Summary
Denne artikkelen beskriver utviklingen av en metode for å indusere akutt eller kronisk tørr øyesykdom hos kaniner ved å injisere concanavalin A til alle deler av orbital lacrimal kjertelsystemet. Denne metoden, bedre enn de som allerede er rapportert, genererer en reproduserbar, stabil modell av tørt øye egnet for studiet av farmakologiske midler.
Abstract
Tørrøyesykdom (DED), en multifaktoriell inflammatorisk sykdom i okulær overflate, påvirker 1 av 6 mennesker over hele verden med svimlende implikasjoner for livskvalitet og helsekostnader. Mangelen på informative dyremodeller som rekapitulerer de viktigste funksjonene hindrer søket etter nye terapeutiske midler for DED. Tilgjengelige DED-dyremodeller har begrenset reproduserbarhet og effekt. En modell presenteres her der DED induseres ved å injisere mitogen concanavalin A (Con A) i orbital lacrimal kjertler av kaniner. Innovative aspekter ved denne modellen er bruk av ultralyd (US) veiledning for å sikre optimal og reproduserbar injeksjon av Con A i den dårligere lacrimal kjertelen; injeksjon av Con A i alle orbitallacrimal kjertler som begrenser kompenserende produksjon av tårer; og bruk av periodiske gjentatte injeksjoner av Con A som forlenger tilstanden til DED etter ønske. DED og dens respons på testagenter overvåkes med et panel av parametere som vurderer tåreproduksjon, stabiliteten til tårefilmen og statusen til hornhinnen og konjunktival slimhinnen. De inkluderer tåre osmolaritet, rive break-up tid, Schirmer tåre test, rose bengal farging, og rive laktoferrin nivåer. Induksjon av DED og overvåking av parametrene er beskrevet i detalj. Denne modellen er enkel, robust, reproduserbar og informativ. Denne dyremodellen er egnet for studiet av tårefysiologi og patofysiologi av DED, samt for vurdering av effekt og sikkerhet av kandidatmidler for behandling av DED.
Introduction
Tørrøyesykdom (DED) er en kronisk tilstand med høy prevalens og sykelighet1,2,3,4. Betennelse spiller en nøkkelrolle i sin patogenesen5,6. Deds patofysiologi er konseptualisert som stammer fra enten underproduksjon eller overfordampning av tårer; den tidligere er også kjent som vandig-mangelfull DED7. Sjögrens syndrom, en omfattende studert prototypisk årsak til DED, påvirker først og fremst lacrimal kjertlene (LGs) og er et slående eksempel på deres betydning i deds patogenesen. DED behandles ofte med kunstige tårer som gir midlertidig lindring, eller med ciklosporin eller lifitegrast, som begge undertrykker okulær betennelse. Ingen av de tilgjengelige behandlingene for DED er optimale, noe som krever utvikling av nye midler8,9.
Søket etter nye terapeutiske midler for DED er hemmet av tre store utfordringer: mangelen på et anerkjent druggable molekylært mål, som kan være unnvikende gitt deds patofysiologiske kompleksiteten; sparsomheten til lovende midler; og mangelen på dyremodeller som rekapitulerer viktige funksjoner i DED.
Som med de fleste narkotikautviklingstiltak er informative dyremodeller av DED et avgjørende undersøkende verktøy, til tross for den aksiomatiske uttalelsen om at ingen dyremodell fullstendig rekapitulerer en menneskelig sykdom. Mus, rotte og kaninmodeller av DED er de mest brukte mens hunder og primater brukes sjelden10,11. De fleste av de mer enn 12 kanin DED-modellene rapportert til dags dato forsøkpå å redusere rive produksjonen ved enten å fjerne LGs eller ved å hindre deres funksjon12,13,14,15,16. Slike tilnærminger inkluderer kirurgisk reseksjon av ILG; nedleggelse av sin ekskresitoriske kanal; og svekkelse LG funksjon ved bestråling eller injeksjon av ett av følgende: aktivertlymfocytter, mitogener, botulinumtoksin, atropin, eller benzalklonium. Store begrensninger av disse metodene er deres inkonsekvens og hyppig delvis undertrykkelse av tåreproduksjon.
Concanavalin A (Con A), en lectin av planteopprinnelse, er en potent stimulator T-celle undergrupper og har blitt brukt i eksperimentelle modeller av hepatitt17 og DED18. Den opprinnelige Con A-baserte modellen ble rapportert å tilby betydelige fordeler, inkludert denrelative enkelheten; inflammatorisk celletilstrømning i LGs, etterligne sykdommer som Sjøgrens; stimulering av proinflammatoriske cytokiner IL-1β, IL-8, og TGF-β1; redusert rivefunksjon overvåket ved å måle rivefluoresceinclearance og rive break-up tid (TBUT); og legemiddelrespons vist for et antiinflammatorisk kortikosteroid.
Når denne lovende metoden ble brukt, i tillegg til fordelene, ble begrensninger identifisert som nødvendiggjorde sin generelle revisjon og drastiske forbedringer. Tre kritiske mangler i metoden er dokumentert. For det første var modellen en akutt en; den induserte DED avtok etter ca 1 uke. For det andre var responsen fra dyrene inkonsekvent. Som demonstrert, i "blinde" transkutane injeksjoner til Inferior LG (ILG), ble Con A levert bare tilfeldig til den målrettede kjertelen. Detaljert studie av anatomien til ILG viste at størrelsen kunne variere så mye som 4 ganger19 gjør slike injeksjoner "hit-or-miss" innsats. Til slutt, selv når ILG ble injisert, kompenserte den overlegne LG (SLG) ofte for den reduserte tårestrømmen, noe som gjør modellen problematisk.
Disse viktige begrensningene ble overvunnet ved å innføre tre modifikasjoner på metoden, og genererer en overlegen dyremodell av DED. Først ble injeksjonen av Con A i ILG utført under ultralyd (US) veiledning, noe som sikrer at Con A kom inn i kjertelen. Suksessen til injeksjonen ble bekreftet ved å få et post-injeksjon amerikansk bilde, som vist i figur 1. For det andre, for å fjerne kompenserende tårebidrag fra SLG, ble både palpebrale og orbitale deler av denne kjertelen injisert med Con A. Til slutt ble denne akutte modellen av DED konvertert til en kronisk en ved gjentatte injeksjoner av Con A hver 7-10 dager. DED av 2 måneders varighet oppnås lett hos disse kaninene. Suksessen til denne tilnærmingen har blitt rikelig dokumentert19.
Som allerede nevnt, er en viktig anvendelse av dyremodeller av DED å bestemme effekten og sikkerheten til kandidatens terapeutiske midler. Nytten av denne modellen ble demonstrert ved studiet av fosfosulindac (OXT-328), et nytt antiinflammatorisk lite molekyl20,21 administrert som øyedråper. Effekten ble vist basert på et panel av parametere av DED19. Den relative enkelheten og informative karakteren til denne modellen tillot også side-ved-side sammenligning av fosforsulindac til de to FDA godkjente legemidler for DED, ciklosporin og lifitegrast, som viser sin sterke preklinisk overlegenhet.
Protocol
Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Review Board of Stony Brook University og utført i samsvar med ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
1. Dyr og bolig
- Erverve New Zealand White (NZW) kaniner som veier 2-3 kg.
- Hus kaninene i bur med streng temperatur (65 ± 5 °F) og fuktighet (45 ± 5 %) Kontroll. Belysning bør ha en 12 t på / av syklus.
- Gi ubegrenset tilgang til vann og standard kaninchow. Eliminer kosttilskudd berikelser som de kan inneholde vitamin A som påvirker øyet.
- Akklimatiser dyrene i minst 2 uker før baseline tiltak eller induksjon av tørre øyne.
2. Metoder for anestesi og eutanasi
MERK: Alle prosedyrer krever mild sedasjon med unntak av Con A-injeksjon som krever moderat sedasjon.
- For mild sedasjon injiseracepromazine (1 mg/kg) subkutant over skuldrene ved hjelp av en 26-gauge nål. Endepunkt for mild sedasjon: dyr opprettholder en avslappet hodeposisjon med øreflipper ikke lenger helt oppreist.
MERK: Hvis det aktuelle endepunktet ikke er nådd, kan det gis en ekstra injeksjon av acepromazin. Dyr bør alltid være våkne, lydhøre for berøring av sine whiskers, og aldri vise redusert pust. - For moderat sedasjon, først gi dyrene acepromazine som ovenfor. Etter at endepunktet er nådd (se notatet ovenfor), gi isoflurane ved hjelp av en gassmaske med O 2-strømningsatt til 1 L /min og isofluranlevering satt til 5 % (figur 2).
- Administrer isoflurane til kaninens kroppstone er helt avslappet og ørene er helt floppy.
MERK: Ingen kompenserende muskelbevegelser bør oppstå når dyret er slått på siden; pusting forblir alltid spontan. - Spontan gjenoppretting oppstår innen 2-5 min: tegn inkluderer spontane hodebevegelser og økt eller normal muskeltone. Etter at eksperimentell prosedyre er fullført med moderat sedasjon, observere kaninene i ca 30 min eller til deres oppførsel går tilbake til normal.
MERK: Oftalmisk salve er ikke nødvendig under noen form for sedasjon. 1) I mild sedasjon er dyr fortsatt årvåkne og opprettholder en blinkrefleks. Ved moderat sedasjon er hemmingen av blinkrefleksen så kort at okulær overflate ikke er i fare. 2) Plassering av oftalmisk salve på okulær overflate utelukker visualisering av strukturer vurdert under testing. - Eutanasi: Bruk en overdose intravenøs pentobarbital (100 mg/kg).
3. Fjerning av nictitating membran
- Utfør fjerningen i akklimatiseringsperioden (vanligvis den første uken) for å tillate fullstendig og nøyaktig evaluering av hornhinnen.
-
Injeksjon til høyre nictitating membran
MERK: Hvis nictitating membranen i begge øynene skal fjernes, er det enklest å gjøre dette i en økt. Start med ett øye og fortsett som beskrevet. For klarhet i beskrivelsen starter denne metoden med riktig øye.- Plasser kaninen i en passende størrelse behersket pose.
- Infør mild sedasjon som beskrevet i trinn 2.1.
- Påfør 25 μL konserveringsfri lidokain på høyre øye ved hjelp av en mikropipette.
- Plasser et fleksibelt trådlokkspekulum mellom øyelokkene.
- Bruk 0,3 tang (eller tilsvarende) til å ta tak i den nictitating membranen på toppen og utvide den over hornhinnen.
- Injiser lidokain 1 % med 1:100 000 adrenalin subkonjunctivally inn i bunnen av nictitating membranen ved hjelp av en 26-gauge skarp nål (Figur 3A). En moderat bleb bør danne seg over nictitating membranen.
- Fjern spekulumen.
- Utfør en identisk injeksjon til venstre nictitating membran.
