Summary
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een methode om acute of chronische droge oogziekte bij konijnen te veroorzaken door concanavalin A te injecteren in alle delen van het orbitale traankliersysteem. Deze methode, superieur aan de reeds gemelde, genereert een reproduceerbaar, stabiel model van droge ogen geschikt voor de studie van farmacologische middelen.
Abstract
Droge oogziekte (DED), een multifactoriële ontstekingsziekte van het oculaire oppervlak, treft 1 op de 6 mensen wereldwijd met duizelingwekkende gevolgen voor de kwaliteit van leven en de kosten van gezondheidszorg. Het ontbreken van informatieve diermodellen die de belangrijkste kenmerken ervan samenvatten, belemmert het zoeken naar nieuwe therapeutische middelen voor DED. Beschikbare DED-diermodellen hebben een beperkte reproduceerbaarheid en werkzaamheid. Een model wordt hier gepresenteerd waarin DED wordt geïnduceerd door het injecteren van de mitogen concanavalin A (Con A) in de orbitale traanklieren van konijnen. Innovatieve aspecten van dit model zijn het gebruik van echografie (VS) begeleiding om een optimale en reproduceerbare injectie van Con A in de inferieure traanklier te garanderen; injectie van Con A in alle orbitale traanklieren die de compenserende productie van tranen beperken; en het gebruik van periodieke herhalingsinjecties van Con A die de toestand van DED naar testament verlengen. DED en haar reactie op testagenten worden gecontroleerd met een panel van parameters die scheurproductie, de stabiliteit van de traanfilm en de status van het hoornvlies en bindvliesslijm beoordelen. Ze omvatten traan osmolarity, scheur break-up tijd, Schirmer's traan test, roos Bengaalse vlekken, en scheur lactoferrine niveaus. De inductie van DED en de monitoring van de parameters worden in detail beschreven. Dit model is eenvoudig, robuust, reproduceerbaar en informatief. Dit diermodel is geschikt voor de studie van scheurfysiologie en van de pathofysiologie van DED en voor de beoordeling van de werkzaamheid en veiligheid van kandidaat-agenten voor de behandeling van DED.
Introduction
Droge oogziekte (DED) is een chronische aandoening met een hoge prevalentie en morbiditeit1,2,3,4. Ontsteking speelt een belangrijke rol in zijn pathogenese5,6. De pathofysiologie van DED is geconceptualiseerd als gevolg van onderproductie of oververdamping van tranen; de eerste is ook bekend als water-tekort DED7. Het syndroom van Sjögren, een uitgebreid bestudeerde prototypische oorzaak van DED, beïnvloedt voornamelijk de traanklieren (LP's) en is een treffend voorbeeld van hun belang in de pathogenese van DED. DED wordt vaak behandeld met kunstmatige tranen die tijdelijke verlichting bieden, of met cyclosporine of lifitegrast, die beide onderdrukken oculaire ontsteking. Geen van de beschikbare behandelingen voor DED zijn optimaal, waardoor de ontwikkeling van nieuwe middelen8,9noodzakelijk is.
De zoektocht naar nieuwe therapeutische middelen voor DED wordt belemmerd door drie grote uitdagingen: het ontbreken van een erkend druggable moleculair doel, dat ongrijpbaar kan zijn gezien de pathofysiologische complexiteit van DED; de sparsiteit van veelbelovende agenten; en het gebrek aan diermodellen die belangrijke kenmerken van DED samenvatten.
Zoals met de meeste inspanningen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, informatieve diermodellen van DED zijn een cruciaal onderzoeksinstrument, ondanks de axiomatische verklaring dat geen enkel dier model volledig recapituleert een menselijke ziekte. Muis, rat, en konijn modellen van DED zijn de meest gebruikte terwijl honden en primaten worden zelden gebruikt10,11. De meeste van de meer dan 12 konijn DED modellen gemeld tot nu toe proberen om scheur productie te verminderen door ofwel het verwijderen van GS of door het belemmeren van hun functie12,13,14,15,16. Dergelijke benaderingen omvatten de chirurgische resectie van de ILG; sluiting van het uitscheidingskanaal; en afbreuk doen aan de functie van LG door bestraling of injectie van een van de volgende: geactiveerde lymfocyten, mitogenen, botulinetoxine, atropine of benzalklonium. Grote beperkingen van deze methoden zijn hun inconsistentie en de frequente gedeeltelijke onderdrukking van scheurproductie.
Concanavalin A (Con A), een lectine van plantaardige oorsprong, is een krachtige stimulator T-cel subsets en is gebruikt in experimentele modellen van hepatitis17 en DED18. Het oorspronkelijke Op Con A gebaseerde model bood naar verluidt aanzienlijke voordelen, waaronder de relatieve eenvoud; inflammatoire celinstroom in de LP's, het nabootsen van ziekten zoals Sjogren's; stimulatie van de ontstekingsremmende cytokines IL-1β, IL-8 en TGF-β1; verminderde scheurfunctie die wordt gecontroleerd door het meten van scheurfluoresceinespeling en scheurbreak-up tijd (TBUT); en reactievermogen van geneesmiddelen getoond voor een ontstekingsremmende corticosteroïde.
Toen deze veelbelovende methode werd toegepast, werden, naast de voordelen ervan, beperkingen vastgesteld die de algehele herziening en drastische verbeteringen noodzakelijk maakten. Drie kritieke tekortkomingen van de methode worden gedocumenteerd. Ten eerste was het model acuut; de geïnduceerde DED zakte na ongeveer 1 week. Ten tweede was de reactie van de dieren inconsistent. Zoals aangetoond, in "blinde" transcutane injecties aan de Inferieure LG (ILG), Con A werd geleverd slechts willekeurig aan de beoogde klier. Gedetailleerde studie van de anatomie van de ILG bleek dat de grootte ervan kan variëren zo veel als 4-voudige19 het maken van dergelijke injecties "hit-or-miss" inspanningen. Ten slotte, zelfs toen de ILG werd geïnjecteerd, de superieure LG (SLG) vaak gecompenseerd voor de verminderde traanstroom, waardoor het model problematisch.
