由康卡纳林注射到乳原区引起的水性干眼病的兔子模型:药物功效研究的应用

Summary

本文介绍了一种方法，通过注射结沙蛋白A到轨道乳腺系统的所有部分来诱发兔子急性或慢性干眼病。该方法优于已经报告的方法，产生了一种可重复的、稳定的干眼模型，适合药理剂的研究。

Abstract

干眼病（DED）是一种眼表面多因素炎症性疾病，影响全球每6个人中就有1人，对生活质量和医疗费用具有惊人的影响。缺乏信息丰富的动物模型来概括其关键特征，阻碍了为DED寻找新的治疗剂。可用的DED动物模型具有有限的可重复性和有效性。这里给出了一个模型，通过将线粒体康卡林A（Con A）注射到兔子的轨道乳胶腺中诱导DED。该模型的创新方面是使用超声波（美国）指导，以确保Con A最佳和可重复地注射到劣质乳胶体;将Con A注入所有轨道乳胶腺中，限制眼泪的补偿性生产;以及使用定期重复注射 Con A，可随时延长 DED 状态。DED 及其对测试剂的反应通过一组参数进行监测，这些参数用于评估撕裂生产、泪膜的稳定性以及角膜和结膜粘膜的状态。它们包括泪渗透、撕裂时间、席尔默的撕裂测试、玫瑰刺渍和泪乳铁蛋白水平。详细介绍了DED的归纳及其参数的监测。此模型简单、可靠、可重现且信息丰富。该动物模型适用于DED撕裂生理学和病理生理学的研究，以及DED治疗候选制剂的疗效和安全性的评估。

Introduction

干眼病（DED）是一种慢性疾病，发病率高，发病率^{为1、2、3、4。}炎症在其发病机制^5，6中起着关键作用。DED的病理生理学被概念化为源于产量不足或眼泪蒸发过度;前者也被称为水缺乏^DED7。Sjögren 综合征是 DED 的一个广泛研究的原型原因，主要影响乳胶腺 （LG），是其在 DED 发病机制中的重要性的一个突出例子。DED通常用人工眼泪治疗，提供暂时的缓解，或用环孢菌素或利菲格拉斯特，两者都抑制眼炎。DED的可用治疗方法都不是最佳的，因此需要开发新的制剂^8，9。

DED寻找新的治疗剂受到三大挑战的阻碍:缺乏公认的药物可分量分子靶点，鉴于DED的病理生理学复杂性，这可能难以实现;有前途的制剂的稀疏性;以及缺乏重新概括DED主要特征的动物模型。

与大多数药物开发工作一样，DED 的翔实动物模型是一个至关重要的调查工具，尽管公理声明认为没有动物模型能够完全概括人类疾病。DED的小鼠、大鼠和兔子模型是最常用的，而狗和灵长类动物则很少使用^10，11。迄今报告的12个以上兔子DED模型大多试图通过去除LG或阻碍其功能12，13，14，15，16来减少撕裂生产。这些方法包括ILG的外科切除;关闭排泄管;通过辐照或注射下列之一损害LG功能:活性淋巴细胞、线粒体、肉毒杆菌毒素、阿托品或苯甲酸酯。这些方法的主要局限性是它们不一致和频繁部分抑制撕裂生产。

Concanavalin A（Con A），一种植物来源的诱导素，是一种有效的刺激剂T细胞子集，已用于¹⁷型肝炎和^DED18的实验模型。据报道，基于 Con A 的原始模型具有显著优势，包括相对简单;炎症细胞涌入LG，模仿疾病，如Sjogren的;刺激前激细胞因子IL-1+、IL-8和TGF-β1;通过测量撕裂荧光清障和撕裂时间（TBUT）监测的减泪功能;抗炎皮质类固醇的药物反应。

在应用这一有希望的方法时，除了其优点外，还查明了需要对其进行总体修订和重大改进的局限性。该方法的三个关键缺点已记录在案。首先，该模型是一个尖锐的模型;诱导的DED在大约1周后消退。其次，动物的反应不一致。如所示，在"盲"转皮注射到下级LG（ILG），Con A只随机输送到目标腺体。对ILG解剖结构的详细研究表明，其大小可能变化多达4倍^19，使这种注射"命中或错过"的努力。最后，即使注射ILG，卓越的LG（SLG）也经常补偿减少的撕裂流，使模型成为问题。