-
Kutte nictitating membran
- Etter ca. 5 min, plasser lokket spekulum tilbake i høyre øye. Ta tak i og trekk tilbake den nictitating membranen på toppen ved hjelp av 0,3 tang (eller lignende).
- Skjær av den nictitating membranen ved basen ved hjelp av Westcott saks eller tilsvarende (Figur 3B).
MERK: Blødningen er minimal og krever vanligvis ikke cautery. Likevel holdes et høytemperaturbattericautery alltid i nærheten i tilfelle det er behov for ekstra hemostase. - Fjern spekulumen.
- Plasser aktuell antibiotikasalve på øyet (f.eks. neomycin, polymyxin, bacitracin og hydrokortison).
- La hardere kjertelen være intakt. Harderian kjertelen er noen ganger sett når nictitating membranen trekkes tilbake.
MERK: Hvis en stor hvit masse eller vevshøyde ses i nese- eller overlegen subkonjunctival-regionen etter at nictitating membranen er fjernet, ble membranen resected for nær basen slik at hardere kjertelen til spontant prolaps. For å forhindre dette i etterfølgende prosedyrer, la mer av nictitating membranen på basen. - La okulær overflate helbrede i minst 1 uke før ytterligere manipulasjoner er gjort eller okulære overflateanalyser utføres.
4. Måling av tørre øyne parametere og innsamling av tåreprøver
MERK: Mål DED-parametere basert på studieprotokollbehov (f.eks. ved baseline og angitte tidspunkter deretter). Målinger for DED bør gjøres i følgende rekkefølge, med streng innsats for å trofast gjenskape dem hver gang. Test alle dyr på omtrent samme tid på dagen (± 1 h) for å minimere circadian variasjoner. Disse målingene krever vanligvis et team på to etterforskere.
- Plasser kaninen i en beherskepose. Indusere mild sedasjon.
- Tåre Osmolarity22
- Blink øyelokkene manuelt 5-10 ganger for å fordele tårelaget jevnt på okulær overflate.
- Trekk forsiktig inn det nedre lokket.
- Prøv tårer med TearLab Osmometer i krysset mellom palpebral og bulbar conjunctiva langs nedre fornix, bare bakre til bunnen av den avkortede nictitating membranen.
- Mål osmolaritet ved hjelp av TearLab Osmolarity Test etter produsentens instruksjoner.
- Tåre break-up tid (TBUT)
- Mørkere rommet for denne analysen.
- Plasser et trådlokkspekulum mellom øyelokkene.
- Påfør en 50 μL dråpe på 0,2% fluorescein over hornhinnen overflaten ved hjelp av en mikropipette. Hvis selv fordeling av fluorescein over hornhinnen ikke oppnås med den første dråpen, plasser en andre dråpe.
- Start umiddelbart en timer.
- Følg den pre-hornhinne tårefilm under et blått lys. TBUT er definert som tiden det tar å utvikle svarte prikker, linjer eller åpenbare forstyrrelser i fluoresceinfilmen (Figur 4). Bruk om nødvendig kirurgiske lameller som gir +1,50 forstørrelse for å visualisere tidlige tegn på samlivsbrudd bedre. Monitor i opptil 1 min; hvis break-up som definert her oppstår etter 1 min, rekord TBUT for bare 60 s.
- Schirmer's Tear Test (STT)
- Påfør en 25 μL dråpe konserveringsfri lidokain på okulær overflate.
- Plasser et Weck-cellekirurgisk spyd i dårligere fornix for å absorbere gjenværende lidokain og eventuell tårevæske. Bruk eventuelt nedre øyelokk til å dekke den proksimale enden av svampen for å holde den på plass (figur 5A).
- Etter ca. 30 s, fjern Weck svamp.
- Sett umiddelbart inn en Schirmers tåreteststripe i rommet mellom hornhinnen og palpebral conjunctiva på midten av nedre lokk.
- Start umiddelbart en timer (figur 5B).
- Etter 5 min, mål lengden på den fuktede delen av stripen; dette er STT-verdien.
- Utfør mål i triplicate og rapporter gjennomsnittet av de 3 avlesningene som STT-verdien.
- Innsamling av tåreprøver
- For å samle tåreprøver for å analysere nivåer av ulike analytter i dem som laktoferrin, etter at STT-verdien er registrert ved 5 min, la stripen være på plass til fukting på minst 20 mm er oppnådd.
MERK: Hvis tilstrekkelig fukting ikke oppstår etter at DED er indusert, må du gå dypere frem i nedre fornix for å bidra til å nå dette endepunktet med rimelig tid. - Skjær den fuktede stripen og plasser umiddelbart i 490 μL av kjølt Tear Collection Buffer (4% BSA, 1M NaCl, 0,1% Tween-20 i PBS med proteinase hemmercocktail).
- Hold prøvene på is til de kan lagres ved -80 °C, hvor de skal forbli til de analyseres.
- For å samle tåreprøver for å analysere nivåer av ulike analytter i dem som laktoferrin, etter at STT-verdien er registrert ved 5 min, la stripen være på plass til fukting på minst 20 mm er oppnådd.
- Rose Bengal Farging (RBS)
- Påfør 50 μL 1% konserveringsmiddelfri lidokain på hornhinnen ved hjelp av en mikropipette.
- Etter 30 s, plasser 25 μL av 1% rose bengal på okulær overflate og blinke øyelokket manuelt for å distribuere det jevnt.
- Start umiddelbart en timer.
- Ved 3,5 min plasserer du et trådlokkmellom lokkene.
- Ved 4,0 min, fotografer ei overlegen konjunktivitt og hornhinneoverflate (figur 6).
MERK: Juster til kameratypen som brukes. Typiske innstillinger: digitalt reflekskamera med én linse, blenderprioritetsmodus (blenderåpning 13 eller høyere), ISO 6000, 100 mm makrolinse festet med to 12,5 mm forlengelsesrør, manuell fokusmodus, objektiv ved maksimal forstørrelse og belysning fra makro/ringblits satt til automatisk med gjennomobjektivmodus. Ringblitsens fokuslampe er slått på for å hjelpe til med å fokusere på hornhinnen. - Fullfør alle bilder for begge øynene innen 1 min.
- Skår okulær overflatefarging ved hjelp av NEI-metoden23 endret som følger. Ikke grad 6 separate konjunktivittsoner. Score den overlegne conjunctiva av hvert øye. Dette er den delen av konjunktivittoverflaten lett fotografert uten å manipulere kloden. Manipulering kan arteffaktisk endre farging av okulær overflate.
- Tear laktoferrin nivåer er et surrogatmål på tåreproduksjon fra lacrimal kjertler. Analyse tåre laktoferrin i tårer samlet som ovenfor ved hjelp av en enzym-koblet immunosorbent analyse24 kit etter instruksjonene fra produsenten.
5. Induksjon og behandling av tørre øyne
MERK: Tre deler av det orbitale lacrimalkjertelsystemet injiseres.
- Sedate kaninene med acepromazine 0,2 mg/kg subkutant.
- Skjær av pelsen i periorbital og hodebunnsområdet og fjern helt eventuell gjenværende pels ved hjelp av Nair. La huden være helt glatt for bedre visualisering av de anatomiske kjennetegnene og den USA-guidede injeksjonen av concanavalin A (Figur 7).
- Indusere moderat sedasjon som beskrevet ovenfor.
- Injeksjon av palpebral delen av den overlegne lacrimal kjertel (PSLG)
MERK: Utfør injeksjon av PSLG først.- Påfør på riktig øye 25 μL konserveringsmiddelfri lidokain 1% med en mikropipette.
- Evert øvre øyelokk og påfør mild medial trykk på bakre orbital rim til fremspringet markerer palpebral delen av kjertelen er sett. PSLG fremstår som en liten bulbous høyde i bakre (temporal) del av øvre lokk.
MERK: For å se kjertelvevet under læringsprosessen, bruk 5% fluorescein til området (Figur 8A). Tårer kan sees streaming fra bulbous PSLG. Bruk av fluorescein er ikke nødvendig for administrasjon av Con A; det gjøres bare for illustrasjonsformål for å vise kjertelvevet. - Bruk fintannde tang og en 27-gauge nål på en tuberculin sprøyte, direkte trenge inn i kjertelen ved hjelp av en transkonjunktivitt tilnærming. Før kanylen 2 mm inn i vevet og injiser 500 μg Con A i et volum på 0,1 ml (figur 8B).
MERK: Denne injeksjonen kan noen ganger være smertefull. Om nødvendig, hold dyrene under isoflurane til denne injeksjonen er fullført.
- Injeksjon av orbital overlegen lacrimal kjertel (OSLG)
MERK: OSLG følger i rask rekkefølge.- Påfør medial press på kloden forårsaker OSLG å stikke ut fra bakre incisure (se ref25 for anatomi, om nødvendig). Påfør medial trykk på kloden (Figur 9, rød pil) med fremspringet av OSLG fra bakre incisure. Fremspringet fungerer som grov lokalisering for å finne den bakre røkelse.
- Bruk buede tang med spisser lukket for å rykke inn området til benete åpningen i skallen er følt. Dette vil bli spaltelignende med en fremre/bakre retning under fremspringet.
- Påfør beskjedent trykk med tang for å etterlate et innrykk i huden, som vil tjene som landemerke for nålplassering (Figur 10A).
- Sett inn en nål (tuberculin sprøyte med en 27-gauge, 5/8-tommers nål) vinkelrett på huden over innrykksmerket (Figur 10B) ~ 1/4 tommer inn i forbrenningen, deretter omdirigere nålen bakre og eksternt mot lateral canthus sikte på midtpunktet mellom injeksjonsstedet og benete orbital rim.
MERK: Hvis forbrenningen ikke er nøyaktig målrettet med nålen, blokkerer skallen sin fremgang. - Når nålens navet er nådd, injiserer du 1000 μg Con A langsomt i et volum på 0,2 ml (figur 10C).
- Fullfør injeksjonen av både PSLG og OSLG innen 2-3 min.
- Fjern dyret fra isofluran sedasjon (hvis ennå ikke ferdig). Injeksjon av den dårligere lacrimal kjertel (ILG) kan vanligvis fullføres uten ytterligere sedasjon.
- Injeksjon av den underlegne lacrimal kjertelen
- Se dyret fra siden. Prominensen til ILG kan sees langs den nedre fremre delen av banen (Figur 11A).
- Tegn en vertikal linje ved hjelp av en kirurgisk markeringspenn eller egnet permanent markør på huden der den overfladiske delen av ILG-kjertelen går fra det overfladiske (mer ytre) hvilestedet på det zygomatiske beinet til sin mer mediale plassering i banen. Dette er vanligvis dårligere enn den motstrammerelimbus (Figur 11A).
- Identifiser enden av det zygomatiske beinet ved å feie den vertikalt holdte amerikanske sonden over denne linjen på huden. ILG-overgangen oppstår der bildet av kjertelen endres fra tydelig omskrevet (hyperechoic linje av det zygomatiske benet er sett langs den nedre kanten av kjertelen i bildet) til en uten en gjenkjennelig medial kant (zygomatisk bein ekko er ikke lenger til stede, Figur 1).
- Vær oppmerksom på den relative posisjonen til håndstykket til linjen som trekkes på huden når den amerikanske skjermen viser denne endringen. Dette er "injeksjonsstedet" hvor Con A skal gis.
- Kontroller dybden av injeksjon slik som å plassere Con A i kjertelen på et punkt bare medial til zygomatisk buebein.
- Bestem injeksjonsdybden slik: Still inn ønsket injeksjonsdybde som dybden på det zygomatiske benet (hyperechoic signal) pluss 1 mm. Trekk denne verdien fra den kjente lengden på nålen (15 mm i dette eksemplet).
- Sett nålen inn i kjertelen på "injeksjonsstedet" ~ 12 mm, og trekk den sakte tilbake til lengden på den eksponerte nålen utenfor kroppen (målt med kirurgiske kalipere) er lik forskjellen beregnet i 5,8,6 (figur 12). Injiser 1000 μg Con A i 0,2 ml.
MERK: For å sikre at kapselen på kjertelen er gjennomboret og ikke bare skyves av nålen, skal nålen settes inn ~ 12 mm eller nesten til navet før uttaket begynner. - Gjenta USA for å bekrefte suksessen til injeksjonen. ILG skal vise et karakteristisk hypoechotisk rom (figur 1).
MERK: ILG-injeksjonen er den som tolereres best av dyrene26 og er derfor gjort sist.
- Fullfør hele prosedyren for å injisere alle kjertler av begge øynene innen 10 min. Dette vil kreve oppnåelse av kompetanse i prosedyren.
MERK: Et enkelt sett med injeksjoner i de 2 orbitale lacrimal kjertlene vil indusere akutt DED som varer 1-2 uker. - For DED av lengre varighet, injiser Con A nøyaktig som ovenfor hver 7. Opptil 6 slike injeksjoner har blitt utført.
6. Vedlikehold etter prosedyren
- Etter injeksjon av Con A, overvåke dyrene i sine begrensende poser i minst 10-20 min, eller til bedøvelseseffekten har slitt av.
- Ikke la dyrene stå uten tilsyn før de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde streng avskummen. Ikke returner dem til sine individuelle bur før de er fullstendig gjenopprettet.
- Post-prosedyre smerte er vanligvis mild og varer mindre enn 48 h. Vurder smerte med kaningrimasskala. Hvis det er nødvendig, gi en enkelt dose subkutan ketorolac (5 mg/kg). For mer alvorlig smerte, gi subkutan buprenorfin 0,1 mg/kg hver 8 timer.
Representative Results
Con A injeksjoner indusert en sterk inflammatorisk respons i lacrimal kjertler preget av en tett lymfatisk infiltrat (Figur 13), ledsaget av redusert tåreproduksjon. Alle riveparametrene ble markert endret (tabell 1 og tabell 2). I tillegg ble riftlaktoferrinnivåer undertrykt (kontroll = 3,1 ± 0,45 vs. Con A injisert = 2,7 ± 0,02 ng/mg protein (gjennomsnitt ± SEM); p<0,03). Sluttresultatet var et kompromittert hornhinne- og konjunktivalepitel, dokumentert av økt rosebengalfarging (figur 6).
Injeksjon av de tre orbital LG vev produsert en konsekvent og jevn DED tilstand i motsetning til statene oppnådd ved tidligere metoder18,27. Viktige bidragsytere til dette resultatet var den USA-guidede injeksjonen av ILG og injeksjonen av OSLG. Tabell 1 oppsummerer de viktigste resultatene av denne metoden. Alle endringer er i samsvar med alvorlig DED.
Et enkelt sett med Con A injeksjoner produserer DED som varer ca 1 uke; alle kliniske parametere normaliserer etter dag 10 (Tabell 2). Sekvensielle Con A injeksjoner ca 1 uke fra hverandre forlenge varigheten av DED tilsvarende. For eksempel opprettholder det andre settet med Con A-injeksjoner på dag 7 DED i 2 uker og så videre. Etter ca. 5 sett med injeksjoner blir DED-tilstanden ofte permanent uten behov for ytterligere injeksjoner.
Da kaninene med Con A-indusert DED ble behandlet med det nye middelet fosfosulindac, undertrykte det markert sykdommen. For eksempel, etter en ukes behandling med denne agentTBUT økte markant sammenlignet med kjøretøybehandlede dyr (43,6 ± 4,0 vs. 12,2 ± 2,8 s; p<0,001; gjennomsnitt ± SEM henholdsvis, for disse og følgende verdier) mens rive osmolaritet ble normalisert (294 ± 4,6 vs. 311 ± 2,0 mOsm / L, p & lt;0,02). Mekanistisk reduserte fosfosulindac nivåene av to avgjørende interleukins, IL-1β (8,4 ± 1,2 vs 21,2 ± 6,6 pg / mg protein; p<0,03) og IL-8 (4,9 ± 1,7 vs. 13,5 ± 5,0 pg / mg protein; p<0,05)19.
Figur 1: Ultralydbilde av den underlegne lacrimalkjertelen. Øvre panel: ILG som den beveger seg dypere i bane for å ligge under den zygomatiske buen. Den stiplede linjen representerer linjen på huden over hvilken den amerikanske sonden er feid. Midtre paneler: Som håndstykket er feid over denne linjen, sensor ser etter tap av zygomatisk bein ekko som er til stede i venstre bilde (pil) og forsvinner til høyre. Nedre paneler: Bilder av ILG tatt før (venstre) og etter (høyre) injeksjon av Con A. Utvikling av et stort cystisk rom i kjertelen bekrefter riktig levering. Gjengitt med tillatelse19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gassmaskesedasjon. Dette bildet viser gassmasken som gir kort moderat sedasjon med isoflurane. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fjerning av nictitating membranen. (A) Injeksjon av lidokain/adrenalin. (B) Avkorting av nictitating membranen på sin base med Westcott saks. (C) Okulær overflate visualisert lettere etter fjerning av nictitating membranen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Måling av avbruddstid for rifter. (A) Ensartet grønn tårefilm utseende av hornhinnen overflaten under blått lys umiddelbart etter påføring av fluorescein dråper. (B) Hornhinneoverflate som allerede har gjennomgått markert brudd dokumentert av flere mørke sirkler og lineære striper i fluoresceinen. Break-up tid registreres så snart den første mørke flekken eller linjen utvikler seg. De to lyseblå sirklene er refleksjoner av lyskilden av hornhinnen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Schirmers tåretest. (A) Riktig plassering av Weck-Cel svamp i nedre fornix for å fjerne eventuelle gjenværende aktuelle lidokain løsning og baseline tårer. Ved å plassere den bakre kanten av den trekantede svampen under nedre lokkmarg, kan man opprettholde en svært jevn teknikk for å tørke okulær overflate før plassering av rivestripene. (B) En rivestripe på riktig måte plassert i midten av nedre lokk mellom kloden og nedre lokk (palpebral conjunctiva). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Rose bengal farging. Øvre: Fotografier av hornhinnen overflaten. Venstre: Ingen rose bengal farging er til stede før behandling med Con A. Høyre: Diffus hornhinne og konjunktival farging ses i øvre nasal kvadrant etter injeksjon (øvre høyre). Lavere: Konjunktivittinntrykk cytologi fra den overlegne bulbar conjunctiva. Venstre: Mange bebletceller er til stede før behandling. Høyre: Epitelceller er til stede, men bebletceller er fraværende etter behandling. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Tilberedning av kanin for concanavalin A injeksjoner. (A) Små saks brukes til å fjerne pels, slik at enklere visualisering av landemerker for å identifisere orbital overlegen lacrimal kjertel. (B) Nair brukes til å fjerne hår som gjenstår etter klipping. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Injeksjon av den palpebrale lacrimal kjertelen. (A) Den palpebrale lacrimal kjertelen, som vises som en bulbous høyde i bakre temporal del av øvre lokk. Tårer blir sett streaming fra overflaten av denne kjertelen etter å ha brukt en dråpe på 2% fluorescein. (B) Den palpebrale lacrimal kjertelen injiseres mens kaninen får moderat sedasjon. En etterforsker trekker øyelokket tilbake, optimaliserer eksponeringen av kjertelen, og sikrer masken mens den andre etterforskeren injiserer kjertelen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Lokalisering av orbital overlegen lacrimal kjertel. Endringer i hudkonturer indikerer plasseringen av OSLG når den stikker ut gjennom den bakre forbrenningen. Vekslende mediale trykk på kloden (stor pil) fører til at den overlegne orbitalkjertelen prolaps, som blir sett på som en liten høyde i huden. Denne høyden vil øke i størrelse hver gang trykket påføres (små piler). Plasseringen av denne kjertelen er vanligvis i tråd med den bakre orbital felgen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Injeksjon av orbital overlegen lacrimal kjertel. (A) Påføring av mildt trykk på skallen med fintannde tang i området som prolapsed som i figur 9. En tynn spaltelignende åpning i skallen kan palperes. Etterlater et lite innrykksmerke med tang eneogs i stor grad plassering av nålen under injeksjon. (B) Nålen settes inn vinkelrett gjennom snittet. Hvis den plasseres feil, stoppes passasjen av benete skallen. (C) Nålen er i sluttposisjon vinklet mot sidekant. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 11: Lokalisering av den underlegne lacrimal kjertelen. (A) Den fremtredende delen av den overfladiske delen av ILG sett gjennom nedre lokk. Det curvilinear pennmerket betegner den nedre posisjonen til kjertelen. Den vertikale linjen, under neselimbus, betegner den omtrentlige posisjonen der ILG går over til en dypere posisjon i banen og fungerer som en visuell referanse for USA. (B) AMERIKANSK håndstykke feier over området av den vertikale linjen; den amerikanske skjermen vil vise hvor det zygomatiske beinet slutter, hvor ILG-overgangene og hvor Con A-injeksjonen skal gis ("injeksjonsstedet"). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 12: Injeksjon av den underlegne lacrimalkjertelen. Injeksjon av ILG gjøres på stedet identifisert av USA. Injeksjonsdybden beregnes som beskrevet i teksten (trinn 5.8.6). Kalipere (sett bak nålen) sørger for at nålen er plassert på riktig dybde før injeksjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 13: Histologi av lacrimal kjertler. Vevsseksjoner av en normal dårligere lacrimalkjertel med typisk tubulo-alveolærstruktur (A) og etter injeksjon av Con A (B), som viser markert lymfatisk infiltrat med effacement av struktur. Lignende inflammatoriske infiltrater ses i de overlegne lacrimal kjertlene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Injeksjonmetode | TBUT, sek | Tåre osmolalitet, osm / l | STT, mm | |||
| Opprinnelig plan | Etter injeksjon | Opprinnelig plan | Etter injeksjon | Opprinnelig plan | Etter injeksjon | |
| gjennomsnitt ± SEM, % endring | ||||||
| ILG uten amerikansk veiledning | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,8 | 15,2 ± 0,9 | 12,9 ± 2,2 |
| %endring | -23% | 1% | -15% | |||
| P=0,05 | P=0,36 | P=0.21 | ||||
| USA-guidede ILG + PSLG | 59,4 ± 0,6 | 11,4 ± 4,2 | 296 ± 4,7 | 326 ± 3,7 | 15,1 ± 1,3 | 10,7 ± 1,8 |
| % endring | -81% | 10% | -29% | |||
| P<0.0001 | P<0.0001 | P<0.03 | ||||
| USA-guidede ILG + PSLG + OSLG | 60 ± 0,0 | 6,2 ± 1,3 | 299 ± 2,9 | 309 ± 2,8 | 14,6 ± 0,9 | 9,9 ± 1,3 |
| % endring | -90% | 3% | -32% | |||
| P<0.0001 | P<0.008 | P<0.002 | ||||
| Alle verdier ble målt på dag 6 etter en enkelt injeksjon av Con A i kjertlene som er oppført. Alle sammenligninger ble gjort til baseline. *ILG, dårligere lacrimal kjertel; PSLG, palpebral del av overlegen lacrimal kjertel; OSLG, orbital del av overlegen lacrimal kjertel; Amerikansk, ultralyd. | ||||||
Tabell 1: Effekten av injeksjonsteknikk og antall injeksjonssteder på tørr øyealvorlighetsgrad.
| Opprinnelig plan | Dag 6 | Dag 13 | Dag 21 | |
| 1 injeksjon | 2 injeksjoner | 3 injeksjoner | ||
| TBUT, sek | 58,5 ± 1,5 | 44,5 ± 7,7 | 29,2 ± 7,8 | 12,8 ± 3,9 |
| % endring | -24% | -50% | -78% | |
| P=0.17 | P=0.001 | P<0.0001 | ||
| TOsm, Osm/L | 297 ± 4,9 | 300 ± 3,9 | 308 ± 4,9 | 313 ± 2,7 |
| % endring | 1% | 4% | 5% | |
| P=0,36 | P=0,04 | P=0.003 | ||
| STT, mm | 15,2 ± 0,9 | 9,3 ± 1,6 | 12,9 ± 1,6 | 7,4 ± 1,1 |
| % endring | -39% | -15% | -51% | |
| P=0.17 | P=0.13 | P=0,008 | ||
| Sammenligninger ble gjort til baseline. | ||||
Tabell 2: Effekt av gjentatte Con A injeksjoner i ILG ved varighet av DED.
Discussion
Kaniner er svært attraktive for studiet av DED. Deres hornhinnen og konjunktivut har et overflateareal nærmere mennesker sammenlignet med mus og rotter; deres komplement av narkotika metaboliserende enzymer som esterases, og histologi av deres lacrimal kjertler ligner på mennesker, og deres øyne er store nok for informative farmakokinetiske studier. Sammenlignet med griser og aper, som de deler lignende funksjoner, koster de mindre og deres eksperimentelle manipulasjon er enklere. Hvis mekanistiske studier vurderes, er en relativ ulempe av kaninen, sammenlignet med mus, at færre reagenser (f.eks monoklonale antistoffer) er tilgjengelige. På den annen side er kaninen langt bedre enn mus for farmakokinetiske og biodistribusjonsstudier fordi enkelt dissekert og av tilstrekkelig størrelse for analytisk arbeid, unngår "prøvepooling".
En kritisk generell parameter er akklimatiseringsperioden til kaninene. Dyrene sendes fra leverandøren under forhold som ofte ikke sikrer et transportmiljø av riktig temperatur eller fuktighet. Noen dyr kan allerede ha utviklet tørre øyne ved ankomst. En to ukers periode med akklimatisering anbefales. Like viktig er samvittighetsfull oppmerksomhet til fuktighet og temperatur i rommet der studien kaniner er plassert i vivarium. Avvik i begge tilstandene kan indusere store variasjoner i øyestatus. Ha back-up luftfuktere og avfuktere på hånden. Hvis sentralsystemet mislykkes, handle raskt for å gjenopprette omgivelsesfuktighet ved hjelp av sikkerhetskopieringsutstyret. Husk at slike uheldige utviklinger er mer vanlig i sommermånedene. De tre mest kritiske trinnene, men for vellykket indusere DED hos kaniner er: 1) dyktig bruk av amerikansk avbildning for å identifisere ILG og å lede og bekrefte injeksjon av Con A; 2) sikre injeksjon av både ILG og de to delene av SLG; og 3) pålitelig og reproduserbart å si parametrene for DED.
