Summary
Den metode, der præsenteres her, bruger mikromønster sammen med kvantitativ billeddannelse til at afsløre rumlig organisation inden for pattedyrs kulturer. Teknikken er nem at etablere i et standard cellebiologi laboratorium og tilbyder et Tractable system til at studere mønstret in vitro.
Abstract
Et grundlæggende mål i biologi er at forstå, hvordan mønstre opstår under udvikling. Flere grupper har vist, at mønstret kan opnås in vitro, når stamceller er rumligt begrænset til mikromønstre, hvorved der oprettes forsøgsmodeller, som giver enestående muligheder for in vitro at identificere de grundlæggende principper for biologisk organisation.
Her beskriver vi vores egen implementering af metodologien. Vi tilpassede en foto-møningsteknik for at reducere behovet for specialiseret udstyr for at gøre det lettere at etablere metoden i et standard cellebiologi laboratorium. Vi har også udviklet en gratis, open source og let at installere billedanalyse ramme for præcist at måle præference positionering af sub-populationer af celler inden for kolonier af standard former og størrelser. Denne metode gør det muligt at afsløre eksistensen af mønstret begivenheder selv i tilsyneladende uorganiserede populationer af celler. Teknikken giver kvantitativ indsigt og kan bruges til at afkoble påvirkninger fra omgivelserne (f. eks. fysiske signaler eller endogene signalering) på en given mønster proces.
Introduction
I pattedyrs systemer er mønstret en fremtrædende egenskab ved den kollektive opførsel af celler, og derfor kan mønstre dannes in vitro, hvis der gives passende signaler til cellerne1,2,3,4, 5 , 6. en måde at afsløre den iboende evne af cellerne til selv at organisere in vitro er at tvinge cellerne til at danne grupper/kolonier af en defineret former og størrelser7,8,9,10 . En teknik, der muliggør dette er micropatterning11. Micropatterning gør det muligt præcist at definere placeringen, hvor ekstracellulære matrix (ECM) molekyler er deponeret på en overflade. Dette dikterer, hvor cellerne kan overholde og derfor styrer, hvordan cellerne spatialt organisere.
Micropatterning er en teknik med talrige anvendelser, for eksempel, micropatterning muliggør standardisering af de oprindelige betingelser forud for differentiering12. Det er vigtigt, at micropatterning gør det muligt nemt at kontrollere størrelsen, formen og afstanden af celle kolonier, og denne egenskab kan bruges til at udtænke eksperimenter, der tager sigte på at forhale den kollektive respons af cellerne til morphogen eller til fysiske signaler7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Flere micropatterning metoder er blevet udviklet11. Photopatterning teknikker er måske de nemmeste metoder til at etablere18. Disse tilgange har også fordelen af præcision, da de kan bruges til at kontrollere formen af enkeltceller18,19,20. Men de kræver også dyrt specialiseret udstyr, herunder en spin Coater, et plasma kammer og en UVO (UV-ozon) renere, som generelt ikke er let tilgængelige i standard biologi laboratorier. For at lette vedtagelsen af teknikken har vi tilpasset protokollen, så den kun nødvendiggør UVO-lampen. Vi starter fra kommercielt tilgængelige plastik slides, som kan skæres med en saks eller med et hul punch til det ønskede format.
Et vigtigt nytte af mikromønstre er evnen til at standardisere kolonier for at sammenligne individuelle kolonier på tværs af flere replikater. Dette gør det muligt at spørge, i hvilket omfang mønster dannelsen inden for disse kolonier er reproducerbar, og at undersøge faktorer, der påvirker robustheden af mønsterprocessen. Det er vigtigt, at kvantificering af "gennemsnitlige" mønstre på tværs af flere standardiserede kolonier også kan afsløre mønster processer, der ellers ikke ville være synlige. Fordelen ved at kunne kvantificere mønstret på standardiserede kolonier afhænger af, at man præcist kan måle protein ekspression, ideelt set på enkelt celleniveau. Men celler på mikromønstre er ofte tæt pakket, hvilket gør dem vanskelige at segmentere med høj nøjagtighed. Celler organiserer også ofte sig selv i tre i stedet for to dimensioner, og det kan være udfordrende at opdage og bevare tredimensionale (3D) oplysninger under segmentering. Når cellerne er blevet segmenteret med succes, er der behov for beregningsmæssige metoder til at udtrække mønster oplysninger fra de resulterende datasæt.
Vi har udviklet segmenterings-og billedanalyse værktøjer til at hjælpe med at overvinde disse problemer. Denne analysemetode bruger kun gratis og open source-software og kræver ikke kendskab til kommandolinje eller programmering til at implementere. For at illustrere metoden her, bruger vi mus embryonale stamme (mES) celler, som spontant udtrykker en markør for tidlig differentiering brachyury (tbra)21,22. Mens ingen synlige rumlige arrangement er visuelt detekterbare, metoden giver mulighed for oprettelse af et kort over præference positionering af T + celler i kolonier. Vi viser også, at Tbra mønstret kontrasterer med fraværet af en præferentiel lokalisering af cellerne, der udtrykker Id1, en direkte udlæser af knoglen morfogenetisk protein (BMP) pathway23. Vi diskuterer også de nuværende begrænsninger af metoden, og hvordan denne teknik kan tilpasses andre eksperimentelle systemer.
Protocol
Bemærk: der findes en oversigt over metoden i figur 1.
1. maske design
- Design Mask i overensstemmelse med de retningslinjer, der er beskrevet i azioune et al.18. Se tabellen over materialer for en reference til den software og maske producent, der anvendes til dette studie.
Bemærk: der kan oprettes flere geometrier, størrelser eller mellemrum mellem figurerne på én maske. UV-lampen kan passe til en 15 cm Mask, som kan indeholde op til 49 forskellige designs (forudsat 2 cm x 2 cm chips).
2. fremgangsmåde ved fremstilling af mikromønster
- Forbered de nødvendige materialer.
- Forbered en opløsning på 0,1% poloxamer 407 (10 mg for 10 mL) i fosfat bufferet saltvand (PBS) og lad det ligge på en shaker ved stuetemperatur. Poloxamer 407 vil tage omkring 20 min til at opløse.
- Læg laboratorie folie (Se tabellen over materialer) i bunden af en 10 cm firkantet Petri skål. Dette vil blive brugt som kammer for matrix deposition.
- Rengør overfladen af photomask, først med 100% acetone, derefter med 100% isopropanol og endelig med ddH2O. Hvis det er muligt, lufttørre Mask eller på anden måde tørre masken med rent papir håndklæde.
- Forbered et firkantet, stift og uigennemsigtigt stykke plastik med nøjagtig samme størrelse som Mask (senere benævnt ' holder ').
Bemærk: Dette vil blive brugt til at vedligeholde plastik dæksedler i kontakt med Mask under belysnings trinnet. - Drej UVO-lampen på, og Kør en opvarmnings belysning i 10 minutter.
- Opret photopatterned chips.
Bemærk: det er muligt at tilpasse proceduren til at skabe chips af enhver ønsket størrelse. For nemheds skyld beskriver vi her proceduren for at generere en 12 mm rund mikromønstrede chip.- Brug en 12 mm hulning, skær hydrofobe plastik glider til at skabe 12 mm runde dæksedler og placere dem i en ren ny Petri skål.
Forsigtig: brug handsker på alle tidspunkt for at undgå hudkontakt med overfladen af plastikken, da dette kan beskadige overfladebehandlingen. - Fjern forsigtigt den beskyttende film fra dækglidere med pincet.
Bemærk: undgå at beskadige plastik overfladen, da dette kan påvirke placeringen af cellerne på chippen under sånings proceduren (punkt 3). - Placer Mask på en ren og stabil overflade (f. eks. Mask Box), krom siden opad, og tilsæt en 2 μl dråbe DDH2O ved placeringen af det ønskede spån design.
- Læg en dækseddel på en dråbe ddH2O, og tryk forsigtigt.
Bemærk: Sørg for, at den plastik side, der vender mod Mask, er den side, der blev beskyttet af den film, der blev fjernet i det tidligere trin. - Placer holderen oven på plastik gliderne, og fastgør forsigtigt denne sandwich med klemmer for at opretholde de plastikstykker, som er i kontakt med photomask.
Bemærk: Placer klemmerne så tæt som muligt på placeringen af plastik gliderne for at sikre, at plastik gliderne er perfekt vedligeholdt i kontakt med overfladen af photomask. - Placer samlingen i UVO-lampen ca. 2 cm fra lyskilden, og oplys den i 10 minutter.
Bemærk: lysets effekt skønnes at være 6 mW/cm2 ved 254 nm bølgelængde, når chippen er placeret i en afstand af 2 cm fra kilden. - Hold sandwichen med Mask i bunden og fjern forsigtigt klemmerne, mens du bevarer trykket med den ene hånd for at forhindre, at diasene bevæger sig, mens du afmonterer sandwichen. Fjern holderen, og sikre, at alle plastikstykker stadig er på masken og ikke sidder fast på holderen.
- Tilføj ddH2O oven på chips og fjern forsigtigt chips fra photomask.
Bemærk: Hvis plastik chippen sidder fast i photomask, skal du løsne chippen ved hjælp af en plastik pipettespids for at skubbe chippen, mens du holder pincet lidt over chippen, hvis chippen løsner sig pludseligt. - Endelig, Placer de photopatterned chips inden matrix deposition kammer.
Bemærk: Sørg for, at den oplyste side af chippen vender opad.
- Brug en 12 mm hulning, skær hydrofobe plastik glider til at skabe 12 mm runde dæksedler og placere dem i en ren ny Petri skål.
- Deponere matrixen.
Bemærk: alle procedurer i dette afsnit skal udføres i en vævskultur hætte.- Poloxamer 407-Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm polyethersulfon-filter (PES).
- Du tilbereder ECM-belægnings opløsningen ved at blande 500 μg/mL sterilfiltreret poloxamer 407 og 1 mg/mL gelatine.
Bemærk: Se også tabel 1 for yderligere oplysninger om andre mulige ECM-molekyler. - Tilsæt 200 μL af belægnings opløsningen på hver belyst chip. Laboratorie filmen vil forhindre faldet i at falde uden for chippen.
- Tilsæt en 3 cm Petri skål fyldt med ddH2O for at begrænse fordampningen og placere den med chippen ved 4 °c natten over.
3. procedure for såning
Bemærk: trinene beskrevet nedenfor er optimeret til CGR8 mus embryonale stamceller (mESC)24 med standard mesc medium (Se også tabel over materialer). Det er dog principielt muligt at tilpasse proceduren for enhver celletype. Bemærk også, at konventionel cellekultur af mus embryonale stamceller ikke er beskrevet her som omfattende dokumentation kan findes andre steder25.
- Sug overfladebehandlings opløsningen op og Inkuber chips to gange i mindst 5 minutter med steril PBS.
- I mellemtiden, forberede en cellesuspension af 5,5 x 105 celler/ml i varmt medium.
- Pipet 200 μL cellesuspension på hver chip (~ 100.000 celler/cm2).
- Luk såningen kammer og lad cellerne til at holde sig til 1 h i inkubator.
- Efter 1 time fyldes hullerne på en multiwell-plade (4-brønd eller 24-brønd plade afhængigt af antallet af chips) med 500 μL/godt varmt medium og overfører chips til pladen med sterile pincet.
- Ryst pladen kraftigt for at løsne ikke-vedsiddende celler. Aspirer mediet og Udskift straks med frisk varmt medium. Kontroller under mikroskopet for at se, om mønstret er synligt (figur 2a).
Bemærk: vedhæftnings tiden skal muligvis optimeres ved brug af andre cellelinjer end mESC eller andre matrix proteiner (Se også tabel 2). - Gentag dette trin, indtil mønstrene er tydeligt synlige, som vist i figur 2a.
Bemærk: dette trin er kritisk og afgør procedurens succes. En vaske procedure, der er for intens, kan frigøre cellerne, i modsætning til utilstrækkelig vask kan resultere i, at cellerne forbliver fastgjort i mellem mønstrene (figur 2c, d).
4. fiksering
Bemærk: efter 48 h i kulturen bør cellerne danne tætte kolonier, som nøje følger mønstrene (som vist i figur 2b).
- Forlader chips i pladen, fjerne ~ 90% af mediet, forlader lige nok medium til at forhindre chips fra tørring.
Bemærk: det er vigtigt, at chippen aldrig tørrer for at undgå farvning artefakter og for at forhindre celle løsrivelse fra overfladen. På grund af den hydrofobicitet af chip overfladen mellem klæbe mønstre, kan chippen have en tendens til at de-våd. På dette tidspunkt kan fiksativ forårsage store kuplede kolonier til at løsne sig fra chippen. Vaske skal være meget blid, ideelt udføres ved pipette Rings væske på siden af brønden og ikke direkte på chippen. - Tilsæt mindst 500 μL PARAFORMALDEHYD (PFA)-baseret fikserings opløsning pr. brønd og Inkuber i 10 min.
Bemærk: hvis kolonierne forekommer særligt tykke (mere end 5 cellelag), kan det være nødvendigt at justere fikserings tiden til 20 min. - Efter fiksering vaskes 3 gange med Vaskeopløsningen (PBS med 0,01% poloxamer 407). En ekstra vask ved hjælp af 50 mm NH4CL fortyndet i vaskeopløsning kan være intercaleret til at slukke rest PFA Cross-Linking aktivitet.
- Prøverne inkubates i mindst 30 minutter i blokerende opløsning.
Bemærk: på nuværende tidspunkt kan prøverne opbevares ved 4 °C i ca. en uge før farvning. Hvis det er tilfældet, forsegle pladen med laboratorie folie for at forhindre fordampning.
5. immun farvning
- Forbered et farvnings kammer ved at placere et ark laboratorie folie i bunden af en 10 cm firkantet Petri skål.
- Lav antistof opløsninger (Se tabel 3 for en liste over antistoffer og fortyndinger, der anvendes i denne artikel).
- Anbring chippen i farvnings kammeret med den side, som understøtter cellerne opad, og tilsæt straks 100 μL primær antistof opløsning på chippen.
Forsigtig: på dette stadium, chips bør ikke let de-våd som i trin 4,1. Der skal dog stadig udvises forsigtighed, fordi det er vigtigt, at chipsene ikke tørrer. Hvis flere chips skal behandles, skal du anvende trin 5,3 på hver chip sekventielt. - Der inkubates i 1 time på en roterende platform ved stuetemperatur.
Bemærk: Hvis cellerne har dannet store 3D-strukturer, kan det være nødvendigt med længere inkubationstid for at give mulighed for ensartet farvning af prøven. Inkubationstiden kan øges op til 24 timer. Dog skal farvnings kammeret indeholde en 3 cm skål fyldt med vand, og farvnings kammeret skal forsegles med laboratorie folie for at forhindre fordampning. - Overfør chips til en frisk multiwell Plate og vask 3 gange med Vaskeopløsningen.
- Udføre inkubation med sekundære antistoffer som beskrevet i trin 5,3 og 5,4.
- Monter chippen på en mikroskopi-slide med 20 μL af ethvert standard monterings medium (f. eks. Mowiol).
6. billeddannelse
Bemærk: billeddannelse kan udføres på et standard Konfokal mikroskop. Her giver vi kun anbefalinger for at sikre en billedkvalitet, som vil være tilstrækkelig til den efterfølgende kvantitative analyse.
Forsigtig: for at undgå enhver operatør bias, bør kolonierne til billedet kun vælges ved hjælp af den nukleare kuvert signal (for at se, om en koloni korrekt følger formen af mønsteret). Undgå at kontrollere signalet af markører af interesse, undtagen når du justerer mikroskop indstillinger.
- Sørg for, at anskaffelses bitdybden er 12 eller 16 bit.
- Identificer de relevante indstillinger for at maksimere det dynamiske område for hver billed kanal. Undgå især billed klipning.
- Medtag en kanal til at afbilde mikromønsterets autofluorescens (Se figur 3).
- Juster billedstørrelse og zoomfaktor for at opnå voxel-størrelser, som spænder mellem 0,1 og 0,6 μm i x-og y-aksen og spænder mellem 0,2 og 2 μm i z-akserne.
Bemærk: for eksempel, i denne undersøgelse, vi brugte en inverteret scanning confokale mikroskop med en 40x mål (numerisk blænde svarende til 1,3), en billedstørrelse på 1024 x 1024 pixels uden digital zoom og en z-trins størrelse på 0,5 μm. Dette resulterede i en voxel-størrelse på 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm. - For hver koloni, definere den mindste og maksimale position langs z-aksen for at sikre, at hele kolonien er erhvervet. Mindst et fly med lavt til intet signal bør medtages under og over kolonien.
- Sørg for, at z-stack retninger er erhvervet konsekvent (enten altid top til bund eller altid bund til top)
- Juster scanningshastigheden, billedopløsningen, rammens gennemsnit og detektor gevinster for at identificere en optimal mellem billedkvalitet og billedbehandlings tidspunkt. Som indikation var billedbehandlings tiden for en koloni som vist i figur 3 ca. 2 – 3 min. Udfør billed anskaffelsen.
Forsigtig: alle billeder skal, for at være sammenlignelige, erhverves på samme mikroskop med samme mål og anskaffelses indstillinger. - I slutningen af købet skal du gemme alle billederne og tildele en entydig navngivningskonvention for at identificere den eksperimentelle tilstand, som hvert billede repræsenterer.
Bemærk: Se figur 4 som eksempel vil denne konvention blive anvendt senere under analyseproceduren. Bemærk, at billeder kan gemmes i ethvert format, der understøttes af BioFormats 26. Hvis kolonier er større end synsfeltet, kan stikninger plugin af ImageJ anvendes27. Bemærk også, at i tilfælde af syning, kan belysning roll off korrektion være nødvendig.
7. billedanalyse
Bemærk: de anbefalede computer specifikationer for denne procedure er: 16 GB RAM, en multi-core 3,33 GHz CPU, og mindst 50 GB diskplads (eller mere afhængigt af antallet af chips, der er blevet imaged). Softwaren er blevet testet på Linux, Windows og MacOS. PickCells er en cross-platform billedanalyse ansøgning med en grafisk brugergrænseflade dedikeret til analyse af den kollektive organisation af cellerne i komplekse flerdimensionelle billeder (Blin et al, under forberedelse). Bemærk, at flere oplysninger om PickCells samt dokumentation for de specifikke moduler, der er nævnt her, kan findes online: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Bemærk også, at grænsefladen er genstand for ændringer, som vi holder forbedre softwaren. Hvis grænsefladen afviger fra det, der vises i figuren eller videoen, skal du se i online manualen.
- Installer og Kør PickCells efter den tilgængelige dokumentation online.
- Importer billeder og kontrollere nøjagtigheden af de leverede oplysninger (figur 4-1).
- Dokumentér navnet på hver kanal.
- Segment kerner baseret på den nukleare konvolut signal ved hjælp af Nessys modul28 (figur 4-2) og giver et præfiks ("kerner" for eksempel), som vil blive brugt til at navngive de genererede segmenterede billeder.
Bemærk: dokumentationer om brug og parameter justeringer kan findes på https://framagit.org/pickcellslab/nessys. - Undersøg og Rediger segmenteringer, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af segmenterings redigerings modulet (figur 4-3)
Bemærk: Hvis segmenterings processen af en eller anden grund ikke giver tilfredsstillende resultater, bør du manuelt slette billeder i databasemappen og også slette noden "segmenterings resultat" i Metamodel -visningen. Gentag derefter trin 7,4 og 7,5. Hvis segmentering af kun en lille delmængde af billeder ikke giver tilfredsstillende resultater, så brug Nessys standalone program (se linket i 7,4), forsøge segmentering på ' defekte billeder ' og erstatte den tilsvarende fil i databasen mappe). - Segmentér mønstret autofluorescens signal ved hjælp af det grundlæggende segmenterings modul (figur 4-4)
- Angiv et præfiks ("mønster" for eksempel), som skal bruges til at navngive de genererede segmenterede billeder.
- Vælg den kanal, der indeholder autofluorescens signalet.
- Anvende støjreduktion; generelt ved hjælp af et Gaussisk filter med en kerne størrelse på 10 x 10 x 0,5 voxels giver tilfredsstillende resultater.
- Indstil den nedre tærskel, så baggrunden vises med blåt, mens forgrunden vises som hvid. Sæt også den øvre tærskel til dens maksimumværdi for at undgå, at høje intensiteter udelukkes fra det endelige resultat (røde områder).
- Vælg Spring over for det sidste trin.
- Klik på Afslut , og vent, indtil alle billeder er behandlet.
- Som for kerner, segmentering resultater kan nu visuelt inspiceres og korrigeres om nødvendigt ved hjælp af segmentering Editor modul (figur 4-5).
- Opret kerner-objekter, og Beregn grundlæggende objekt funktioner.
- Startmodulet indbyggede funktioner fra proceslinjen til venstre for hovedgrænsefladen (figur 4-6).
- Luk panelerne ellipsoide Fitter og Surface Extractor for kun at holde panelet grundlæggende funktioner åbent.
- Vælg Nucleus som objekttype, og vælg det præfiks, du fik i trin 7,4 for "segmenterede billeder".
- Tryk på Compute , og vent, indtil alle billederne er blevet behandlet.
Bemærk: efter dette trin vil det ikke være muligt at redigere kerner segmenteringer igen.
- Opret mønster objekter, og Beregn grundlæggende objekt funktioner. Gentag trin 7.8.1 til 7.8.4, kun denne gang vælge brugerdefineret type som objekttype og præfikset givet i trin 7.6.1 for segmenterede billeder.
Bemærk: efter dette trin vil det ikke være muligt at redigere mønster segmenteringer igen. - Gem navnet på det billede, som hver kerne tilhører som en Nucleus-attribut.
- Klik på Data ≫ ny attribut og vælg Nucleus i popup dialogboksen og klik OK.
- Vælg Indsaml data fra andre objekter, som er forbundet til noden, og klik på næste.
- I panelet til venstre skal du vælge billede og derefter dobbeltklikke på forhør mærket under Målflaget i panelet kurve definition for at indstille billed noden som mål for kurven.
- Udvid ruden tilgængelige attributter i venstre panel, og vælg attributten Name .
- Udvid ruden reduktions operation , og vælg Hent en, og klik derefter på knappen Skift , og klik på næste.
- Skriv "billednavn", tryk på tabulatortasten, og klik på OK.
- Opret en "normaliseret koordinat"-attribut i kerner-objekter (figur 4-7).
- Tilpas trin 7.10.1 til 7.10.6 for at gemme koordinaterne for mønsteret barycentrum som en Nucleus-attribut. Navngiv denne nye attribut "mønster koordinat".
- Klik derefter på Data ≫ ny attribut, Vælg Nucleus og klik OK.
- Vælg Definer en funktion mellem den geografiske eller retningsbestemte vektorer for noden, og klik på næste.
- For type af funktion Vælg array operation, for v1 Vælg vare vektor og derefter Centroid, og for v2 Vælg vare vektor og derefter mønster koordinate.
- Klik på næste, skriv "normaliseret koordinat" i feltet navn , og klik på Udfør.
- Eksporter dataene til en tabulatorsepareret værdifil.
8. R-analyse
- Download og Installer rstudio.
Bemærk: software information og download links er tilgængelige på https://www.rstudio.com/. - Download de R-scripts, der kræves til denne analyse.
Bemærk: scripts kan downloades fra GitLab repository: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr. - Åbn rstudio.
Bemærk: Hvis du kører scriptene for første gang, skal du installere de påkrævede R-pakker (ggplot2 og skalaer). - Fra rstudio, Åbn binnedmap_template. R script.
- Indstil arbejdsmappen til kildefilens placering.
- Følg instruktionerne i scriptet for at tilpasse scriptet til et givent datasæt for at opnå rumlige kort som vist i figur 5.
- Kør scriptet for at generere tæthed kort.
Representative Results
Den billed mønster metode, der beskrives her, gør det muligt præcist at organisere dyrkede celler i kolonier med definerede former og størrelser. Succesen med denne procedure bør tydeligt fremgå umiddelbart efter celle sånings proceduren (trin 3,7), da vedhængende celler vil klynge sig efter Mask-designet som vist i figur 2a. Ved 1 time efter celle såning, kan individuelle mønstre ikke være fuldt ud flydende (kun et par celler pr mønster), men, som cellerne formere sig over tid, vil mønstre blive fuldt koloniseret med kun meget få celler uden for klæbe fladerne (figur 2b). Den nøjagtige udseende af kulturen vil være cellelinje afhængig. For eksempel, mESC form hvælvede-form kolonier10. En chip, hvor mønstret ikke er klart 1 til 2 h efter celle såning indikerer svigt af proceduren (figur 2c, d).
Store og tykke kolonier kan sommetider være udfordrende at plette homogent. Vi foreslår at fastsætte og permeabilize cellerne i et trin (afsnit 4), da dette kan forbedre antistof penetration29. Dette er grunden til, at den valgte fiksativ opløsning indeholder et vaskemiddel. Figur 3 viser det fluorescens signal, der forventes efter immun farvning. Bemærk, at lyse Id1 positive celler findes i tætte regioner (lyse NPC-regioner) af kolonierne (figur 3a). Sådanne hints er nyttige til at vurdere kvaliteten af antistof farvnings proceduren. Bemærk også, at mikromønstrene skabt med den nuværende teknik er auto-luorescent. Dette signal (figur 3a, B, der har forladt de fleste billeder) er nyttigt i analysefasen til spatialt at registrere kolonier med hinanden og skabe de resultater, der vises i figur 5. Autofluorescens signalet er generelt den lyseste, når prøven er spændt med en 405 nm laser, og denne kanal bør efterlades uden farvning til dette formål. Figur 3 viser også, hvordan cellerne er præcist begrænset på mønstre af forskellige former.
Analysen af billeddata udføres i PickCells, en gratis og open source-software udviklet i vores laboratorium (Blin et al., under forberedelse). Denne software omfatter billedanalyse moduler til at læse og sortere konfokale billeder (figur 4-1), til segment (figur 4-2,4-4) og curate segmenterede objekter (figur 4-3, 4-5), til at beregne objekt koordinater eller gennemsnitlig intensitet (figur 4-6) og til at eksportere dataene (figur 4-7, 4-8). Det er vigtigt, at vi har udviklet en robust nuklear segmenterings metode kaldet Nessys28 , som er særligt velegnet til tætte og heterogene populationer af celler, såsom celler dyrket på mikromønstre (figur 3). Figur 4 -2 viser et repræsentativt output af nessys-modulet, hvor hver enkelt celle nøjagtigt får en unik farve identitet. Kun minimal redigering bør være nødvendigt, men redigering er mulig, hvis brugeren beslutter det (figur 4-3). Endelig PickCells giver en række visualiserings moduler til at visualisere data. Et eksempel er givet i figur 4-6: en ringformet koloni gengives i 3D, hvor kerner er farvekodede i henhold til deres position langs z-aksen. Når analysen er valideret i PickCells, data kan eksporteres til at skabe de rumlige kort i R ved hjælp af scripts tilgængelige på (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) som vist i figur 530.
Vi har for nylig vist, at rumlig indespærring af mesc på små (30.000 μm2) disc eller ellipse mikromønstre guider mønstret for en delpopulation af celler, der udtrykker af markør tbra10. Således, for at illustrere vores metode her, vi spørger, om mønstret af Tbra kan påvirkes af BMP signalering i større kolonier (90.000 μm2). Figur 5a viser, at når mesc dyrkes på store skive mikromønstre, er tbra + celler fortrinsvis begrænset til periferien af mønsteret (tbra + tæthed kort), hvor den lokale celletæthed er den laveste (se det blå kort til venstre for figur 5a ). Dette mønster af Tbra bekræftes af kortet for den gennemsnitlige Tbra intensitet.
Disse data viser, at metoden kan afsløre subvisuelle oplysninger. Faktisk fra figur 3, visuel inspektion af en koloni er ikke nok til at identificere nogen form for fysisk organisation i tbra udtryk. Dette forklares især ved den vigtige koloni til koloni variabilitet, som er kvantificeret og vist i højre-de fleste panel af figur 5a.
Teknikken viser også, at der ikke findes påviselige mønstre for Id1 (et mål for BMP-signalering), hvilket kan indikere, at T-mønstret ikke er drevet af BMP-signalering i denne sammenhæng.
Micropatterning gør det muligt at tvinge kolonier til at indtage næsten enhver ønsket geometri. Dette er især nyttigt at afhøre, hvordan systemet reagerer på forskellige geometrier. For eksempel kan vi grunde til, at hvis en morphogen gradient bygger op i centrum af kolonien, skabe et hul i kolonien ville forstyrre denne gradient. Interessant vi stadig observere mønstret på en ring mikromønster, omend på en mindre robust måde (figur 5b).
Figur 1: oversigt over metoden. Diagrammet, der viser de vigtigste trin i metoden. For hvert trin angives den anslåede mængde tid under opgavens navn, og en skematisk illustrerer formålet med proceduren. Der gives også en henvisning til et relevant tal, når det foreligger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kultur udseende 1 h og 48 h efter såning af cellerne på mikromønstre. Brightfield billeder af mESC seedet på mikromønstre. a) forventet celle organisation 1 h efter såning skal mønstrene klart kunne identificeres. (b) forventet resultat efter 48 h af kulturer. mESC har prolifereret og er stadig strengt begrænset til mønster former. (c – d) Mulige ikke-optimale udfald, enten meget få celler overholder plastik undtagen i periferien af diaset (c) eller celler overholder mellem mønstrene (d). Se tabel 2 for en fejlfindingsvejledning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative konfokale billeder af immun farvede kolonier dyrket på mikromønstre.
Repræsentative mESC kolonier efter immunofluorescens for (A) Id1 og nukleare pore kompleks eller (B) tbra og LaminB1. For hver farvning, en koloni dyrket på en skive mikromønster og en koloni dyrket på en ring mikromønster er vist. Individuelle kanaler leveres som gråskalabilleder. Bemærk det klare Auto-fluorescens signal af mikromønsteret (405 nm laser excitation). Skalalinjen repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: flow chart for billedanalyse proceduren. En liste over 3D-konfokale billeder importeres til PickCells til analyse (1). Dette eksempel viser et eksperiment med to forskellige former (diske og ringe som i figur 2). Den billed navngivning konvention er vist oven på den igen og PickCells grænseflade til højre. Derefter bruges Nessys-modulet til automatisk at segmentere kerner (2). I skærmbilledet får hver enkelt kerne en unik farve, der indikerer nøjagtig segmentering. Den autofluorescens af mønsteret er også segmenteret, denne gang, ved hjælp af "grundlæggende segmentering" modul (4). Baggrund vises i blåt og hvidt signal vil blive defineret som mønster form. Segmenterede figurer inspiceres derefter visuelt for at sikre nøjagtig segmentering og redigeres, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af segmenterings redigerings modulet (3 – 5). Skærmbillederne viser dispositionen af de fundne figurer. De lyserøde og gule figurer er blevet redigeret. Endelig er objekter funktioner beregnes og eksporteres til fil, der senere behandles i R (6 – 7). Et skærmbillede af en koloni gengivet som en 3D-visning er angivet (6). For trin 2 til 6 de ikoner, der findes i PickCells grænseflade på tidspunktet for at skrive denne artikel er givet ved siden af Step index. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater for to forskellige transkriptionsfaktorer og mikromønster former
Binned rumkort for mESC dyrket til 48 h på (A) skiveformede mikromønstre eller (B) ringformede mikromønstre. For hver mikromønster form vises kortet over celletæthed, uanset celle fænotype, til venstre med en blå farveskala. Derefter for hver markør (Tbra på den øverste række og Id1 på den nederste række), er der tre særskilte kort, fra venstre mod højre: celletæthed kort over markør udtrykker celler kun (tærskel baseret analyse), kortet over den gennemsnitlige markør intensitet (LOG2) og kortet over den standardafvigelsen for markør intensiteten. Intensiteter gives som vilkårlige fluorescens enheder. For hvert kort er figuren mikromønster angivet som en hvid kontur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| ECM-type | Gelatine | Fibronektin | Kælder membran matrix | |
| Koncentration | ECM-koncentration | 1 mg/mL | 20 μg/mL | 200 μg/mL |
| Poloxamer 407 koncentration | 500 μg/mL | 400 μg/mL | 1 mg/mL | |
| Testet med | mESC | Ja | Ja | Ja |
| Metisc | Nej | Ja | Ja | |
| Serum frit medium | Nej | Ja | Ja |
Tabel 1: testede koncentrationer af poloxamer 407 og ECM. Denne tabel giver et overblik over koncentrationerne af ECM og poloxamer 407, som vi testede i vores laboratorium. For hver ECM/poloxamer 407-kombination vises den celletype, for hvilken mønstret blev opnået med succes, såvel som om kulturen indeholdt serum eller ej. mESC = mus embryonale stamcelle, Mepic = mus epiblast stamcelle.
| Procedure | Observation | Mulige problem | Løsning |
| Micropatterning | Lav celle vedhæftet fil | uhensigtsmæssig ECM/poloxamer 307 koncentrations ratio | Forøg ECM/poloxamer 307 koncentrations forholdet |
| Celle vedhæftnings tiden er for kort | Forøg inkubationstiden for at give tilstrækkelig tid til cellerne til korrekt at overholde mønstre (trin 3,4). For at optimere dette trin kan kontrol af cellerne under et mikroskop hjælpe med at registrere en ændring i cellernes morfologi, hvilket indikerer, at cellerne er begyndt at klæbe. | ||
| Skyller for intense (trin 3,6) | Når du udskifter mediet, bør du undgå at pipettere mediet direkte på chips. I stedet forsigtigt pipet mediet på væggene i brønden i stedet | ||
| Cellerne overholder de mønstre, | uhensigtsmæssig ECM/poloxamer 307 koncentrations ratio | Nedsætte koncentrations forholdet ECM/poloxamer 407 | |
| Celle vedhæftnings tiden er for lang | Reducer Inkubationstiden (trin 3,4). | ||
| Skyller ineffektive (trin 3,6) | Omrystning af pladen kraftigt er normalt tilstrækkelig til at frigøre cellerne i overskud. For celletyper, der har tendens til at holde sig stærkt til chippen, kan pipettering direkte på chippen forbedre resultatet. Forøgelse af antallet af vaske kan også hjælpe, især for at sikre, at ingen celle forbliver flydende i mediet efter dette trin. | ||
| Cellerne følger ikke nøje mønster figuren | ' Inkompatibel ' celletype og mønster geometri | Planlæg/design flere geometrier/størrelser, der skal tilføjes på Mask for at kunne teste og identificere den optimale mønster størrelse for en given mønster form og celletype. Se venligst afsnittet "begrænsninger" i diskussionen | |
| Ikke-optimale foto-mønstring, kan dette diagnosticeres ved at observere skarpheden af autofluorescens signal. Mønster grænserne skal se skarpe ud som i fig. 2. Hvis kanterne af mønstrene synes sløret så foto-Mønstringen trin skal forbedres. | Sløret mønster kanter indikerer, at plastik sliden ikke var tæt nok på overfladen af masken under belysnings trinnet. Sørg for, at brikkerne, der holder gliderne til Mask, er jævnt, og at der påføres et konstant og tilstrækkeligt tryk på samlingen under belysnings proceduren. | ||
| Farvning | Ikke-homogen farvning | antistof Inkubationstiden er for kort | Øg antistof Inkubationstiden (op til 24 timer ved stuetemperatur) |
| kolonier udfladede under monterings proceduren | Monter mikromønster glider i et kammer som chamlide eller cytoo-Chambers for at udføre både immun farvning og billeddannelse uden behov for montering af cellerne. Dette vil bedre bevare kolonierne 3D-struktur. | ||
| Afmontering af kolonier under farvnings proceduren | Affugtning af chippen | Efterlad nok medium eller brug 2 pipetter, en til at fjerne mediet og den anden til at tilføje den friske opløsning | |
| Kolonier vises forsket under mikroskopet | kolonier blev klippet, mens chippen blev monteret på mikroskopi-diaset | Vær meget blid, når du monterer chips. Alternativt kan du montere mikromønstre i et kammer som chamlide eller cytoochambers for at udføre både immun farvning og billeddannelse uden at skulle montere cellerne. Dette bevarer også kolonien ultrastructure. |
Tabel 2: fejlfindingsvejledning. Denne tabel giver et overblik over mulige suboptimale resultater. De potentielle kilder til problemerne er også opført sammen med anbefalede løsninger.
Discussion
Her beskriver vi en metode til at analysere emergent mønster i kulturer af celler. En forenklet mikromønstrings metode bruges til at standardisere formen og størrelsen af celle kolonier, og vi præsenterer billedanalyse værktøjer og R-scripts, der gør det muligt at påvise og kvantificere mønstre inden for disse kolonier.
Den rørledning, vi foreslår, svarer i nogen grad til en tidligere offentliggjort metode31 , hvor forfatterne fokuserer på dyrkningsforholdene ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikromønstre for at opnå reproducerbar kimlagdannelse i ESC-kolonier til undersøgelse af tidlige gastrulation-hændelser in vitro. Vores mål er mere fokuseret på at tilvejebringe en generaliserbar rørledning til opdagelse af mønster dannelse in vitro, hvor den kollektive organisation af cellerne kun kan blive tydelig efter statistisk analyse. Af denne grund leverer vi et robust billede analyse workflow, som muliggør nøjagtig identifikation og analyse af nukleare position i 3D-rum over flere kolonier (Se også "fordel og begrænsninger af mønsteret opdagelse metode" i denne drøftelse). Vi har også besluttet at udvikle en enkel in-House mikromønvertilgang, som giver et mere fleksibelt og billigere alternativ til kommercielt tilgængelige løsninger på lang sigt, som vi håber vil være nyttige for Fællesskabet.
Endelig bemærker vi, at der under revisionen af dette manuskript, en ny pakke til analyse af mønstret in vitro svarende til vores R-scripts er blevet frigivet32. Denne nye pakke accepterer tabeller med celle funktioner som input, der kan fås fra high gennemløb Imaging platforme. Vi mener, at tabellen med kerner, der genereres i trin 7 i vores protokol, principielt kan tjene som input til denne nye pakke, selv om vi ikke selv har afprøvet denne mulighed.
Metodens tilpasningsevne til andre celletyper og koloni geometrier
Vi præsenterer denne tilgang i forbindelse med at studere fremkomsten af af transkriptionsfaktorer i kulturer af pluripotente celler i nærværelse af serum. Metoden er dog let at tilpasse til andre celletyper og til serum frie kulturer, selv om det kan være nødvendigt at optimere de koncentrationer af ECM/poloxamer 407 (Se tabel 1 for testede koncentrationer og tabel 2 for en fejlfindingsvejledning). Metoden kan også tilpasses til større eller mindre størrelser af mikromønstre og til en bred vifte af former i henhold til brugernes behov. Men samtidig med at fastsætte metoden, er det vigtigt at være opmærksom på, at ikke alle form/celletype kombinationer er optimale. For eksempel, mesc udtrykke høje niveauer af E-cadherin33,34 gør det muligt for disse celler til at danne kollektive strukturer spænder områder, der er blottet for ECM. Disse celler følger ikke strengt geometrier med skarpe vinkler, eller som omfatter små huller i mønsteret. Bemærk for eksempel, at på ringen af figur 3b, cellerne er i færd med at kolonisere det centrale område. I vores hænder et mindre centralt område ikke tvinge mESC til at danne Ringformede kolonier. Det anbefales derfor stærkt at inkludere en mangfoldighed af geometrier, mens designe Mask at være i stand til at teste og identificere de optimale størrelser og krumninger, som vil være egnet til celletype valg.
En anden vigtig faktor at tage hensyn til, er længden af forsøget og spredningen sats af cellerne. For nogle hurtigt prolifererende celletyper (herunder pluripotente celler) kan det være svært at vedligeholde celler på mikromønstre over mange dage (for mESC tre dage er et maksimum). Også, såning af celler på mikromønstre ikke altid forekomme optimalt for hver koloni, så det er tilrådeligt at frø et overskud af kolonier for at have reservedele.
Fordele og begrænsninger ved mønster detekterings metoden
En særlig fordel ved metoden er evnen til at detektere "gennemsnit" mønstre ved at kombinere billedanalyse resultater fra flere replikat kolonier (figur 5). Dette kan afsløre mønster hændelser, der ikke fremgår af inspektionen af de enkelte kolonier. En ulempe ved denne "averaging" tilgang er, at det kan gå glip af visse typer af gentagne mønstre, for eksempel små pletter eller smalle striber. Men disse typer af mønster kan i stedet blive afsløret med en kombination af nøje udvalgte mønster størrelser8. Også den analyse pipeline, der beskrives her, indeholder kvantitative data på både enkelt celle-og koloni opløsning, der giver mulighed for at undersøge niveauet af interkoloni variabilitet (figur 5) eller for at udføre nabo analyse ved flere skalaer10.
En anden vigtig fordel ved den gennemsnitligt metode er, at det giver mulighed for at kort den præferentielle placering af mange markører uden at være begrænset af tilgængelige fluorophorer af detekterings kanaler. Selv om vi gør brug af kun to markører for differentiering i det arbejde, der præsenteres her, muligheden for at standardisere kolonier og ekstrakt "gennemsnit" mønstre gør det muligt at sammenligne distributions kort fra forskellige sæt af kolonier sammen for at afsløre de generelle rumlige forhold af markører til hinanden.
Desuden, selv om vores fokus her har været at studere markører for differentiering, kan analysemetoden udvides til at studere andre biologiske processer, som nukleare markører er tilgængelige. For eksempel vil mikromønstring af en cellelinje, der indeholder en fluorescens ubiquitination celle cyklus indikator35 (fucci) gøre det muligt at studere, hvordan koloni niveau geometri kan påvirke celle cyklus begivenheder i gruppen.
Fremtidige retninger
Metoden er modtagelig for medium gennemløb billedanalyse, men billed erhvervelse er i øjeblikket ikke fuldt automatiseret og kan blive begrænsende for meget store eksperimenter. De regelmæssige arrangementer af kolonier bør gøre det muligt at skabe fuldt automatiserede erhvervelse rutiner svarende til, hvad der er udviklet til enkelt celle gennemsnit20. Men fordi størrelsen af det felt, der kræves for at billedet en koloni er stor, muligvis kræver mosaikning, og fordi kolonier er tredimensionale, er det meget ønskeligt at reducere både datasæt størrelse og erhvervelse tid ved billeddannelse kun relevante kolonier. Derfor kan den fremtidige indsats være dedikeret til at udvikle et "intelligent" mikroskop, der er i stand til at identificere relevante kolonier og tilpasse billed koordinater til hver prøve. Dette vil ikke kun reducere tid og kræfter, men også forhindre potentielle operatør bias.
Analyse pipelines kan også gøres mere effektive ved at reducere antallet af trin, som brugeren skal tage. Vi har planer om at opbygge en pipeline-bygning mekanisme og til at integrere R direkte i vores software (Se også spørgsmål pickcells-API # 3 og pickcells-rjava # 1 i spørgsmålet tracker af vores kode repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fulde automatisering af analyseproceduren vil reducere tid og kræfter og begrænse potentielle bruger fejl.
Endelig bemærker vi, at vores analysemetode endnu ikke fuldt ud fanger den dynamiske karakter af cellulært mønster. Nogle begrænsede dynamiske oplysninger kan udvindes ved at undersøge en tidsserie af snapshot billeder8,10,36. Men at være i stand til at registrere historien om cellen befolkning er meget ønskværdigt, hvis vi ønsker at bedre at forstå, hvordan mønstret opstår. En begrænsning er, at nøjagtig sporing af individuelle celler i en 3D-tæt cellepopulation fortsat er en meget udfordrende opgave37. Vores celle detekterings metode bruger den nukleare konvolut og udfører særlig godt på tætte og overlappende cellepopulationer28. Levende journalister af den nukleare konvolut er let tilgængelige28,38 og en fordel ved mikromønten teknik er, at det kan bruges til at forhindre cellerne i at bevæge sig uden for synsfeltet under langsigtet billeddannelse. Samlet set er vi overbeviste om, at automatiseret sporing af celler vil kunne opnås ved hjælp af en kombination af nyligt etablerede værktøjer28,39,40 , og at dette bør give ny indsigt i de grundlæggende principper for selvorganisering.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et Sir Henry Wellcome postdoktorat stipendium (WT100133 til G.B.), et Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA til S.L.), og et Wellcome Trust PhD Studentship til (108906/Z/15/Z til D.W.). Vi er også taknemmelig over for Dr. manuel thery for hans råd om at tilpasse teknikken til fotopatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
| 1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
| 5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
| Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
| Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
| Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
| Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
| Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
| CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
| Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
| Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
| Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
| Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
| mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
| NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
| PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
| PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
| Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
| Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
| Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
| Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |
References
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
- Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
- Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366 (2017).
- Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
- Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438 (2009).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).
- Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
- Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
- Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
- Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872 (2018).
- Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106 (2010).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
- Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).
- Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
- Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839 (2018).
- Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).
- Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
- McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).