通过对该方法进行三次修改，克服了这些关键限制，产生了优越的DED动物模型。首先，在超声波（美国）指导下将Con A注射到ILG中，确保Con A进入腺体。注射的成功通过获得注射后美国图像得到确认，如图1所示。其次，为了去除SLG的补偿性撕裂贡献，该腺体的胸腺和轨道部分都注射了Con A。最后，这种急性DED模型每7-10天反复注射Con A，转化为慢性。这些兔子很容易达到2个月的DED。这种方法的成功已充分记载^19。

如前所述，DED动物模型的一个重要应用是确定候选治疗剂的疗效和安全性。对磷酸素林酸（OXT-328）的研究证明了该模型的效用，这是一种新型抗炎小分子^20，21作为眼药水施用。其有效性基于^DED19的参数组进行演示。该模型的相对简单性和信息性还允许将磷酸素与FDA批准的DED、环孢菌素和利菲格拉斯的两种药物进行并排比较，显示出其强大的临床前优越性。

Protocol

所有动物研究均获得石溪大学机构审查委员会的批准，并根据《关于在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明》进行。

1. 动物和住房

1. 收购新西兰白（NZW）兔子重2-3公斤。
2. 将兔子单独关在笼子里，温度严格（65 ~ 5 °F）和湿度（45 ± 5%）控制。照明应具有 12 小时的开/关周期。
3. 提供无限制的水和标准兔舍。消除饮食丰富，因为它们可能含有影响眼睛的维生素A。
4. 在基线测量或干眼感应之前，使动物适应至少 2 周。

2. 麻醉和安乐死的方法

注:除需要中度镇液的Con A注射外，所有程序均需要轻度镇液。

1. 对于轻度镇滑，使用26号针在肩部下皮注射丙丙丙酮（1mg/kg）。轻度镇定终点:动物保持宽松的头部位置，耳垂不再完全直立。
   注: 如果未达到适当的端点，则可能会额外注射丙丙酮。动物应该始终保持清醒，对触摸它们的胡须作出反应，并且不要表现出呼吸的减慢。
2. 对于中度镇化，首先给动物如上所示的丙丙酶。到达端点后（见上面的说明），使用 O₂流量设置为 1 L/min 且等氟传递设置为 5%的防毒面具给分路胶（图2）。
3. 管理除虫，直到兔子的身体色调完全放松，耳朵是完全软盘。
   注意:当动物侧翻时，不应发生补偿性肌肉运动;呼吸总是自发的。
4. 自发恢复发生在2-5分钟内:迹象包括自发性头部运动和增加或正常的肌肉张力。在适度镇颤实验程序完成后，观察兔子约30分钟或直到它们的行为恢复正常。
   注:在任一形式的镇颤期间，不需要眼部膏。1） 在轻度镇静中，动物仍然警觉并保持眨眼反射。在中度镇颤中，对眨眼反射的抑制非常短，以至于眼部表面没有危险。2） 在眼部表面放置眼软膏，使测试期间评估的结构无法可视化。
5. 安乐死:使用过量的静脉注射五巴比妥（100毫克/千克）。

3. 去除补膜

1. 在适应期（通常是第一周）进行切除，以便对角膜进行完整和准确的评估。
2. 注射到右侧补膜
   注:如果要去除两只眼睛的膜，在一个会话中执行此操作是最简单的。从一只眼睛开始，按照描述继续。为了清楚描述，此方法从右眼开始。
   1. 将兔子放在一个适当大小的限制袋中。
   2. 如步骤 2.1 所述，诱导轻度镇颤。
   3. 使用微移液器将25μL的无防腐剂利多卡因涂抹在右眼。
   4. 在眼睑之间放置一个灵活的钢丝盖规格。
   5. 使用 0.3 钳子（或等效），抓住顶点的补膜并将其扩展到角膜上。
   6. 使用26号锋利针将利多卡因1%与1:100，000肾上腺素亚结膜注射到膜底（图3A）。在补膜上应形成一个中度球。
   7. 拆下规格。
3. 对左补膜进行相同的注射。
4. 切割补膜
   1. 大约 5 分钟后，将盖子规格放回右眼。使用 0.3 钳（或类似）抓住并缩回其顶点的补扣膜。
   2. 使用韦斯特科特剪刀或等效剪刀将其底座上的薄膜切下（图3B）。
      注:出血量最小，通常不需要烧灼。然而，高温电池烧灼始终保存在附近，以防需要额外的节位。
   3. 拆下规格。
   4. 将局部抗生素膏放在眼睛上（例如，新霉素、多霉素、巴氏素和氢皮质酮）。
5. 保持硬体腺完好无损。当膜缩回时，有时会看到硬质腺体。
   注:如果在去除膜后在鼻腔或上部亚结膜区域看到较大的白色质量或组织高程，则膜被切除太靠近其基部，使哈道腺自发脱垂。为了防止在后续过程中出现这种情况，请将更多的防化膜留在底座上。
6. 在进行进一步操作或进行眼表面测定之前，让眼部表面愈合至少 1 周。

4. 测量干眼参数和收集泪样

注:根据研究协议需求（例如，在基线和之后指定的时间点）测量DED参数。DED 的测量应按以下顺序进行，并经过严格努力，每次都忠实地复制它们。在一天中大约同一时间（± 1 h）测试所有动物，以尽量减少昼夜变化。这些测量通常需要两个调查员团队。

1. 把兔子放在一个限制袋里。诱导轻度镇颤。
2. 撕裂渗透性²²
   1. 手动闪烁眼睑 5-10 次，将撕裂层均匀分布于眼表面。
   2. 轻轻缩回下盖。
   3. 沿下一个圆角的胸膜和牛胸结膜的交界处使用 TearLab Osmometer 进行检测，正好是截断膜底部的后部。
   4. 按照制造商的说明，使用"撕裂实验室渗透性"测试测量渗透度。
3. 撕裂时间（TBUT）
   1. 使空间变暗，以便进行此测定。
   2. 在眼睑之间放置一个钢丝盖。
   3. 使用微移液器在角膜表面涂抹 50 μL 降 0.2% 的荧光蛋白。如果第一滴没有获得角膜上的荧光辛均匀分布，则放置第二滴。
   4. 立即启动计时器。
   5. 在蓝光下观察角膜前撕裂膜。TBUT 被定义为开发黑点、线条或荧光片明显中断所用的时间（图4）。如果需要，请使用提供±1.50放大倍率的手术放大镜，以更好地可视化分手的早期迹象。最多 1 分钟监控;如果此处定义的分手发生在 1 分钟后，则记录 TBUT 仅为 60 秒。
4. 希尔默的撕裂测试（STT）
   1. 在眼部表面涂抹25μL无防腐剂利多卡因。
   2. 将韦克细胞手术矛放入劣质的fornix中，以吸收残留的利多卡因和任何泪液。如果需要，使用下眼睑覆盖海绵的近端，以帮助保持其到位（图5A）。
   3. 大约 30 s 后，取出韦克海绵。
   4. 立即将Schirmer的撕裂测试条插入角膜和下盖中点眼膜结膜之间的空间。
   5. 立即启动计时器 （图 5B）。
   6. 5分钟后，测量条带湿润部分的长度;这是 STT 值。
   7. 以三重值执行度量值，并将 3 个读数的平均值报告为 STT 值。
5. 眼泪样本的收集
   1. 要收集泪液样本，以检测其中各种分析物（如乳铁蛋白）的检测水平，在 STT 值记录在 5 分钟后，请保持条带原位，直到获得至少 20 mm 的润湿。
      注:如果在诱导 DED 后未发生足够的润湿，则将条带深入下部，以帮助在合理时间内到达此端点。
   2. 切湿条，并立即放入490μL的冷冻催泪液（4%BSA，1M NaCl，0.1%补间-20在PBS与蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。
   3. 将样品保存在冰上，直到样品储存在-80°C，直到测定为止。
6. 玫瑰孟加拉染色（RBS）
   1. 使用微移液器在角膜上涂抹 50 μL 的 1% 无防腐剂利多卡因。
   2. 30 s 后，将 25 μL 的 1% 玫瑰角放在眼表面，然后手动眨眼皮均匀分布。
   3. 立即启动计时器。
   4. 3.5 分钟时，在盖子之间放置一个钢丝盖规格。
   5. 4.0分钟，拍摄高级结膜和角膜表面（图6）。
      注:根据正在使用的摄像机类型进行调整。典型设置:数字单镜头反光相机、光圈优先模式（光圈 13 或更大）、ISO 6000、100 mm 微距镜头，并配有两个 12.5 mm 扩展管、手动对焦模式、最大放大倍率镜头以及从微距/环闪光灯设置为自动通过镜头模式的照明。环形闪光灯对焦灯打开，以帮助聚焦角膜。
   6. 在 1 分钟内完成两只眼睛的所有照片。
7. 分数眼表面染色使用NEI方法²³修改如下。不要等级 6 单独的结膜区。得分每个眼睛的优等结膜。这是结合表面的部分，无需操纵地球即可轻松拍摄。操作可以切实改变眼部表面的染色。
8. 泪乳铁蛋白水平是从乳腺中产生撕裂的代用品。根据制造商的说明，使用酶连结免疫吸附剂测定²⁴试剂盒，测定上述眼泪中收集的泪乳铁蛋白。