Å utvikle den nødvendige eksperimentelle ferdigheten er ikke trivielt, men bør ikke avskrekke noen seriøs etterforsker. Forvent at læringskurven skal fullføres innen fem gjentakelser. Et amerikansk bildesystem av rimelig kvalitet er avgjørende. Anerkjennelse av anatomiske kjennetegn fra OSS er viktig, derfor bør etterforskeren gjennomgå kaninanatomien. Den utmerkede beskrivelsen av kaninanatomi av Davis25, en klassiker, kan være utrolig nyttig. Husk også variasjonen i størrelsen på ILG. Det er at suksessen til Con A alltid må bekreftes med oppfølgingsavbildning. Variasjoner i responsen på Con A i en gruppe kaniner skyldes oftest injeksjonsteknikken (mislykket eller delvis vellykket injeksjon) eller å ignorere kapasiteten til gjenværende lacrimal kjertelvev for å kompensere med overproduksjon av tårer. For de som ønsker å mestre injeksjonsteknikken, kan det være nyttig å injisere metylenblå etterfulgt av rask anatomisk disseksjon; visualisering oppnås hvis den når lacrimal kjertelen eller søler på nærliggende vev. Hittil har denne injeksjonsmetoden blitt utført over 270 ganger av forfatterne uten en eneste komplikasjon.
Å si de fem parametrene for DED presentert ovenfor kan være like vanskelig som er deres besluttsomhet i klinisk praksis. Selv om circadian variasjoner ennå ikke er formelt dokumentert i noen av dem, er det nok bakgrunnsbevis på slike fenomener i øyet28 at de skal assayed på samme tid på dagen (± 1 h), spesielt når gjentatte analyser skal utføres og sammenlignet med hverandre. Konsistens i å utføre disse analyser er viktig. Et team på to er nødvendig. Fire eller flere etterforskere i samme rom som deltar i analyser kan være forstyrrende, gitt at noen tiltak krever streng timing. Passende fotografisk dokumentasjon av høy kvalitet, der det er angitt, er viktig.
Denne modellen er ideelt egnet for narkotikautviklingsstudier. Mestring av dyremodellen og analyseteknikkene sikret utmerket reproduserbarhet19 av effekt- og sikkerhetsstudier.
Dette er en kraftig eksperimentell tilnærming fordi det eliminerer forvirrende variasjon av tidligere modeller, har strømlinjeformet dyremodellen og i hovedsak standardisert som sier de fem parametrene til DED. Den vellykkede anvendelsen av denne modellen til studiet av en kandidat terapeutisk middel har bekreftet sin praktiske nytte som en informativ dyremodell for en sykdom i desperat behov for nye agenter og av en dypere forståelse av sin patogenese.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser bortsett fra BR som har en egenkapitalposisjon i Medicon Pharmaceuticals, Inc. og Apis Therapeutics, LLC; og LH, en ansatt i Medicon Pharmaceuticals, Inc. med en egenkapitalposisjon i Apis Therapeutics, LLC.
Acknowledgments
Alle dyrestudier ble fullført i samsvar og samsvar med alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer. Alle studier ble godkjent av Institutional Review Board of Stony Brook University og utført i samsvar med ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
Disse studiene ble delvis støttet av en Målrettet Forskningsmuligheter stipend fra Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) og et forskningsstipend fra Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Forfatterne takker Michele McTernan for redaksjonell støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
| 26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| 27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
| Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
| Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
| Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
| Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
| Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
| DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
| fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
| Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
| Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
| lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
| macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
| Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
| PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
| Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
| Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
| Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
| TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
| Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |
References
- Paulsen, A. J., et al. Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life. American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).
- Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort. British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).
- Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore. Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II Report Executive Summary. The Ocular Surface. 15 (4), 802-812 (2017).
- Baudouin, C., et al. Clinical impact of inflammation in dry eye disease: proceedings of the ODISSEY group meeting. Acta Ophthalmologica (Copenhagen). 96 (2), 111-119 (2018).
- Calonge, M., et al. Dry eye disease as an inflammatory disorder. Ocular Immunology and Inflammation. 18 (4), 244-253 (2010).
- Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124 (11S), S4-S13 (2017).
- Buckley, R. J. Assessment and management of dry eye disease. Eye (London, England). 32 (2), 200-203 (2018).
- Clayton, J. A.
- Barabino, S.
- Stern, M. E., Pflugfelder, S. C. What We Have Learned From Animal Models of Dry Eye. International Ophthalmology Clinics. 57 (2), 109-118 (2017).
- Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30 (9), 1024-1029 (2011).
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).
- Guo, Z., et al. Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits. Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).
- Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).
- Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).
- Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice. Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).
- Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).
- Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease. Translational Research. 198, 58-72 (2018).
- Huang, L., et al. The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats. British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).
- Mattheolabakis, G., et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats. Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).
- Osmalek, T., Froelich, A., Tasarek, S. Application of gellan gum in pharmacy and medicine. International Journal of Pharmaceutics. 466 (1-2), 328-340 (2014).
- Lemp, M. A. Report of the National Eye Institute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. Contact Lens Association of Ophthalmologists Journal. 21 (4), 221-232 (1995).
- Dal Piaz, F., Braca, A., Belisario, M. A., De Tommasi, N. Thioredoxin system modulation by plant and fungal secondary metabolites. Current Medicinal Chemistry. 17 (5), 479-494 (2010).
- Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, 402-441 (1929).
- Lima, L., Lange, R. R., Turner-Giannico, A., Montiani-Ferreira, F. Evaluation of standardized endodontic paper point tear test in New Zealand white rabbits and comparison between corneal sensitivity followed tear tests. Veterinary Ophthalmology. 18 (Suppl 1), 119-124 (2015).
- Zheng, W., et al. Therapeutic efficacy of fibroblast growth factor 10 in a rabbit model of dry eye. Mol Med Report. 12 (5), 7344-7350 (2015).
- Wiechmann, A. F., Summers, J. A. Circadian rhythms in the eye: the physiological significance of melatonin receptors in ocular tissues. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (2), 137-160 (2008).
