Denne artikkelen beskriver utviklingen av en metode for å indusere akutt eller kronisk tørr øyesykdom hos kaniner ved å injisere concanavalin A til alle deler av orbital lacrimal kjertelsystemet. Denne metoden, bedre enn de som allerede er rapportert, genererer en reproduserbar, stabil modell av tørt øye egnet for studiet av farmakologiske midler.
Tørrøyesykdom (DED), en multifaktoriell inflammatorisk sykdom i okulær overflate, påvirker 1 av 6 mennesker over hele verden med svimlende implikasjoner for livskvalitet og helsekostnader. Mangelen på informative dyremodeller som rekapitulerer de viktigste funksjonene hindrer søket etter nye terapeutiske midler for DED. Tilgjengelige DED-dyremodeller har begrenset reproduserbarhet og effekt. En modell presenteres her der DED induseres ved å injisere mitogen concanavalin A (Con A) i orbital lacrimal kjertler av kaniner. Innovative aspekter ved denne modellen er bruk av ultralyd (US) veiledning for å sikre optimal og reproduserbar injeksjon av Con A i den dårligere lacrimal kjertelen; injeksjon av Con A i alle orbitallacrimal kjertler som begrenser kompenserende produksjon av tårer; og bruk av periodiske gjentatte injeksjoner av Con A som forlenger tilstanden til DED etter ønske. DED og dens respons på testagenter overvåkes med et panel av parametere som vurderer tåreproduksjon, stabiliteten til tårefilmen og statusen til hornhinnen og konjunktival slimhinnen. De inkluderer tåre osmolaritet, rive break-up tid, Schirmer tåre test, rose bengal farging, og rive laktoferrin nivåer. Induksjon av DED og overvåking av parametrene er beskrevet i detalj. Denne modellen er enkel, robust, reproduserbar og informativ. Denne dyremodellen er egnet for studiet av tårefysiologi og patofysiologi av DED, samt for vurdering av effekt og sikkerhet av kandidatmidler for behandling av DED.
Tørrøyesykdom (DED) er en kronisk tilstand med høy prevalens og sykelighet1,2,3,4. Betennelse spiller en nøkkelrolle i sin patogenesen5,6. Deds patofysiologi er konseptualisert som stammer fra enten underproduksjon eller overfordampning av tårer; den tidligere er også kjent som vandig-mangelfull DED7. Sjögrens syndrom, en omfattende studert prototypisk årsak til DED, påvirker først og fremst lacrimal kjertlene (LGs) og er et slående eksempel på deres betydning i deds patogenesen. DED behandles ofte med kunstige tårer som gir midlertidig lindring, eller med ciklosporin eller lifitegrast, som begge undertrykker okulær betennelse. Ingen av de tilgjengelige behandlingene for DED er optimale, noe som krever utvikling av nye midler8,9.
Søket etter nye terapeutiske midler for DED er hemmet av tre store utfordringer: mangelen på et anerkjent druggable molekylært mål, som kan være unnvikende gitt deds patofysiologiske kompleksiteten; sparsomheten til lovende midler; og mangelen på dyremodeller som rekapitulerer viktige funksjoner i DED.
Som med de fleste narkotikautviklingstiltak er informative dyremodeller av DED et avgjørende undersøkende verktøy, til tross for den aksiomatiske uttalelsen om at ingen dyremodell fullstendig rekapitulerer en menneskelig sykdom. Mus, rotte og kaninmodeller av DED er de mest brukte mens hunder og primater brukes sjelden10,11. De fleste av de mer enn 12 kanin DED-modellene rapportert til dags dato forsøkpå å redusere rive produksjonen ved enten å fjerne LGs eller ved å hindre deres funksjon12,13,14,15,16. Slike tilnærminger inkluderer kirurgisk reseksjon av ILG; nedleggelse av sin ekskresitoriske kanal; og svekkelse LG funksjon ved bestråling eller injeksjon av ett av følgende: aktivertlymfocytter, mitogener, botulinumtoksin, atropin, eller benzalklonium. Store begrensninger av disse metodene er deres inkonsekvens og hyppig delvis undertrykkelse av tåreproduksjon.
Concanavalin A (Con A), en lectin av planteopprinnelse, er en potent stimulator T-celle undergrupper og har blitt brukt i eksperimentelle modeller av hepatitt17 og DED18. Den opprinnelige Con A-baserte modellen ble rapportert å tilby betydelige fordeler, inkludert denrelative enkelheten; inflammatorisk celletilstrømning i LGs, etterligne sykdommer som Sjøgrens; stimulering av proinflammatoriske cytokiner IL-1β, IL-8, og TGF-β1; redusert rivefunksjon overvåket ved å måle rivefluoresceinclearance og rive break-up tid (TBUT); og legemiddelrespons vist for et antiinflammatorisk kortikosteroid.
Når denne lovende metoden ble brukt, i tillegg til fordelene, ble begrensninger identifisert som nødvendiggjorde sin generelle revisjon og drastiske forbedringer. Tre kritiske mangler i metoden er dokumentert. For det første var modellen en akutt en; den induserte DED avtok etter ca 1 uke. For det andre var responsen fra dyrene inkonsekvent. Som demonstrert, i “blinde” transkutane injeksjoner til Inferior LG (ILG), ble Con A levert bare tilfeldig til den målrettede kjertelen. Detaljert studie av anatomien til ILG viste at størrelsen kunne variere så mye som 4 ganger19 gjør slike injeksjoner “hit-or-miss” innsats. Til slutt, selv når ILG ble injisert, kompenserte den overlegne LG (SLG) ofte for den reduserte tårestrømmen, noe som gjør modellen problematisk.
Disse viktige begrensningene ble overvunnet ved å innføre tre modifikasjoner på metoden, og genererer en overlegen dyremodell av DED. Først ble injeksjonen av Con A i ILG utført under ultralyd (US) veiledning, noe som sikrer at Con A kom inn i kjertelen. Suksessen til injeksjonen ble bekreftet ved å få et post-injeksjon amerikansk bilde, som vist i figur 1. For det andre, for å fjerne kompenserende tårebidrag fra SLG, ble både palpebrale og orbitale deler av denne kjertelen injisert med Con A. Til slutt ble denne akutte modellen av DED konvertert til en kronisk en ved gjentatte injeksjoner av Con A hver 7-10 dager. DED av 2 måneders varighet oppnås lett hos disse kaninene. Suksessen til denne tilnærmingen har blitt rikelig dokumentert19.
Som allerede nevnt, er en viktig anvendelse av dyremodeller av DED å bestemme effekten og sikkerheten til kandidatens terapeutiske midler. Nytten av denne modellen ble demonstrert ved studiet av fosfosulindac (OXT-328), et nytt antiinflammatorisk lite molekyl20,21 administrert som øyedråper. Effekten ble vist basert på et panel av parametere av DED19. Den relative enkelheten og informative karakteren til denne modellen tillot også side-ved-side sammenligning av fosforsulindac til de to FDA godkjente legemidler for DED, ciklosporin og lifitegrast, som viser sin sterke preklinisk overlegenhet.
Kaniner er svært attraktive for studiet av DED. Deres hornhinnen og konjunktivut har et overflateareal nærmere mennesker sammenlignet med mus og rotter; deres komplement av narkotika metaboliserende enzymer som esterases, og histologi av deres lacrimal kjertler ligner på mennesker, og deres øyne er store nok for informative farmakokinetiske studier. Sammenlignet med griser og aper, som de deler lignende funksjoner, koster de mindre og deres eksperimentelle manipulasjon er enklere. Hvis mekanistiske studier vurderes, er en relativ ulempe av kaninen, sammenlignet med mus, at færre reagenser (f.eks monoklonale antistoffer) er tilgjengelige. På den annen side er kaninen langt bedre enn mus for farmakokinetiske og biodistribusjonsstudier fordi enkelt dissekert og av tilstrekkelig størrelse for analytisk arbeid, unngår “prøvepooling”.
En kritisk generell parameter er akklimatiseringsperioden til kaninene. Dyrene sendes fra leverandøren under forhold som ofte ikke sikrer et transportmiljø av riktig temperatur eller fuktighet. Noen dyr kan allerede ha utviklet tørre øyne ved ankomst. En to ukers periode med akklimatisering anbefales. Like viktig er samvittighetsfull oppmerksomhet til fuktighet og temperatur i rommet der studien kaniner er plassert i vivarium. Avvik i begge tilstandene kan indusere store variasjoner i øyestatus. Ha back-up luftfuktere og avfuktere på hånden. Hvis sentralsystemet mislykkes, handle raskt for å gjenopprette omgivelsesfuktighet ved hjelp av sikkerhetskopieringsutstyret. Husk at slike uheldige utviklinger er mer vanlig i sommermånedene. De tre mest kritiske trinnene, men for vellykket indusere DED hos kaniner er: 1) dyktig bruk av amerikansk avbildning for å identifisere ILG og å lede og bekrefte injeksjon av Con A; 2) sikre injeksjon av både ILG og de to delene av SLG; og 3) pålitelig og reproduserbart å si parametrene for DED.
Å utvikle den nødvendige eksperimentelle ferdigheten er ikke trivielt, men bør ikke avskrekke noen seriøs etterforsker. Forvent at læringskurven skal fullføres innen fem gjentakelser. Et amerikansk bildesystem av rimelig kvalitet er avgjørende. Anerkjennelse av anatomiske kjennetegn fra OSS er viktig, derfor bør etterforskeren gjennomgå kaninanatomien. Den utmerkede beskrivelsen av kaninanatomi av Davis25, en klassiker, kan være utrolig nyttig. Husk også variasjonen i størrelsen på ILG. Det er at suksessen til Con A alltid må bekreftes med oppfølgingsavbildning. Variasjoner i responsen på Con A i en gruppe kaniner skyldes oftest injeksjonsteknikken (mislykket eller delvis vellykket injeksjon) eller å ignorere kapasiteten til gjenværende lacrimal kjertelvev for å kompensere med overproduksjon av tårer. For de som ønsker å mestre injeksjonsteknikken, kan det være nyttig å injisere metylenblå etterfulgt av rask anatomisk disseksjon; visualisering oppnås hvis den når lacrimal kjertelen eller søler på nærliggende vev. Hittil har denne injeksjonsmetoden blitt utført over 270 ganger av forfatterne uten en eneste komplikasjon.
Å si de fem parametrene for DED presentert ovenfor kan være like vanskelig som er deres besluttsomhet i klinisk praksis. Selv om circadian variasjoner ennå ikke er formelt dokumentert i noen av dem, er det nok bakgrunnsbevis på slike fenomener i øyet28 at de skal assayed på samme tid på dagen (± 1 h), spesielt når gjentatte analyser skal utføres og sammenlignet med hverandre. Konsistens i å utføre disse analyser er viktig. Et team på to er nødvendig. Fire eller flere etterforskere i samme rom som deltar i analyser kan være forstyrrende, gitt at noen tiltak krever streng timing. Passende fotografisk dokumentasjon av høy kvalitet, der det er angitt, er viktig.
Denne modellen er ideelt egnet for narkotikautviklingsstudier. Mestring av dyremodellen og analyseteknikkene sikret utmerket reproduserbarhet19 av effekt- og sikkerhetsstudier.
Dette er en kraftig eksperimentell tilnærming fordi det eliminerer forvirrende variasjon av tidligere modeller, har strømlinjeformet dyremodellen og i hovedsak standardisert som sier de fem parametrene til DED. Den vellykkede anvendelsen av denne modellen til studiet av en kandidat terapeutisk middel har bekreftet sin praktiske nytte som en informativ dyremodell for en sykdom i desperat behov for nye agenter og av en dypere forståelse av sin patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Alle dyrestudier ble fullført i samsvar og samsvar med alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer. Alle studier ble godkjent av Institutional Review Board of Stony Brook University og utført i samsvar med ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
Disse studiene ble delvis støttet av en Målrettet Forskningsmuligheter stipend fra Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) og et forskningsstipend fra Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Forfatterne takker Michele McTernan for redaksjonell støtte.
100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |