Summary

ヒト胚盤胞生検とガラス化

Published: July 26, 2019
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Summary

胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。

Abstract

胚盤胞生検は、移植前遺伝子検査を伴うIVFサイクル中に信頼性の高い遺伝子診断を得るために行われる。次に、理想的なワークフローは、診断技術のターンアラウンドタイムに起因する安全で効率的なガラス化プロトコルを伴い、選択した胚を以下の自然サイクルで生理学的子宮内膜上に移す。ゾーナ・ペルシダの順次開きと5-10型血球細胞の検索(理想的には7-8)を包含する生検アプローチは、必要な操作の数と胚の暴露の両方を最適でない環境条件に制限する。適切なトレーニングの後、この技術は、生検のタイミング(約8分、1皿当たりの生検に基づく胚数に基づく3〜22分の範囲)、決定的な診断(約97.5%)の点で、異なるオペレータ間で再現可能であった。ガラス化された温められたユープロイド胚盤胞転移後の出生率(>40%)。生検、ガラス化および温暖化後の生存率は99.8%と高かった。温暖化から1.5時間での再膨張率は97%と高く、生検とガラス化(理想的には≤30分)、胚盤胞形態の質および生検の日の間のタイミングに大きく依存した。一般に、崩壊した胚盤胞を活性化する方が良い。したがって、非PGTサイクルでは、レーザー支援人工収縮が凍結保存前に胚の崩壊を誘発するために行われる可能性がある。最も有望な将来の視点は、胚性DNAの移植源としての胚盤胞培養後のIVF培養培地の非侵襲的分析である。しかし、この潜在的な前衛的な可能性はまだ調査中であり、信頼性の高いプロトコルを定義し、検証する必要があります。

Introduction

現代の人間発生学の主な目標は、刺激されたサイクルあたりの出生数を最大化し、妊娠を達成するためのコスト、時間、努力を削減することです。この目標を達成するためには、IVFサイクル中に得られたコホート内の生殖能力のある胚を同定するために、胚選択のための検証されたアプローチを採用すべきである。最新の証拠によると、胚盤胞培養1は、包括的な染色体試験およびガラス化温温化胚移植(ET)と組み合わされ、IVF効率を高めるための最も効率的なフレームワーク2である。明らかに、無気力検査は胚標本を必要とし、現在のところ、現在は、妊娠中に胚附属書(例えば、胎盤)に起源を与える胚盤胞のセクションから取り出される少数の細胞から主に表される。.核型解析を超えて、単一遺伝子変異も、移植前遺伝子検査(PGT;-A、構造染色体再配列のための-SR、単原性疾患の-M)として知られている臨床戦略の一部としてTE生検から評価される可能性があります。他の卵母細胞/胚生検法は、過去数十年にわたって理論的に採用され、すなわち極性体生検および胚盤胞生検を採用している。しかし、その手続き上の欠点(例えば、より高いワークロードと生殖への影響のリスク)と診断の制限(例えば、単一細胞分析の問題)が暗黙的にコスト、リスクとリスクの間の十分なバランスを妨げるので、その使用は、今日では減少しています。利点 (レビューについては、3を参照してください)。

本論文では、TE生検の主なプロトコルの1つを、その後のガラス化、温暖化および転送手順と共に徹底的に説明する。ここで概説されているワークフローは、ビジーな PGT ユニットに最適です。

我々のグループ4、5によって既に述べたように、手順は完全に膨張した胚盤胞のゾナ・ペルシダの逐次開きおよび少数のTE細胞の除去を含む(平均7-8)。3日目のレーザーアシストハッチングベースの胚盤胞生検法6と比較して、この手順は、胚盤胞生検やガラス化などの繊細な手順をタイムリーに行わなければならないIVFユニットの毎日のスケジュールを容易にする可能性があります。胚盤胞が完全な拡張に達するとすぐに、生検は除去するTE細胞を選択することによって行うことができ、それによって内細胞塊(ICM)のヘルニアのリスクを防ぎ、それ以外の場合は手順を困難にするであろう。文献では、胚盤胞生検の第3のプロトコルも記載されており、これは、胚が既に胚盤胞期に達した後に行われるレーザー支援孵化を伴い、手順5、7の数時間前に行われる。しかし、このアプローチはより時間がかかり、主に経験豊富なオペレータの手にTE生検を実装しているIVFユニットに適しており、適度に低い毎日のワークロードを考慮しています。

細胞内血漿中精子注射(ICSI)8は、IVFで遺伝子解析を行うことを目指す場合の統合技術であるべきである。同様に、胚盤胞段階に胚を安全に収穫するための適切な培養システムは、TE生検戦略の実施にとって極めて重要である。十分な数のインキュベーター、ならびに低酸素張力の使用は、この目的のために重要な前提条件であり、胚盤胞率9を損なわない。同時に、PGTサイクルを安全に管理するためには、効率的な凍結保存プログラムが必要です。過去10年間で、ガラス化の実施は、胚の凍結生存率を最大>99%10、11まで高めました。これは、遺伝子検査を行い、次の月経周期への胚移植を延期するのに十分な時間を提供し、非刺激的でおそらくより受容性の子宮内膜12に。

TE生検とガラス化の両方が厳しいスキルを必要とするタスクを要求しており、その有効性は経験の浅いオペレータによって異なる可能性があります。したがって、特定のトレーニング期間は、各オペレータが臨床的にこれらの手順を実行できるようにする前に提唱されます。さらに、凍結保存および生検手順の主要業績評価指標(KPI)を監視することにより、オペレータのスキルの維持を定期的に評価する必要があります。各IVFクリニックは、この目的に内部KPIを設定する必要があり、これは国際コンソーシアムによって公開されたものや参照ラボによって発表された結果を概算する必要があります。

TE生検、ガラス化温暖化および目撃手順は、3つの以前の出版物11、13、14で報告されているように関与するすべてのオペレータ間で標準化された私達の単位で検証された技術である。.

Protocol

ここで説明するヒト胚盤胞生検のプロトコルは、G.EN.E.R.A. 人間研究倫理委員会のガイドラインに従う。 注:必要な材料については、材料の表を参照してください。さらに必要な材料は、実験室の履物および衣装、外科フェイスマスク、ヘアカバー、外科手袋、永久的な非毒性マーカー、鉗子および消毒剤を伴う。外科ガウン、使い捨て外科手袋、…

Representative Results

図6は、プロトコルを標準化し、各オペレータのパフォーマンスを監視するために採用することができる生検手順のすべての結果のスキームを表す。主な手続き上の結果は、生検/生検を完了するタイミングです。主な技術的結果は、決定的または決定的な診断をもたらす可能性のある遺伝子検査後に生成されたプロットの品質であり、後者は未?…

Discussion

訓練期間を修了した経験豊富な熟練した胚学者のみが、TE生検と胚盤胞ガラス化の両方を行う必要があります。さらに、生検皿(補助図1)から生検後皿への生検胚盤胞の動き(補足図1)の手順を監視し、効率的なトレーサビリティを保証するために証人が必要です(補足図1))、次にガラス化プレート(補足図1)に、最後にガラス化支持体(補足図1)へ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AGとRMはデータを収集し、原稿を作成しました。DCはデータを分析し、代表的な結果を起草し、統計を行い、原稿を改訂した。FMUとLRは、結果と原稿全体の批判的な議論を提供しました。

Materials

Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30µm ID, flat 35°C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60x15mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200µl
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

References

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

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Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

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