrião antes da criopreservação. A perspectiva futura a mais prometedora é a análise não invasora dos meios de cultura do IVF após a cultura do blastocisto como uma fonte putativo do ADN embrionário. No entanto, este potencial avant-garde ainda está investigação e um protocolo confiável ainda precisa ser definido e validado.

Introduction

O principal objetivo da embriologia humana moderna é maximizar o número de nascidos vivos por ciclo estimulado e reduzir custos, tempo e esforços para conseguir uma gravidez. Para atingir esse objetivo, devem ser empregadas abordagens validadas para a seleção de embriões para identificar embrião reproductivamente competentes dentro de uma coorte obtida durante um ciclo de FIV. De acordo com as evidências as mais atrasadas, a cultura1 do blastocisto combinada com o teste cromossomático detalhado e transferência Vitrified-aquecida do embrião do ADN (et) é a estrutura a mais eficiente para aumentar a eficiência2de IVF. Claramente, o teste de aneuploidia requer um espécime embrionário, que presentemente é representado na maior parte de poucas pilhas recuperadas do trofectoderma (te), isto é, a seção do blastocisto que dá a origem aos anexos do embrião (por exemplo, a placenta) durante a gravidez . Além da análise do karyotype, também as únicas mutações genéticas puderam ser avaliadas de uma biópsia do te como parte de uma estratégia clínica conhecida como o teste genético do preimplante (PGT;-a para aneuploidies,-Sr para rearranjos cromossomáticos estruturais,-M para doenças monogênica). Outros métodos da biópsia do oocyte/embrião foram teorized e adotados clìnica através das últimas décadas, a saber biópsia dos corpos polares e biópsia do blastômero. No entanto, a sua utilização é reduzida nos dias de hoje, uma vez que as suas desvantagens processuais (por exemplo, maior carga de trabalho e risco de impacto reprodutivo) e limitações diagnósticas (por exemplo, problemas de análise de células únicas) impedem implicitamente um equilíbrio suficiente entre custos, riscos e benefícios (para uma revisão ver3).

Neste trabalho, um dos principais protocolos para a biópsia TE é completamente descrito juntamente com os procedimentos subsequentes de vitrificação, aquecimento e transferência necessários. O fluxo de trabalho aqui descrito é ideal para uma unidade PGT ocupada.

Como já descrito anteriormente pelo nosso grupo4,5, o procedimento envolve a abertura sequencial da zona pelúcida de blastocistos totalmente expandidos e remoção de poucas células te (em média 7-8). Comparado ao dia 3 laser-ajudado a incubação-baseou o método6da biópsia do blastocisto, este procedimento pôde facilitar a programação diária de uma unidade de IVF onde os procedimentos delicados, tais como a biópsia e a vitrificação do blastocisto, devam ser executados oportuna. Assim que o blastocisto alcança sua expansão cheia, a biópsia pode ser realizada selecionando as pilhas do te a remover, assim impedindo o risco do herniation da massa interna da pilha (ICM), que de outra maneira tornaria o procedimento desafiante. Na literatura, um terceiro Protocolo da biópsia do blastocisto foi descrito igualmente, que envolva o incubação laser-ajudado que está sendo executado uma vez que o embrião já alcangou o estágio do blastocisto, poucas horas antes do procedimento5,7. Entretanto, esta aproximação é mais demorada e sere principalmente as unidades de IVF que estão implementando a biópsia do te nas mãos de operadores limitadamente experimentados e em vista de uma carga de trabalho diária moderada-baixa.

A injeção intracytoplasmatic do esperma (ICSI)8 deve ser uma técnica consolidada se visando conduzir análises genéticas em IVF. Da mesma forma, um sistema de cultura adequado para a colheita segura de embriões para o estágio de blastocist é crucial para a implementação da estratégia de biópsia de TE. Um número adequado de incubadoras, bem como o uso de baixa tensão de oxigênio são pré-requisitos chave para este fim, para não comprometer a taxa de blastocist9. Ao mesmo tempo, um programa de criopreservação eficiente é necessário para gerenciar com segurança um ciclo de PGT. Na última década, a implantação da vitrificação impulsionou as taxas de criosobrevivência embrionária até > 99%10,11. Isso proporcionou tempo suficiente para realizar testes genéticos e adiar a transferência de embriões para o seguinte ciclo menstrual, em um endométrio não estimulado e provavelmente mais receptivo12.

Tanto a biópsia de TE quanto a vitrificação são tarefas exigentes que exigem habilidades rigorosas e sua eficácia pode variar em operadores não experientes. Um período de formação específico é, portanto, defendido antes de permitir que cada operador realize estes procedimentos clinicamente; Além disso, a manutenção das competências dos operadores deve ser avaliada periodicamente através da monitorização dos indicadores-chave de desempenho (KPI) para os procedimentos de criopreservação e biópsia. Cada clínica de fertilização in vitro deve definir KPIs internos para esse fim, que devem aproximar os publicados por consórcios internacionais e/ou os resultados publicados por laboratórios de referência.

Os procedimentos de biópsia, vitrificação-aquecimento e testemunhando são técnicas validadas em nossa unidade, que foram padronizadas em todos os operadores envolvidos, conforme relatado em três publicações anteriores11,13,14 .

Protocol

O protocolo para a biópsia humana do blastocisto, descrito aqui, segue as directrizes do Comitê de Ethic da pesquisa humana de G. en. a.r.a.. Nota: Consulte a tabela de materiais para materiais necessários. Material adicional necessário implica calçado de laboratório e equipamento, facemask cirúrgico, tampa do cabelo, luvas cirúrgicas, um marcador permanente não-tóxico, fórceps e desinfetante. O uso do vestido cirúrgico, luvas cirúrgicas descartá…

Representative Results

A Figura 6 representa um esquema de todos os desfechos de um procedimento de biópsia que pode ser adotado para padronizar o protocolo e monitorar o desempenho de cada operador. O resultado processual principal é o sincronismo para terminar a biópsia/biópsias; o principal resultado técnico é a qualidade do enredo produzido após o teste genético que pode resultar em um diagnóstico conclusivo ou inconclusivo, o último dos quais requer uma re-biópsia d…

Discussion

Somente os embriologistas hábeis bem experientes que concluíram seu período de treinamento devem executar a biópsia do te e a vitrificação do blastocisto. Além disso, uma testemunha é exigida para monitorar os procedimentos e para garantir uma rastreabilidade eficiente durante i) os movimentos do blastocisto biópsia do prato da biópsia (Figura complementar 1) ao prato da borne-biópsia (Figura 1 suplementar ), depois à placa de vitrificação (Figura 1 suplementar</str…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A AG e a RM coletaram os dados e elaboraram o manuscrito. A DC analisou os dados, elaborou os resultados representativos, realizou as estatísticas e revisou o manuscrito. A FMU e a LR forneceram discussão crítica dos resultados e de todo o manuscrito.

Materials

Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30µm ID, flat 35°C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60x15mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200µl
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

References

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Cite This Article
Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

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