Deze belangrijke beperkingen werden overwonnen door de invoering van drie wijzigingen in de methode, het genereren van een superieur dier model van DED. Ten eerste werd de injectie van Con A in de ILG uitgevoerd onder echografie (VS) begeleiding, ervoor te zorgen dat Con A in de klier. Het succes van de injectie werd bevestigd door het verkrijgen van een post-injectie Amerikaanse beeld, zoals blijkt uit figuur 1. Ten tweede, om de compenserende scheurbijdrage van de SLG te verwijderen, werden zowel de palpebral- als orbitale delen van deze klier geïnjecteerd met Con A. Ten slotte werd dit acute model van DED omgezet in een chronische door herhaalde injecties van Con A om de 7-10 dagen. DED van 2 maanden duur wordt gemakkelijk bereikt bij deze konijnen. Het succes van deze aanpak is ruimschoots gedocumenteerd19.
Zoals reeds vermeld, is een belangrijke toepassing van diermodellen van DED het bepalen van de werkzaamheid en veiligheid van kandidaat-therapeutische middelen. Het nut van dit model werd aangetoond door de studie van fosfosulindac (OXT-328), een nieuw ontstekingsremmend klein molecuul20,21 toegediend als oogdruppels. De werkzaamheid ervan werd aangetoond op basis van een panel van parameters van DED19. De relatieve eenvoud en informatieve aard van dit model ook toegestaan side-by-side vergelijking van fosfosulindac met de twee FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor DED, cyclosporine en lifitegrast, waaruit blijkt zijn sterke preklinische superioriteit.
Protocol
Alle dierstudies werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van De Universiteit van Steensteen en uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en Vision Research.
1. Dieren en huisvesting
- Verwerven Nieuw-Zeeland Wit (NZW) konijnen met een gewicht van 2-3 kg.
- Huis de konijnen afzonderlijk in kooien met een strikte temperatuur (65 ± 5 °F) en vochtigheid (45 ± 5%) Controle. Verlichting moet een aan/uit-cyclus van 12 uur hebben.
- Bied onbeperkte toegang tot water en standaard konijn chow. Elimineer dieetverrijkingen omdat ze vitamine A kunnen bevatten die het oog aantast.
- Acclimatiseer de dieren gedurende ten minste 2 weken voorafgaand aan de nulmetingen of inductie van droge ogen.
2. Methoden van anesthesie en euthanasie
OPMERKING: Alle procedures vereisen een milde sedatie, behalve voor Con A-injectie die een matige sedatie vereist.
- Injecteer voor milde sedatie acepromazine (1 mg/kg) onderhuids over de schouders met behulp van een naald van 26 meter. Eindpunt voor milde sedatie: dieren behouden een ontspannen hoofdpositie met oorkwabben niet meer volledig rechtop.
OPMERKING: Als het juiste eindpunt niet wordt bereikt, kan een extra injectie van acepromazine worden gegeven. Dieren moeten altijd wakker blijven, reageren op het aanraken van hun snorharen, en nooit laten zien vertraagde ademhaling. - Voor matige sedatie, geef eerst de dieren acepromazine zoals hierboven. Nadat het eindpunt is bereikt (zie de bovenstaande notitie), geef je isoflurane met behulp van een gasmasker met O2-stroom ingesteld op 1 L/min en isoflurane levering ingesteld op 5% (Figuur 2).
- Toedienen isoflurane totdat het lichaam van het konijn toon is volledig ontspannen en oren zijn volledig floppy.
OPMERKING: Er mogen geen compenserende spierbewegingen optreden wanneer het dier op zijn kant wordt gedraaid; ademhaling blijft altijd spontaan. - Spontaan herstel vindt plaats binnen 2-5 min: tekenen zijn spontane hoofdbewegingen en verhoogde of normale spiertoon. Nadat de experimentele procedure is voltooid met matige sedatie, observeer de konijnen ongeveer 30 minuten of totdat hun gedrag weer normaal is.
OPMERKING: Oogheelkundige zalf is niet nodig tijdens beide vormen van sedatie. 1) Bij milde sedatie zijn dieren nog steeds alert en handhaven ze een knipperreflex. Bij matige sedatie is de remming van de knipperreflex zo kort dat het oculaire oppervlak geen risico loopt. 2) Plaatsing van oogheelkundige zalf op het oculaire oppervlak sluit visualisatie van structuren die tijdens het testen worden beoordeeld, uit. - Euthanasie: Gebruik een overdosis intraveneuze pentobarbital (100 mg/kg).
3. Verwijdering van het nictitating membraan
- Voer de verwijdering tijdens de acclimatisatieperiode (meestal de eerste week) uit om volledige en nauwkeurige evaluatie van het hoornvlies mogelijk te maken.
-
Injectie op het juiste nictitating membraan
OPMERKING: Als het nictitating membraan van beide ogen moet worden verwijderd, is het het eenvoudigst om dit in één sessie te doen. Begin met één oog en ga verder zoals beschreven. Voor de duidelijkheid van de beschrijving, deze methode begint met het rechteroog.- Plaats het konijn in een geschikt formaat straatverbod.
- Induceren milde sedatie zoals beschreven in stap 2.1.
- Breng 25 μL conserveermiddelvrij lidocaine aan op het rechteroog met behulp van een micropipette.
- Plaats een flexibel draaddekselspeculum tussen de oogleden.
- Met behulp van 0,3 tangen (of equivalent), pak de nictitating membraan op zijn top en uit te breiden over het hoornvlies.
