Denne artikel beskriver udviklingen af en metode til at fremkalde akut eller kronisk tør øjensygdom hos kaniner ved at injicere concanavalin A til alle dele af orbital lacrimal kirtel system. Denne metode, overlegen i forhold til dem, der allerede er rapporteret, genererer en reproducerbar, stabil model af tørre øjne egnet til studiet af farmakologiske midler.
Tør øjensygdom (DED), en multifaktoriel inflammatorisk sygdom i okulær overflade, påvirker 1 ud af 6 mennesker verden over med svimlende konsekvenser for livskvalitet og udgifter til sundhedspleje. Manglen på informative dyremodeller, der opsummerer de vigtigste funktioner, hindrer søgningen efter nye terapeutiske midler til DED. Tilgængelige DED dyremodeller har begrænset reproducerbarhed og effekt. En model præsenteres her, hvor DED er induceret ved at injicere mitogen concanavalin A (Con A) i orbital lacrimal kirtler af kaniner. Innovative aspekter af denne model er brugen af ultralyd (US) vejledning for at sikre optimal og reproducerbar injektion af Con A i ringere lacrimal kirtel; injektion af Con A i alle orbital lacrimal kirtler, der begrænser kompenserende produktion af tårer; og brug af periodiske gentagne injektioner af Con A, der forlænger tilstanden af DED efter behag. DED og dets reaktion på teststoffer overvåges med et panel af parametre, der vurderer tåreproduktion, stabiliteten af tårefilmen og hornhindens og konjunktivalslimhindens status. De omfatter tåre osmolarity, tåre break-up tid, Schirmer’s tåre test, rose bengal farvning, og tåre lactoferrin niveauer. Induktionen af DED og overvågningen af dets parametre er beskrevet i detaljer. Denne model er enkel, robust, reproducerbar og informativ. Denne dyremodel er velegnet til undersøgelse af tårefysiologi og af DED’s patofysiologi samt til vurdering af kandidatlandenes effektivitet og sikkerhed til behandling af DED.
Tør øjensygdom (DED) er en kronisk tilstand med høj prævalens og sygelighed1,2,3,4. Inflammation spiller en central rolle i sin patogenese5,6. DeD’s patosysiologi er begrebsbaseret som følge af enten underproduktion eller overfordampning af tårer; førstnævnte er også kendt som vandig-mangelfuld DED7. Sjögrens syndrom, en grundigt undersøgt prototypisk årsag til DED, påvirker primært de lacrimal kirtler (LGs) og er et slående eksempel på deres betydning i PAtogenese af DED. DED behandles ofte med kunstige tårer, som giver midlertidig lindring, eller med cyclosporin eller lifitegrast, som begge undertrykker okulær inflammation. Ingen af de tilgængelige behandlinger for DED er optimale, hvilket nødvendiggør udviklingen af nye agenter8,9.
Jagten på nye terapeutiske midler til DED hæmmes af tre store udfordringer: manglen på et anerkendt lægemiddelbaseret molekylært mål, som kan være undvigende i betragtning af des onfysiologiske kompleksitet; den sparsomme lige så mange lovende agenser og manglen på dyremodeller, der opsummerer centrale funktioner i DED.
Som med de fleste lægemiddeludvikling indsats, informative dyremodeller af DED er et afgørende efterforskningsredskab, på trods af den aksiomatiske erklæring om, at ingen dyremodel helt opsummerer en menneskelig sygdom. Mus, rotte, og kanin modeller af DED er de mest almindeligt anvendte, mens hunde og primater anvendes sjældent10,11. De fleste af de mere end 12 kanin DED modeller rapporteret til dato forsøg på at reducere tåre produktionen ved enten at fjerne LP’er eller ved at hindre deres funktion12,13,14,15,16. Sådanne tilgange omfatter kirurgisk resektion af ILG; lukning af sin ekskretionskanal og forringet LG-funktion ved bestråling eller injektion af et af følgende: aktiverede lymfocytter, mitogener, botulinumtoksin, atropin eller benzalklonium. Større begrænsninger af disse metoder er deres inkonsekvens og den hyppige delvise undertrykkelse af riveproduktionen.