5. 干眼的诱导和治疗

注:注入轨道乳腺系统的三个部分。

1. 将兔子用0.2毫克/千克的醋酸亚皮下。
2. 切掉轨道和头皮区域的毛皮，并使用奈尔完全去除任何残留的毛皮。保持皮肤完全光滑，以更好地可视化解剖特征和美国指导注射的康卡纳平A（图7）。
3. 如上文所述，诱导中度镇化。
4. 注射高级乳胶体 （PSLG） 的苍白部分
   注:首先执行PSLG注射。
   1. 用微移液器涂抹于适当的眼睛25 μL无防腐剂利多卡因1%。
   2. 恒上眼睑，并施加温和的中压后轨道边缘，直到出现标记腺体苍白部分的突起。PSLG 在上盖的后部（时态）部分显示为小球状高程。
      注:要在学习过程中查看腺组织，请向区域应用5%的荧光成因（图8A）。眼泪可以看到流从球状PSLG。在Con A的管理中不需要使用荧光管;它仅用于说明目的，以显示腺组织。
   3. 使用细齿钳和27量表针在结核蛋白注射器上，直接穿透腺体使用转结膜方法。将针头推进2毫米进入组织，在0.1 mL的体积下注射500μg的Con A（图8B）。
      注:这种注射有时可能是痛苦的。如有必要，将动物放在离尼氏体下，直到注射完成。
5. 轨道高级乳胶体（OSLG）的注入
   注:OSLG 迅速跟随。
   1. 对地球施加中压，使 OSLG 从后部保险中突出（如果需要，请参阅参考²⁵进行解剖）。用后切口的OSLG向地球施加中压（图9，红色箭头）。突起作为总本地化，以找到后保险。
   2. 使用弯曲的钳子，用尖头关闭，以缩进区域，直到头骨的骨开口被感觉到。这将像在突起下的前/后方向一样裂开。
   3. 用钳子施加适度的压力，在皮肤中留下凹痕，这将成为针扎的地标（图10A）。
   4. 将针头（带 27 米、5/8 英寸针头的结核针）垂直于皮肤的缩进标记（图 10B）= 1⁄4 英寸进入切口，然后从后部和外部将针头重定向到侧射器，瞄准注射部位和骨轨道边缘之间的中点。
      注:如果保险不是用针精确瞄准的，头骨会阻碍其前进。
   5. 到达针的轮毂后，在 0.2 mL 的体积中缓慢注入 1000 μg 的 Con A（图 10C）。
6. 在 2-3 分钟内完成 PSLG 和 OSLG 的注入。
7. 将动物从异脱镇化（如果尚未完成）中取出。注射劣质乳胶腺（ILG）通常无需进一步镇精即可完成。
8. 注射劣质乳胶体
   1. 从侧面查看动物。ILG的突出性可以沿轨道的下前部分看到（图11A）。
   2. 使用手术标记笔或适当的永久性标记在皮肤上绘制一条垂直线，其中 ILG 腺体的表面部分从其表面（更外在）静止位置过渡到其在轨道上的更中位位置。这通常不如前肢 （图 11A）.
   3. 通过在皮肤上扫过这条线的垂直持有的美国探针，识别酶骨的末端。ILG 过渡发生在腺体图像从明显被限制（沿图像的腺体下边缘看到酶骨的超回声线）变为没有可识别的内边界（酶骨回波不再存在，图 1）。
   4. 当美国屏幕显示此更改时，观察手件与皮肤上绘制的线条的相对位置。这是应该给出 Con A 的"注射站点"。
   5. 控制注射深度，使 Con A 放入腺体中，正好与酶弓骨的中位。
   6. 确定注射深度如下:将所需的注射深度设置为酶骨的深度（高回音信号）加1 mm。从已知针的长度（本例中为15 mm）中减去此值。
   7. 将针头插入"注射部位"±12 mm处的腺体中，然后慢慢取出，直到外露的针头长度（用手术卡钳测量）等于5.8.6计算的差值（图12）。在 0.2 mL 中注入 1000 μg 的 Con A。
      注:为确保腺体胶囊被刺穿，而不是简单地由针头推动，在取下之前，针头应插入+12 mm或几乎插入轮毂。
   8. 重复美国，以确认注射成功。ILG 应显示一个典型的低附声空间 （图 1）。
      注:ILG注射是动物²⁶最能容忍的注射，因此，最后完成。
9. 完成整个过程，在10分钟内注射两眼的所有腺体。这将要求在程序中达到能力。
   注:一组注射到2个轨道乳胶腺将诱发持续1-2周的急性DED。
10. 对于持续时间较长的 DED，每 7 天注入 Con A。已成功执行多达 6 次此类注射。

6. 手术后护理

1. 注射Con A后，在限制袋中监测动物至少10-20分钟，或直到麻醉效果减弱。
2. 不要让动物无人看管，直到它们恢复足够的意识来维持胸腔。在完全恢复之前，不要将它们送回各自的笼子。
3. 手术后疼痛通常比较轻微，持续不到48小时。如果需要，给予一剂皮下酮洛拉（5毫克/千克）。对于更严重的疼痛，每8小时给予皮下丁丙诺啡0.1毫克/千克。

Results

Con A注射在以密集淋巴细胞渗透为特征的乳痛腺中引起强烈的炎症反应（图13），同时减少撕裂。所有撕裂参数均有明显改变（表1及表2）。此外，泪乳铁蛋白水平被抑制（控制 = 3.1±0.45 vs. Con A 注射 = 2.7±0.02 纳克/毫克蛋白质（均值 = SEM）;p<0.03）。最终结果是角膜和结膜上皮受损，玫瑰节染色增加（图6）证明了这一点。

注射三个轨道LG组织产生了一致和均匀的DED状态，不同于以前方法^18，27实现的状态。这一结果的主要贡献者是美国指导的注入ILG和注入OSLG。表1总结了此方法的显著结果。所有更改均与严重 DED 一致。

一组 Con A 注射产生持续约 1 周的 DED;所有临床参数于第10天（表2）恢复正常。连续 Con A 注射间隔约 1 周，从而延长了 DED 的持续时间。例如，第 7 天的第二组 Con A 注射将 DED 维护 2 周，等等。在大约 5 组注射后，DED 状态通常变为永久状态，无需进一步注射。

当使用Con A诱导DED的兔子用新型药物磷酸琳达克治疗时，它明显抑制了这种疾病。例如，与经过车辆处理的动物相比，经过一周的这种剂 TBUT 治疗后，与车辆处理的动物相比，明显增加（43.6±4.0 vs. 12.2±2.8 s;p<0.001;平均值 SEM = 分别用于这些值和以下值），而撕裂渗透率则得到正常化（294*4.6 vs. 311±2.0 mOsm/L，+p lt;0.02）。从机械上讲，磷酸素降低了两个关键的中白蛋白的水平，IL-1+（8.4±1.2 vs 21.2±6.6 pg/mg蛋白质;p<0.03）和IL-8（4.9±1.7 vs. 13.5 pg/mg蛋白;p<0.05）¹⁹.

图1:下级乳腺的超声图像。上面板:ILG在轨道中向更深移动，位于酶形拱门下方。虚线表示扫描美国探测器的皮肤上的线。中间面板:当手举器横扫这条线时，检查人员会寻找左图像（箭头）中存在的酶体骨回波的丢失，并在右侧消失。下面板:ILG在（左）和后（右）注射Con A.在腺体内开发一个大型囊肿的图像证实了正确的交付.转载许可¹⁹。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:防毒面具镇化。这张照片显示了防毒面具提供短暂的适度镇流与苯二苯还苯。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:去除补膜。（A）注射利多卡因/肾上腺素。（B）用韦斯特科特剪刀截断其底座上的膜。（C）去除锥形膜后，眼部表面更容易可视化。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:撕裂分解时间测量。（A）在应用荧光液滴后立即在蓝光下使角膜表面出现均匀的绿色泪膜外观。（B）已经经历了明显断裂的角膜表面，荧光管中有多个黑眼圈和线性条纹。一旦第一个暗点或线出现，就会记录断裂时间。两个浅蓝色圆圈是角膜光源的反射。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:席尔默的撕裂测试。（A）正确放置韦克-塞尔海绵，以去除任何残留的局部利多卡因溶液和基线撕裂。通过将三角形海绵的后边缘置于下盖边缘下方，可以保持非常均匀的技术，在放置泪条之前干燥眼部表面。（B）适当放置在地球和下盖之间下盖中间位置的泪条（palpebral 结膜）。请点击此处查看此图的较大版本。

图6:玫瑰染色。上部:角膜表面的照片。左图:在使用 Con A 治疗之前，不存在玫瑰花条染色。右:扩散角膜和结膜染色见上鼻象限注射后（右上）。下部:结膜印象细胞学从上优的牛结膜。左图:治疗前存在许多果子细胞。右:存在内皮细胞，但治疗后没有血球细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

图7:准备兔注射凝结剂A注射。（A）使用小剪去除毛皮，便于识别地标，以识别轨道优越的乳胶体。（B）奈尔用于去除剪切后残留的头发。请点击此处查看此图的较大版本。

图8:注射帕佩布拉勒乳突腺。（A）上盖后时间部分的乳胶腺体，以球状高程的形式出现。在涂抹 2% 的荧光后，可以看到从这个腺体表面流淌的眼泪。（B）当兔子接受中度镇颤时，正在注射苍白的乳突腺。一名调查员缩回眼睑，优化腺体的暴露，并在第二个调查员注射腺体时固定面罩。请点击此处查看此图的较大版本。

图9:轨道优等乳突体局部化。皮肤轮廓的变化表明OSLG的位置，因为它通过后护套突出。地球（大箭头）上的交替中压导致优越的轨道腺脱垂，这被视为皮肤中的小高程。每次施加压力时，此高程都会增大 （小箭头）。这个腺体的位置通常与后轨道边缘一致。请点击此处查看此图的较大版本。

图10:注入轨道优越的乳胶体。（A）在如图9所示的脱垂区域，用细齿钳对颅骨施加温和压力。头骨中的薄缝状开口可以裂开。在注射过程中，用钳子留下一个小的缩进标记，大大有助于针的放置。（B）针头正通过保险器垂直插入。如果放置不正确，其通道被骨头骨停止。（C）针处于最终位置，朝向侧锥形。请点击此处查看此图的较大版本。

图11:劣质乳胶体局部化。（A） ILG表面部分的突出性通过下盖看。曲线笔标记表示腺体的下部位置。鼻边缘下的垂直线表示 ILG 在轨道内向更深层位置过渡的近似位置，并充当美国的视觉参考。（B）美国手件横扫垂直线区域;美国监视器将显示酶骨的末端、ILG 过渡的位置以及应给予 Con A 注射的位置（"注射部位"）。请点击此处查看此图的较大版本。

图12:注射劣质乳胶体。ILG 的注射在美国确定的位置进行。注射深度按文本（步骤 5.8.6）中所述计算。卡尺（见针头后面）确保注射前将针头置于适当的深度。请点击此处查看此图的较大版本。

图13:乳腺的法学。具有典型管状-叶状物结构（A）的正常劣质乳胶腺的组织部分，在注射Con A（B）后，显示明显的淋巴细胞渗透与结构的渗出。类似的炎症渗透在优越的乳腺中可见。请点击此处查看此图的较大版本。

注射方法	TBUT， 秒		撕裂渗透，奥斯姆/L		STT，毫米
	基线	注射后	基线	注射后	基线	注射后
	均值 = SEM，百分比变化
没有美国指导的ILG	58.5 × 1.5	44.5 × 7.7	297 × 4.9	300 × 3.8	15.2 ± 0.9	12.9 × 2.2
%变化		-23%		1%		-15%
		p=0.05		p=0.36		p=0.21
美国指导的ILG + PSLG	59.4 × 0.6	11.4 × 4.2	296 × 4.7	326 × 3.7	15.1 × 1.3	10.7 × 1.8
% 变化		-81%		10%		-29%
		p<0.0001		p<0.0001		p<0.03
美国指导的 ILG + PSLG + OSLG	60 × 0.0	6.2 × 1.3	299 × 2.9	309 × 2.8	14.6 ± 0.9	9.9 × 1.3
% 变化		-90%		3%		-32%
		p<0.0001		p<0.008		p<0.002
在将 Con A 单次注入所列腺体后，在第 6 天测量所有值。所有比较都比较了基线。*ILG，劣质乳胶体;PSLG，高级乳胶体部分;OSLG，高级乳腺的轨道部分;美国，超声波

表1:注射技术对干眼严重程度的影响和注射部位数量。

	基线	第6天	第13天	第21天
		1 次注射	2次注射	3次注射
TBUT， 秒	58.5 × 1.5	44.5 × 7.7	29.2 × 7.8	12.8 × 3.9
% 变化		-24%	-50%	-78%
		p=0.17	p=0.001	p<0.0001
Osm，Osm/L	297 × 4.9	300 × 3.9	308 × 4.9	313 × 2.7
% 变化		1%	4%	5%
		p=0.36	p=0.04	p=0.003
STT，毫米	15.2 ± 0.9	9.3 × 1.6	12.9 × 1.6	7.4 × 1.1
% 变化		-39%	-15%	-51%
		p=0.17	p=0.13	p=0.008
与基线进行了比较。

表2:反复向ILG注射ConA对DED持续时间的影响。

Discussion

兔子对DED的研究极具吸引力。与小鼠和大鼠相比，它们的角膜和结膜表面积接近人类;它们的药物代谢酶（如酯酶）和乳胶腺的成因学与人类相似，它们的眼睛足够大，足以进行翔实的药代动力学研究。与猪和猴子相比，它们具有相似的功能，它们的成本更低，并且实验操作更容易。如果考虑进行机械研究，与小鼠相比，兔子的相对缺点是可用的试剂（例如单克隆抗体）较少。另一方面，在药代动力学和生物分布研究方面，兔子远远优于小鼠，因为单个组织易于解剖，并且有足够的大小用于分析工作，避免了"样本池"。

关键的一般参数是兔子的适应期。这些动物在通常无法确保适当温度或湿度的运输环境的情况下从供应商处运出。有些动物在抵达时可能已经发育出干眼。建议两周的适应期。同样重要的是，一丝不苟地注意研究兔子被安置在活体室的湿度和温度。任何一种情况的偏差都会导致眼睛状态的巨大变化。手头有备份加湿器和除湿器。如果中央系统发生故障，请使用备份设备快速恢复环境湿度。请记住，这种不幸的事态发展在夏季更为常见。然而，成功诱导DED在兔子中的三个最关键的步骤是:1） 熟练地使用美国成像来识别ILG，并指导和确认Con A的注射;2） 确保注射ILG和SLG的两个部分;3） 可靠且可重复地对 DED 参数进行诊断。

发展所需的实验技能并非易事，但不应阻止任何认真的调查员。期望学习曲线在五次迭代中完成。美国合理的成像系统至关重要。美国对解剖学特征的识别很重要，因此，研究者应该对兔子的解剖结构进行审查。戴维斯²⁵对兔子解剖学的出色描述，一个经典，可以是非常有帮助的。还要记住 ILG 大小的变化。其推论是，Con A 的成功必须始终通过后续成像得到确认。一组兔子对Con A的反应变化通常是由于注射技术（不成功或部分成功注射）或忽略残留的乳腺组织的能力，以补偿眼泪的过度生产。对于那些希望掌握注射技术，注射亚甲蓝，然后及时解剖解剖是有帮助的;如果它到达乳腺或溢出到邻近组织，则实现可视化。迄今为止，这种注射方法已由作者执行超过270次，没有一个单一的并发症。

测定上述DED的五个参数，在临床实践中的确定同样棘手。虽然昼夜变化尚未正式记录在任何一个，有足够的背景证据表明，这种现象在眼睛^28，他们应该在一天的同一时间（± 1小时），尤其是当重复检测是执行和相互比较。执行这些检测的一致性至关重要。需要两人小组。由于某些步骤需要严格的时间，参与检测的同一房间的四名或四名以上调查员可能会造成干扰。适当和高质量的摄影文件（如果指明）非常重要。

此模型非常适合药物开发研究。掌握动物模型和测定技术确保了良好的重复性¹⁹的功效和安全研究。

这是一种强大的实验方法，因为它消除了先前模型的混淆变异性，简化了动物模型，并基本标准化了DED的五个参数的化验。该模型在候选治疗剂研究上的成功应用，肯定了其作为急需新制剂的疾病的信息性动物模型的实际效用，并加深了对其发病机制的理解。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 毫米微距镜头	佳能 EF 100mm f/2.8L IS USM	3554B002
26 号针头 （5/8）	Becton Dickinson and Company， Franklin Lakes， NJ	305115	用于将 ConA 注射到泪腺中的针头
27 号针头 （5/8）	Becton Dickinson and Company， Franklin Lakes， NJ	305921	用于将 ConA 注射到泪腺中的针头
Aceproinj（乙酰丙嗪）	Henry Schein Animal Health，都柏林，俄亥俄	NDC11695-0079-8	0.1ml/kg 皮下注射兔镇静
麻醉蒸发器	VetEquip，普莱森顿，加利福尼亚州	#911103
Bishop Harmon 镊子	Bausch 和 Lomb （Storz），新泽西州布里奇沃特	E1500-C	组织镊钳
	Bausch 和 Lomb （Storz），新泽西州布里奇沃特	E-2404	用于测量 ConA 注射过程中针头长度的卡尺
Concanavalin A	Sigma， St. Louis， MO	C2010	在 PBS 中制备 5mg/ml 用于注射到兔泪腺
DSLR 相机	佳能 EOS 7D DSLR	3814B004	数码单镜头反光相机
素	阿克伦，伊利诺伊州森林湖	NDC17478-253	用 PBS 稀释至 0.2% 以测量 TBUT
异氟醚	Henry Schein，梅尔维尔，纽约	29405
乳铁蛋白 ELISA 试剂盒	MyBiosource，圣地亚哥，加利福尼亚州	MBS032049 测量	泪液乳铁蛋白水平
利多卡因	Sigma，圣路易斯，密苏里	L5647 1	% 的 PBS 用于麻醉剂
宏/环闪光	佳能宏环 Lite MR-14EXII	9389B002AA
渗透压尖端	TearLab Corp.，圣地亚哥，CA	#100003REV R	测量泪液渗透压
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Mediatech， Inc. 马纳萨斯，弗吉尼亚州	21-031-CV
兔子，新西兰 白色或荷兰系腰带（如文所述）	Charles River Labs，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	2-3 公斤	研究动物
玫瑰孟加拉	Amcon Laboratories Inc.，圣路易斯，密苏里州	NDC51801-004-40	1% 的 PBS，对眼表进行染色
Schirmerstrips	Eaglevision、Katena 产品。新泽西州丹维尔	AX13613	测量泪液产生
外科放大镜 +1.50	视觉设计，纽约州波希米亚	专业项目	在观察泪膜破裂和进行伴刀豆球蛋白 A 注射的同时提供宏伟的眼表。
TearLab 渗透压计	TearLab Corp.， San Diego， CA	型号 #200000W REV A	测量泪液渗透压
超声探头	VisualSonics Toronto， Ont	MX 550 S	超声导流引导 Con A 注射用于泪下腺