- Injecteer lidocaine 1% met 1:100.000 adrenaline subconjunctivally in de basis van het nictitating membraan met behulp van een 26-gauge scherpe naald (Figuur 3A). Een matige bleb moet zich vormen over het nictitating membraan.
- Verwijder het speculum.
- Voer een identieke injectie uit aan het linker nictitating membraan.
-
Het nictitating membraan snijden
- Na ongeveer 5 min, plaats het deksel speculum terug in het rechteroog. Pak en trek het nictitating membraan aan de top met behulp van 0,3 tangen (of iets dergelijks).
- Snijd het nictitating membraan aan de basis af met een Westcott-schaar of -equivalent (figuur 3B).
OPMERKING: Bloeden is minimaal en vereist meestal geen cautery. Niettemin wordt een hoge temperatuur batterij cautery altijd in de buurt gehouden in het geval extra hemostase nodig is. - Verwijder het speculum.
- Plaats actuele antibioticazalf op het oog (bijvoorbeeld neomycine, polymyxine, bacitracine en hydrocortison).
- Laat de Harderian klier intact. De Harderian klier wordt soms gezien wanneer het nictitating membraan wordt ingetrokken.
OPMERKING: Als een grote witte massa of weefselverhoging wordt gezien in het neus- of superieure subconjunctivale gebied nadat het nictitating membraan is verwijderd, werd het membraan te dicht bij de basis gereseceerd, waardoor de Harderian klier spontaan kan verzakkingen. Om dit te voorkomen in latere procedures, laat meer van de nictitating membraan aan de basis. - Laat het oculaire oppervlak minstens 1 week genezen voordat verdere manipulaties worden gemaakt of oculaire oppervlaktetesten worden uitgevoerd.
4. Meting van parameters voor droge ogen en verzameling van traanmonsters
OPMERKING: Meet DED-parameters op basis van de behoeften van het studieprotocol (bijvoorbeeld bij basislijn en gespecificeerde tijdspunten daarna). Metingen voor DED moeten worden gedaan in de volgende volgorde, met rigoureuze inspanning om ze trouw te repliceren elke keer. Test alle dieren op ongeveer hetzelfde tijdstip van de dag (± 1 uur) om circadiane variaties te minimaliseren. Deze metingen vereisen meestal een team van twee onderzoekers.
- Doe het konijn in een straatverbod. Induceren milde sedatie.
- Scheur Osmolarity22
- Knipper handmatig met de oogleden 5-10 keer om de traanlaag gelijkmatig over het oculaire oppervlak te verdelen.
- Trek het onderste deksel voorzichtig in.
- Proef tranen met de TearLab Osmometer op de kruising van de palpebral en bulbar conjunctiva langs de onderste fornix, net achterste aan de basis van de afgekapte nictitating membraan.
- Meet de osmolariteit met behulp van de TearLab Osmolarity Test volgens de instructies van de fabrikant.
- Tear break-up time (TBUT)
- Verduister de kamer voor deze test.
- Plaats een draaddeksel speculum tussen de oogleden.
- Breng een 50 μL druppel van 0,2% fluoresceine over het hoornvliesoppervlak met behulp van een micropipet. Als zelfs de distributie van fluorescein over het hoornvlies niet met de eerste daling wordt verkregen, plaats een tweede daling.
- Start onmiddellijk een timer.
- Observeer de pre-hoornvliestraanfilm onder een blauw licht. De TBUT wordt gedefinieerd als de tijd die nodig is om zwarte stippen, lijnen of duidelijke verstoring van de fluoresceinefilm te ontwikkelen (figuur 4). Indien nodig, gebruik chirurgische loupes die +1,50 vergroting bieden om vroege tekenen van break-up beter te visualiseren. Monitor tot 1 min; als break-up zoals hier gedefinieerd vindt plaats na 1 min, opnemen TBUT voor slechts 60 s.
- Schirmer's Tear Test (STT)
- Breng een 25 μL druppel conserveermiddelvrij lidocaine aan op het oculaire oppervlak.
- Plaats een Weck cel chirurgische speer in de inferieure fornix om resterende lidocaine en eventuele traanvloeistof te absorberen. Gebruik indien nodig het onderste ooglid om het proximale uiteinde van de spons te bedekken om het op zijn plaats te houden(figuur 5A).
- Na ongeveer 30 s, verwijder de Weck spons.
- Plaats onmiddellijk de scheurteststrip van een Schirmer in de ruimte tussen het hoornvlies en het palpebralbindvlies in het midden van het onderste deksel.
- Start onmiddellijk een timer (figuur 5B).
- Meet na 5 minuten de lengte van het bevochtigde gedeelte van de strip; dit is de STT-waarde.
- Voer metingen uit in drievoud en rapporteer het gemiddelde van de 3 metingen als de STT-waarde.
- Verzameling van traanmonsters
- Om traanmonsters te verzamelen voor het intrekken van niveaus van verschillende analyten in hen, zoals lactoferrine, nadat de STT-waarde op 5 min is geregistreerd, laat u de strook op zijn plaats totdat een bevochtiging van ten minste 20 mm is verkregen.
OPMERKING: Als er geen voldoende bevochtiging optreedt nadat DED is geïnduceerd, ga dan dieper door naar de onderste fornix om dit eindpunt binnen redelijke tijd te bereiken. - Snijd de bevochtigde strip en plaats onmiddellijk in 490 μL gekoelde Tear Collection Buffer (4% BSA, 1M NaCl, 0,1% Tween-20 in PBS met proteinase inhibitor cocktail).
- Bewaar de monsters op ijs totdat ze kunnen worden opgeslagen bij -80 °C, waar ze moeten blijven tot in de gaten wordt gebracht.
- Om traanmonsters te verzamelen voor het intrekken van niveaus van verschillende analyten in hen, zoals lactoferrine, nadat de STT-waarde op 5 min is geregistreerd, laat u de strook op zijn plaats totdat een bevochtiging van ten minste 20 mm is verkregen.
- Rose Bengal Vlekken (RBS)
- Breng 50 μL van 1% conserveermiddelvrij lidocaine aan op het hoornvlies met behulp van een micropipet.
- Na 30 s, plaats 25 μL van 1% roos bengalen op het oculaire oppervlak en handmatig knipperen het ooglid om het gelijkmatig te verdelen.
- Start onmiddellijk een timer.
- Plaats op 3,5 min een draaddekselspeculum tussen de deksels.
- Foto om 4.0 min het superieure bindvlies- en hoornvliesoppervlak (figuur 6).
OPMERKING: Aanpassen aan het type camera dat wordt gebruikt. Typische instellingen: digitale reflexcamera met één lens, diafragmaprioriteitmodus (diafragma 13 of meer), ISO 6000, 100 mm macrolens met twee 12,5 mm verlengbuizen, handmatige scherpstelmodus, lens bij maximale vergroting en verlichting van macro/ring flitser ingesteld op automatisch met door-de-lens modus. De focuslamp van de ringflitser is ingeschakeld om de focus op het hoornvlies te helpen. - Vul alle foto's voor beide ogen binnen 1 min.
- Score oculaire oppervlaktekleuring met behulp van de NEI methode23 gewijzigd als volgt. Niet rang 6 aparte bindvlieszones. Scoor de superieure bindvlies van elk oog. Dit is het gedeelte van het bindvlies oppervlak gemakkelijk gefotografeerd zonder het manipuleren van de wereld. Manipulatie kan de kleuring van het oculaire oppervlak artefactually veranderen.
- Scheur lactoferrine niveaus zijn een surrogaat maatregel van scheur productie van de traanklieren. Test scheur lactoferrine in tranen verzameld als hierboven met behulp van een enzym-gebonden immunosorbent test24 kit volgens de instructies van de fabrikant.
5. Inductie en behandeling van droge ogen
OPMERKING: Drie delen van het orbitale traankliersysteem worden geïnjecteerd.
- Verdoven de konijnen met acepromazine 0,2 mg/kg onderhuids.
- Shear off de vacht in de periorbitale en hoofdhuid gebied en volledig verwijderen van eventuele resterende vacht met behulp van Nair. Laat de huid volledig glad voor een betere visualisatie van de anatomische kenmerken en de VS geleide injectie van concanavalin A (Figuur 7).
- Induceer matige sedatie zoals hierboven beschreven.
- Injectie van het palpebralgedeelte van de superieure traanklier (PSLG)
OPMERKING: Voer eerst een injectie van PSLG uit.- Breng aan op het juiste oog 25 μL conserveermiddelvrije lidocaine 1% met een micropipette.
- Evert het bovenste ooglid en breng zachte mediale druk op de achterste orbitale rand tot de uitstulping markering van de palpebral gedeelte van de klier wordt gezien. PsLG verschijnt als kleine bolvormige verhoging in het achterste (tijdelijke) gedeelte van het hogere deksel.
OPMERKING: Om het klierweefsel tijdens het leerproces te bekijken, past u 5% fluoresceine toe op het gebied(figuur 8A). Tranen kunnen worden gezien streaming van de bolvormige PSLG. Toepassing van fluoresceine is niet nodig voor de toediening van con A; het wordt alleen gedaan voor illustratiedoeleinden om het klierweefsel te tonen. - Met behulp van fijn getande tangen en een 27-gauge naald op een tuberculin spuit, direct doordringen in de klier met behulp van een transconjunctival aanpak. Breng de naald 2 mm in het weefsel en injecteer 500 μg con A in een volume van 0,1 mL (figuur 8B).
LET OP: Deze injectie kan soms pijnlijk zijn. Houd de dieren indien nodig onder isoflurane totdat deze injectie is voltooid.
- Injectie van de orbitale superieure traanklier (OSLG)
OPMERKING: OSLG volgt snel achter elkaar.- Breng mediale druk uit op de aardbol waardoor de OSLG uit steekt van de achterste incisure (zie ref25 voor anatomie, indien nodig). Breng mediale druk uit op de aardbol(figuur 9, rode pijl)met de uitstulping van de OSLG van de achterste incisure. De uitstulping dient als grove lokalisatie om de achterste incisure te vinden.
- Gebruik gebogen tangen met uiteinden gesloten om het gebied te inspringen totdat de benige opening in de schedel wordt gevoeld. Dit zal worden spleet-achtige met een voorste / achterste richting onder de uitsteeksel.
- Breng bescheiden druk met tangen om een inkeping in de huid, die zal dienen als het oriëntatiepunt voor naald plaatsing(figuur 10A).
- Steek een naald (tuberculinspuit met een 27-gauge, 5/8-inch naald) loodrecht op de huid over het inspringingsmerk(figuur 10B) ~ 1/4 inch in de incisure, dan omleiden de naald achtersterig en extern naar de laterale canthus gericht op het middelpunt tussen de injectieplaats en benige orbitale rand.
OPMERKING: Als de incisure niet precies is gericht met de naald, blokkeert de schedel de vooruitgang ervan. - Zodra de naaf van de naald is bereikt, injecteert u langzaam 1000 μg con A in een volume van 0,2 mL (figuur 10C).
- Voltooi de injectie van zowel de PSLG als OSLG binnen 2-3 min.
- Verwijder het dier uit isoflurane sedatie (indien nog niet gedaan). Injectie van de inferieure traanklier (ILG) kan meestal worden voltooid zonder verdere sedatie.
- Injectie van de inferieure traanklier
- Bekijk het dier vanaf de zijkant. De prominentie van de ILG is te zien langs het onderste voorste gedeelte van de baan(figuur 11A).
- Teken een verticale lijn met behulp van een chirurgische markering pen of geschikte permanente marker op de huid waar het oppervlakkige deel van de ILG klier overgangen van zijn oppervlakkige (meer externe) rustplaats op het zygomatische bot naar zijn meer mediale locatie in de baan. Dit is meestal inferieur aan de voorste limbus(figuur 11A).
- Identificeer het einde van het zygomatische bot door de verticaal gehouden Amerikaanse sonde over deze lijn op de huid te vegen. De ILG overgang treedt op wanneer het beeld van de klier verandert van duidelijk omschreven (hyperechoïsche lijn van het zygomatische bot wordt gezien langs de onderste rand van de klier in het beeld) naar een zonder een herkenbare mediale rand (de zygomatische botecho is niet langer aanwezig, figuur 1).
- Let op de relatieve positie van het handstuk aan de lijn die op de huid wordt getrokken wanneer het Amerikaanse scherm deze verandering laat zien. Dit is de "injectieplaats" waar Con A moet worden gegeven.
- Controle van de diepte van de injectie om Con A plaats in de klier op een punt gewoon mediale aan de zygomatische boog bot.
- Bepaal de diepte van de injectie als volgt: Stel de gewenste diepte van de injectie in als de diepte van het zygomatische bot (hyperechotisch signaal) plus 1 mm. Trek deze waarde af van de bekende lengte van de naald (15 mm in dit voorbeeld).
- Steek de naald in de klier op de "injectieplaats" ~12 mm en trek deze vervolgens langzaam terug totdat de lengte van de blootgestelde naald buiten het lichaam (gemeten met chirurgische remklauwen) gelijk is aan het verschil berekend in 5.8.6 (figuur 12). Injecteer 1000 μg Con A in 0,2 mL.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de capsule van de klier wordt doorboord en niet alleen door de naald wordt geduwd, moet de naald ~ 12 mm of bijna in de naaf worden ingebracht voordat de ontwenning begint. - Herhaal de VS om het succes van de injectie te bevestigen. De ILG moet een karakteristieke hypoechoïsche ruimte vertonen (figuur 1).
OPMERKING: De ILG injectie is de enige die het best getolereerd wordt door de dieren26 en wordt daarom als laatste gedaan.
- Voltooi de hele procedure om alle klieren van beide ogen binnen 10 minuten te injecteren. Dit vereist het bereiken van competentie in de procedure.
OPMERKING: Een enkele set injecties in de 2 orbitale traanklieren zal leiden tot acute DED blijvende 1-2 weken. - Voor DED van langere duur, injecteer Con A precies zoals boven elke 7 dagen. Tot 6 van dergelijke injecties zijn met succes uitgevoerd.
6.
- Controleer na injectie van Con A de dieren in hun beluchtingszakken gedurende ten minste 10-20 minuten of totdat het verdovingseffect is uitgewerkt.
- Laat de dieren niet onbeheerd achter totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben gekregen om de strengheid te behouden. Breng ze niet terug naar hun individuele kooien totdat ze volledig zijn hersteld.
- Na de procedure pijn is meestal mild en duurt minder dan 48 uur. Beoordeel pijn met het konijn grimas schaal. Geef indien nodig een enkele dosis onderhuidse ketorolac (5 mg/kg). Voor meer ernstige pijn, geef onderhuidsbuprenorfine 0,1 mg/kg elke 8 uur.
Representative Results
Con A injecties veroorzaakt een sterke ontstekingsreactie in de traanklieren gekenmerkt door een dichte lymfoïde infiltreren(figuur 13), vergezeld van verminderde scheurproductie. Alle scheurparameters zijn duidelijk gewijzigd(tabel 1 en tabel 2). Bovendien werden scheurlactoferrineniveaus onderdrukt (controle = 3,1±0,45 vs. Con A geïnjecteerd = 2,7±0,02 ng/mg eiwit (gemiddelde ± SEM); p<0,03). Het eindresultaat was een gecompromitteerd hoornvlies en bindvlies epitheel, blijkt uit verhoogde roos Bengaalse vlekken (Figuur 6).
Injectie van de drie orbitale LG weefsels geproduceerd een consistente en uniforme DED-toestand in tegenstelling tot de staten bereikt door eerdere methoden18,27. Belangrijke bijdragen aan dit resultaat waren de door de VS geleide injectie van de ILG en de injectie van de OSLG. Tabel 1 geeft een overzicht van de saillante resultaten van deze methode. Alle veranderingen komen overeen met ernstige DED.
Een enkele set van Con A injecties produceert DED duurt ongeveer 1 week; alle klinische parameters normaliseren per dag 10 (tabel 2). Sequentiële Con A injecties ongeveer 1 week uit elkaar verlengen de duur van DED dienovereenkomstig. Bijvoorbeeld, de tweede set van Con A injecties op dag 7 onderhoudt DED voor 2 weken en ga zo maar door. Na ongeveer 5 sets injecties wordt de DED-toestand vaak permanent zonder verdere injecties.
Toen de konijnen met con A-geïnduceerde DED werden behandeld met het nieuwe middel phosphosulindac, onderdrukte het de ziekte aanzienlijk. Bijvoorbeeld, na een week behandeling met dit middel TBUT aanzienlijk toegenomen in vergelijking met voertuig behandelde dieren (43,6 ± 4,0 vs. 12,2 ± 2,8 s; p<0,001; gemiddelde ± SEM respectievelijk voor deze en volgende waarden), terwijl scheur osmolarity werd genormaliseerd (294 ± 4,6 vs. 311 ± 2,0 mOsm/L, p<0.002). Mechanistisch verlaagde phosphosulindac het niveau van twee cruciale interleukinen, IL-1β (8,4±1,2 vs 21,2±6,6 pg/mg eiwit; p<0,03) en IL-8 (4,9±1,7 vs. 13,5±5,0 pg/mg eiwit; p<0,05)19.
Figuur 1: Echografie beeld van de inferieure traanklier. Bovenste paneel: De ILG als het beweegt dieper in een baan om te liggen onder de zygomatische boog. De stippellijn vertegenwoordigt de lijn op de huid waarover de Amerikaanse sonde wordt geveegd. Middelste panelen: Als het handstuk over deze lijn wordt geveegd, zoekt de examinator naar verlies van de zygomatische botecho die aanwezig is in het linkerbeeld(pijl)en in rechts verdwijnt. Lagere panelen: Beelden van de ILG genomen voor(links)en na(rechts)injectie van Con A. Ontwikkeling van een grote cystische ruimte binnen de klier bevestigt de juiste levering. Herdrukt met toestemming19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Gasmasker sedatie. Deze foto toont het gasmasker dat korte matige sedatie met isoflurane. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Verwijdering van het nictitating membraan. (A) Injectie van lidocaine/adrenaline. (B) Truncation van het nictitating membraan aan de basis met Westcott schaar. (C) Het oculaire oppervlak gemakkelijker gevisualiseerd na verwijdering van het nictitating membraan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Tear break-up time measurement. (A) Uniforme groene scheurfilm verschijning van het hoornvlies oppervlak onder blauw licht onmiddellijk na toepassing van fluoresceine druppels. (B) Hoornvlies oppervlak dat reeds heeft ondergaan duidelijke break-up blijkt uit meerdere donkere kringen en lineaire strepen in het fluoresceine. Break-up tijd wordt geregistreerd zodra de eerste donkere plek of lijn zich ontwikkelt. De twee lichtblauwe cirkels zijn reflecties van de lichtbron af van het hoornvlies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schirmer's traantest. (A) De juiste plaatsing van de Weck-Cel spons in de onderste fornix om eventuele resterende actuele lidocaine oplossing en basislijn scheuren te verwijderen. Door de achterste rand van de driehoekige spons onder de onderste dekselmarge te plaatsen, kan men een zeer uniforme techniek behouden om het oculaire oppervlak te drogen voorafgaand aan de plaatsing van de traanstrips. (B) Een scheurstrip die op de juiste wijze is geplaatst op de middenstand van het onderste deksel tussen de aardbol en het onderste deksel (palpebral conjunctiva). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Rose Bengal vlekken. Boven: Foto's van het hoornvliesoppervlak. Links: Geen rozenbengaalse vlekken aanwezig is voor de behandeling met Con A. Rechts: Diffuus hoornvlies en conjunctorische kleuring wordt gezien in het bovenste neuskwadrant na injectie (rechtsboven). Lager: Conjunctival impression cytologie van de superieure bulbar conjunctiva. Links: Voor de behandeling zijn tal van bekercellen aanwezig. Rechts: Epitheliale cellen zijn aanwezig, maar bekercellen zijn afwezig na de behandeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Voorbereiding van konijn op concanavalin A injecties. (A) Kleine scharen worden gebruikt om bont te verwijderen, waardoor gemakkelijker visualisatie van oriëntatiepunten om de orbitale superieure traanklier te identificeren. (B) Nair wordt gebruikt om haar te verwijderen dat overblijft na het scheren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Injectie van de palpebraltraanklier. (A) De palpebral traanklier, die als bolige verhoging in het achterste tijdelijke gedeelte van het hogere deksel verschijnt. Tranen worden gezien streaming van het oppervlak van deze klier na het aanbrengen van een daling van 2% fluoresceine. (B) De palpebraltraanklier wordt geïnjecteerd terwijl het konijn een matige sedatie krijgt. Een onderzoeker trekt het ooglid in, optimaliseert de blootstelling van de klier en beveiligt het masker terwijl de tweede onderzoeker de klier injecteert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Lokalisatie van de orbitale superieure traanklier. Veranderingen in de huidcontouren geven de locatie van de OSLG aan terwijl deze door de achterste incisure uitsteekt. Afwisselende mediale druk op de aardbol(grote pijl)zorgt ervoor dat de superieure orbitale klier te verzakking, die wordt gezien als een kleine verhoging in de huid. Deze verhoging zal toenemen in omvang elke keer dat de druk wordt toegepast(kleine pijlen). De locatie van deze klier is meestal in lijn met de achterste orbitale velg. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: Injectie van de orbitale superieure traanklier. (A) Toepassing van zachte druk op de schedel met fijngetande tangen in het gebied dat is verzakt als in figuur 9. Een dunne spleet-achtige opening in de schedel kan worden gepalpeerd. Het verlaten van een kleine inkeping merk met de tang sterk helpt plaatsing van de naald tijdens de injectie. (B) De naald wordt loodrecht door de incisure ingebracht. Indien verkeerd geplaatst, wordt de passage gestopt door de benige schedel. (C) De naald bevindt zich in de eindpositie schuin naar de laterale canthus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 11: Lokalisatie van de inferieure traanklier. (A) De prominentie van het oppervlakkige gedeelte van de ILG gezien door het onderste deksel. Het kromlijnige penmerk geeft de onderste positie van de klier aan. De verticale lijn, onder de nasale limbus, duidt op de geschatte positie waar de ILG overgaat naar een diepere positie binnen de baan en dient als een visuele referentie voor de VS. (B) stuks vegen in de VS over het gebied van de verticale lijn; de Amerikaanse monitor zal laten zien waar het zygomatische bot eindigt, waar de ILG overgangen en waar de Con A-injectie moet worden gegeven ("injectieplaats"). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 12: Injectie van de inferieure traanklier. Injectie van de ILG wordt gedaan op de locatie geïdentificeerd door de VS. De diepte van de injectie wordt berekend zoals beschreven in de tekst (stap 5.8.6). Remklauwen (gezien achter de naald) zorgen ervoor dat de naald voor de injectie op de juiste diepte wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 13: Histologie van de traanklieren. Weefselsecties van een normale inferieure traanklier met typische tubulo-alveolar structuur (A) en na injectie van Con A (B), met duidelijke lymfoïde infiltreren met effacement van structuur. Soortgelijke ontstekingsinfiltreert worden gezien in de superieure traanklieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Injectiemethode | TBUT, sec | Scheur Osmolaliteit, Osm/L | STT, mm | |||
| Basislijn | Nainjectie | Basislijn | Nainjectie | Basislijn | Nainjectie | |
| gemiddelde ± SEM, % verandering | ||||||
| ILG zonder Amerikaanse begeleiding | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,8 | 15,2 ± 0,9 | 12,9 ± 2,2 |
| %wijziging | -23% | 1% | -15% | |||
| p=0,05 | p=0,36 | p=0,21 | ||||
| Us-geleide ILG + PSLG | 59,4 ± 0,6 | 11,4 ± 4,2 | 296 ± 4,7 | 326 ± 3,7 | 15,1 ± 1,3 | 10,7 ± 1,8 |
| % verandering | -81% | 10% | -29% | |||
| p<0,0001 | p<0,0001 | p<0,03 | ||||
| US-guided ILG + PSLG + OSLG | 60 ± 0,0 | 6,2 ± 1,3 | 299 ± 2,9 | 309 ± 2,8 | 14,6 ± 0,9 | 9,9 ± 1,3 |
| % verandering | -90% | 3% | -32% | |||
| p<0,0001 | p<0,008 | p<0,002 | ||||
| Alle waarden werden gemeten op dag 6 na een enkele injectie van Con A in de genoemde klieren. Alle vergelijkingen werden gemaakt met baseline. * ILG, inferieure traanklier; PSLG, palpebral gedeelte van superieure traanklier; OSLG, orbitale gedeelte van superieure traanklier; VS, echografie. | ||||||
Tabel 1: Effect van injectietechniek en aantal injectieplaatsen op de ernst van de droge ogen.
| Basislijn | Dag 6 | Dag 13 | Dag 21 | |
| 1 injectie | 2 injecties | 3 injecties | ||
| TBUT, sec | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 29,2 ± 7,8 | 12,8 ± 3,9 |
| % verandering | -24% | -50% | -78% | |
| p=0,17 | p=0,001 | p<0,0001 | ||
| TOsm, Osm/L | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,9 | 308 ± 4,9 | 313 ± 2,7 |
| % verandering | 1% | 4% | 5% | |
| p=0,36 | p=0,04 | p=0,003 | ||
| STT, mm | 15,2 ± 0,9 | 9,3 ± 1,6 | 12,9 ± 1,6 | 7,4 ± 1,1 |
| % verandering | -39% | -15% | -51% | |
| p=0,17 | p=0,13 | p=0,008 | ||
| Er werden vergelijkingen gemaakt met de basislijn. | ||||
Tabel 2: Effect van herhaalde Con A-injecties in ILG op duur van DED.
Discussion
Konijnen zijn zeer aantrekkelijk voor de studie van DED. Hun hoornvlies en bindvlies hebben een oppervlakte dichter bij die van mensen in vergelijking met muizen en ratten; hun aanvulling van drug metaboliserende enzymen zoals esterases, en histologie van hun traanklieren zijn vergelijkbaar met die van de mens, en hun ogen zijn groot genoeg voor informatieve farmacokinetische studies. Vergeleken met varkens en apen, waarmee ze dezelfde kenmerken delen, kosten ze minder en is hun experimentele manipulatie gemakkelijker. Als mechanistische studies worden overwogen, is een relatief nadeel van het konijn, in vergelijking met muizen, dat er minder reagentia (bijvoorbeeld monoklonale antilichamen) beschikbaar zijn. Aan de andere kant, het konijn is veel beter dan muizen voor farmacokinetische en biodistributie studies, omdat individuele weefsels zijn gemakkelijk ontleed en van voldoende grootte voor analytisch werk, het vermijden van "monster pooling."
Een kritische algemene parameter is de acclimatisatieperiode van de konijnen. De dieren worden verzonden van de verkoper onder omstandigheden die vaak niet zorgen voor een transport omgeving van de juiste temperatuur of vochtigheid. Sommige dieren hebben bij aankomst al een droog oog ontwikkeld. Een periode van twee weken van acclimatisatie wordt aanbevolen. Even belangrijk is nauwgezette aandacht voor de vochtigheid en temperatuur van de ruimte waar de studiekonijnen in het vivarium zijn ondergebracht. Afwijkingen in beide toestanden kunnen leiden tot enorme variaties in hun oogstatus. Hebben back-up bevochtigers en ontvochtigers bij de hand. Als het centrale systeem uitvalt, moet u snel reageren om de luchtvochtigheid te herstellen met behulp van de back-upapparatuur. Houd er rekening mee dat dergelijke ongelukkige ontwikkelingen vaker voorkomen in de zomermaanden. De drie meest kritieke stappen, echter, voor het succesvol induceren van DED bij konijnen zijn: 1) het bekwame gebruik van de Amerikaanse beeldvorming om de ILG te identificeren en te sturen en te bevestigen injectie van Con A; 2) het waarborgen van de injectie van zowel de ILG als de twee delen van de SLG; en 3) betrouwbaar en reproducibly het weggeven van de parameters van DED.
Het ontwikkelen van de vereiste experimentele vaardigheid is niet triviaal, maar mag geen serieuze onderzoeker afschrikken. Verwacht dat de leercurve binnen vijf iteraties wordt voltooid. Een Amerikaanse beeldvormingssysteem van redelijke kwaliteit is essentieel. Erkenning van anatomische kenmerken door de VS is belangrijk, daarom moet de onderzoeker de anatomie van het konijn herzien. De uitstekende beschrijving van konijn anatomie door Davis25, een klassieker, kan enorm nuttig zijn. Houd ook rekening met de variatie in de grootte van de ILG. Het gevolg hiervan is dat het succes van Con A altijd bevestigd moet worden met follow-up beeldvorming. Variaties in de reactie op Con A in een groep konijnen is meestal te wijten aan de injectietechniek (mislukte of gedeeltelijk succesvolle injectie) of aan het negeren van de capaciteit van resterende traanklierweefsels om te compenseren met overproductie van tranen. Voor degenen die de injectietechniek onder de knie willen krijgen, kan het injecteren van methyleenblauw, gevolgd door een snelle anatomische dissectie, nuttig zijn; visualisatie wordt bereikt als het de traanklier bereikt of op naburige weefsels morst. Tot op heden is deze injectiemethode meer dan 270 keer uitgevoerd door de auteurs zonder een enkele complicatie.
Het zeggen van de vijf parameters van DED hierboven gepresenteerd kan net zo lastig als hun bepaling in de klinische praktijk. Hoewel circadiane variaties nog niet formeel zijn gedocumenteerd in een van hen, is er genoeg achtergrondbewijs van dergelijke verschijnselen in het oog28 dat ze moeten worden geassuleren op hetzelfde tijdstip van de dag (± 1 h), vooral wanneer herhaalde testen moeten worden uitgevoerd en vergeleken met elkaar. Consistentie bij het uitvoeren van deze tests is essentieel. Een team van twee is vereist. Vier of meer onderzoekers in dezelfde kamer die deelnemen aan de testen kunnen storend zijn, gezien het feit dat sommige stappen vereisen strikte timing. Passende en hoogwaardige fotografische documentatie, waar aangegeven, is belangrijk.
Dit model is bij uitstek geschikt voor medicijnontwikkelingsstudies. Beheersing van het diermodel en testtechnieken zorgden voor een uitstekende reproduceerbaarheid19 van werkzaamheids- en veiligheidsstudies.
Dit is een krachtige experimentele benadering omdat het de verwarrende variabiliteit van eerdere modellen elimineert, het diermodel heeft gestroomlijnd en in wezen gestandaardiseerd is door de vijf parameters van DED te gebruiken. De succesvolle toepassing van dit model op de studie van een kandidaat therapeutisch middel heeft zijn praktisch nut als informatief dierlijk model voor een ziekte bevestigd die dringend nieuwe agenten en van een dieper begrip van zijn pathogenese nodig heeft.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen, behalve voor BR die een eigen vermogen positie in Medicon Pharmaceuticals, Inc en Apis Therapeutics, LLC; en LH, een werknemer van Medicon Pharmaceuticals, Inc. met een aandelenpositie in Apis Therapeutics, LLC.
Acknowledgments
Alle dierstudies werden afgerond in overeenstemming met alle relevante wettelijke en institutionele richtlijnen. Alle studies werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van De Universiteit van De Beek van Steensteen en uitgevoerd overeenkomstig de Verklaring ARVO voor het Gebruik van Dieren in Oogheelkundig en VisieOnderzoek.
Deze studies werden gedeeltelijk ondersteund door een Targeted Research Opportunities subsidie van de Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) en een onderzoekssubsidie van Medicon Pharmaceuticals, Inc, Setauket, NY. De auteurs bedanken Michele McTernan voor redactionele steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
| 26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| 27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
| Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
| Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
| Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
| Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
| DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
| fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
| Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
| Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
| lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
| macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
| Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
| PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
| Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
| Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
| Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
| TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
| Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |
References
- Paulsen, A. J., et al. Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life. American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).
- Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort. British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).
- Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore. Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II Report Executive Summary. The Ocular Surface. 15 (4), 802-812 (2017).
- Baudouin, C., et al. Clinical impact of inflammation in dry eye disease: proceedings of the ODISSEY group meeting. Acta Ophthalmologica (Copenhagen). 96 (2), 111-119 (2018).
- Calonge, M., et al. Dry eye disease as an inflammatory disorder. Ocular Immunology and Inflammation. 18 (4), 244-253 (2010).
- Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124 (11S), S4-S13 (2017).
- Buckley, R. J. Assessment and management of dry eye disease. Eye (London, England). 32 (2), 200-203 (2018).
- Clayton, J. A. Dry Eye. New England Journal of Medicine. 378 (23), 2212-2223 (2018).
- Barabino, S. Animal models of dry eye. Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología. 80 (12), 695-696 (2005).
- Stern, M. E., Pflugfelder, S. C. What We Have Learned From Animal Models of Dry Eye. International Ophthalmology Clinics. 57 (2), 109-118 (2017).
- Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30 (9), 1024-1029 (2011).
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).
- Guo, Z., et al. Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits. Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).
- Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).
- Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).
- Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice. Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).
- Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).
- Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease. Translational Research. 198, 58-72 (2018).
- Huang, L., et al. The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats. British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).
- Mattheolabakis, G., et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats. Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).
- Osmalek, T., Froelich, A., Tasarek, S. Application of gellan gum in pharmacy and medicine. International Journal of Pharmaceutics. 466 (1-2), 328-340 (2014).
- Lemp, M. A. Report of the National Eye Institute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. Contact Lens Association of Ophthalmologists Journal. 21 (4), 221-232 (1995).
- Dal Piaz, F., Braca, A., Belisario, M. A., De Tommasi, N. Thioredoxin system modulation by plant and fungal secondary metabolites. Current Medicinal Chemistry. 17 (5), 479-494 (2010).
- Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, 402-441 (1929).
- Lima, L., Lange, R. R., Turner-Giannico, A., Montiani-Ferreira, F. Evaluation of standardized endodontic paper point tear test in New Zealand white rabbits and comparison between corneal sensitivity followed tear tests. Veterinary Ophthalmology. 18 (Suppl 1), 119-124 (2015).
- Zheng, W., et al. Therapeutic efficacy of fibroblast growth factor 10 in a rabbit model of dry eye. Mol Med Report. 12 (5), 7344-7350 (2015).
- Wiechmann, A. F., Summers, J. A. Circadian rhythms in the eye: the physiological significance of melatonin receptors in ocular tissues. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (2), 137-160 (2008).