Concanavalin A (Con A), en lectin af vegetabilsk oprindelse, er en potent stimulator T-celle delmængder og har været anvendt i eksperimentelle modeller af hepatitis17 og DED18. Den oprindelige Con A-baserede model blev rapporteret til at tilbyde betydelige fordele, herunder dens relative enkelhed; inflammatorisk celletilstrømning i LP’erne, efterligne sygdomme som Sjögrens; stimulering af de proinflammatoriske cytokiner IL-1β, IL-8 og TGF-β1; reduceret tårefunktion, der overvåges ved måling af tårefluoresceinrydning og brudpå tanderne (TBUT) og lægemiddelreaktion vist for en anti-inflammatorisk kortikosteroid.
Da denne lovende metode blev anvendt, blev der ud over dens fordele konstateret begrænsninger, som nødvendiggjorde dens overordnede revision og drastiske forbedringer. Tre kritiske mangler ved metoden er dokumenteret. For det første var modellen akut. den inducerede DED aftaget efter ca. 1 uge. For det andet var dyrenes reaktion inkonsekvent. Som påvist, i “blinde” transkutane injektioner til ringere LG (ILG), Con A blev leveret kun tilfældigt til den målrettede kirtel. Detaljeret undersøgelse af Anatomi i ILG viste, at dens størrelse kan variere så meget som 4-fold19 gør sådanne injektioner “hit-or-miss” indsats. Endelig, selv når ILG blev injiceret, den overlegne LG (SLG) ofte kompenseret for den reducerede tåre flow, hvilket gør modellen problematisk.
Disse centrale begrænsninger blev overvundet ved at indføre tre ændringer af metoden, genererer en overlegen dyremodel af DED. For det første blev injektionen af Con A i ILG udført under ultralydsvejledning (US), hvilket sikrede, at Con A kom ind i kirtlen. Injektionens succes blev bekræftet ved at opnå et amerikansk billede efter injektionen, som vist i figur 1. For det andet, for at fjerne den kompenserende tåre bidrag SLG, både palpebraal og orbital dele af denne kirtel blev injiceret med Con A. Endelig, denne akutte model af DED blev konverteret til en kronisk ved gentagne injektioner af Con A hver 7-10 dage. DeD af 2 måneders varighed er let opnås hos disse kaniner. Denne fremgangsmådes succes er blevet dokumenteret i det store oghele 19.
Som allerede nævnt er en vigtig anvendelse af dyremodeller af DED at bestemme effekten og sikkerheden af kandidatterapeutiske midler. Nytten af denne model blev demonstreret ved studiet af fosforsulindac (OXT-328), en ny anti-inflammatorisk lille molekyle20,21 administreres som øjendråber. Dens effektivitet blev påvist baseret på et panel af parametre for DED19. Den relative enkelhed og informative karakter af denne model også tilladt side-by-side sammenligning af fosforaninertil de to FDA godkendte lægemidler til DED, cyclosporin og lifitegrast, viser sin stærke prækliniske overlegenhed.
Kaniner er meget attraktive for studiet af DED. Deres hornhinde og bindehinde har et overfladeareal tættere på mennesker i forhold til mus og rotter; deres supplement af narkotika metaboliserende enzymer såsom esteraser, og histologi af deres lacrimal kirtler svarer til mennesker, og deres øjne er store nok til informative farmakokinetiske undersøgelser. Sammenlignet med svin og aber, som de deler lignende funktioner, koster de mindre, og deres eksperimentelle manipulation er lettere. Hvis mekanistiske undersøgelser overvejes, er en relativ ulempe ved kaninen sammenlignet med mus, at der findes færre reagenser (f.eks. monoklonale antistoffer). På den anden side er kaninen langt bedre end mus til farmakokinetiske undersøgelser og biodistributionundersøgelser, fordi individuelle væv let dissekeres og af tilstrækkelig størrelse til analysearbejde, så man undgår “prøvepooling”.
En kritisk generel parameter er kaninernes akklimatiseringsperiode. Dyrene sendes fra leverandøren under forhold, der ofte ikke sikrer et transportmiljø af passende temperatur eller fugtighed. Nogle dyr har måske allerede udviklet tørre øjne ved ankomsten. En to-ugers periode med akklimatisering anbefales. Lige så vigtigt er nøje opmærksomhed på fugtighed og temperatur i det rum, hvor undersøgelsen kaniner er anbragt i vivarium. Afvigelser i begge forhold kan fremkalde store variationer i deres øjenstatus. Har back-up luftfugtere og affugtere ved hånden. Hvis det centrale system svigter, skal du handle hurtigt for at genoprette den omgivende luftfugtighed ved hjælp af reserveudstyret. Husk på, at en sådan uheldig udvikling er mere almindelig i sommermånederne. De tre mest kritiske skridt, dog for en vellykket overtalelse AFDE hos kaniner er: 1) den dygtige brug af amerikanske billeddannelse til at identificere ILG og til at lede og bekræfte injektion af Con A; 2) sikring af injektion af både ILG og de to dele af SLG og 3) pålideligt og reproducerbart at sige parametrene for DED.
Udvikling af de krævede eksperimentelle færdigheder er ikke trivielt, men bør ikke afskrække nogen seriøs efterforsker. Forvent, at indlæringskurven skal udfyldes inden for fem gentagelser. Et amerikansk billedbehandlingssystem af rimelig kvalitet er afgørende. Anerkendelse af anatomiske kendetegn ved USA er vigtig, derfor bør investigator gennemgå kanin anatomi. Den fremragende beskrivelse af kanin anatomi af Davis25,en klassiker, kan være uhyre nyttigt. Også huske på variationen i størrelsen af ILG. Konsekvensen af dette er, at succesen med Con A altid skal bekræftes med opfølgning billeddannelse. Variationer i reaktionen på Con A i en gruppe af kaniner skyldes oftest injektionsteknikken (mislykket eller delvis vellykket injektion) eller ignorerer kapaciteten af resterende lacrimal kirtelvæv til at kompensere med overproduktion af tårer. For dem, der ønsker at mestre injektion steknik, indsprøjtning methylenblåt efterfulgt af hurtig anatomisk dissektion kan være nyttigt; visualisering opnås, hvis den når den lacrimal kirtel eller spild på tilstødende væv. Til dato, denne injektion metode er blevet udført over 270 gange af forfatterne uden en enkelt komplikation.
At sige de fem parametre for DED præsenteret ovenfor kan være lige så vanskelig som er deres beslutsomhed i klinisk praksis. Selv om døgnrytmevariationer endnu ikke er formelt dokumenteret i nogen af dem, er der nok baggrundsbeviser for sådanne fænomener i øjet28, at de bør assayed på samme tidspunkt af dagen (± 1 time), især når gentagne analyser skal udføres og sammenlignes med hinanden. Konsekvens i udførelsen af disse analyser er afgørende. Der kræves et hold på to. Fire eller flere efterforskere i samme rum, der deltager i assays kan være forstyrrende, da nogle skridt kræver streng timing. Passende fotografisk dokumentation af høj kvalitet, hvor det er angivet, er vigtig.
Denne model er velegnet til lægemiddeludviklingsundersøgelser. Beherskelse af dyremodellen og analyseteknikkerne sikrede fremragende reproducerbarhed19 af effektivitets- og sikkerhedsundersøgelser.
Dette er en kraftfuld eksperimentel tilgang, fordi det eliminerer den forvirrende variabilitet af tidligere modeller, har strømlinet dyremodellen og i det væsentlige standardiseret at sige de fem parametre for DED. Den vellykkede anvendelse af denne model til studiet af en kandidat terapeutisk middel har bekræftet sin praktiske nytte som en informativ dyremodel for en sygdom i desperat behov for nye midler og en dybere forståelse af sin patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Alle dyreforsøg blev afsluttet i overensstemmelse med og overholdelse af alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer. Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board of Stony Brook University og udført i overensstemmelse med ARVO-erklæringen for anvendelse af dyr i oftalmologiske og visionsforskning.
Disse undersøgelser blev delvist støttet af et tilskud til målrettede forskningsmuligheder fra Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) og et forskningstilskud fra Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Forfatterne takker Michele McTernan for redaktionel støtte.
100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |