Summary
Den metod som presenteras här använder micropatterning tillsammans med kvantitativ avbildning för att avslöja rumslig organisation inom däggdjurs kulturer. Tekniken är lätt att etablera i ett standard cellbiologi laboratorium och erbjuder ett tractable system för att studera mönkning in vitro.
Abstract
Ett grundläggande mål i biologi är att förstå hur mönster framträder under utvecklingen. Flera grupper har visat att mönster kan uppnås in vitro när stamceller är rumsligt begränsade till mikromönster, och därmed inrätta experimentella modeller som erbjuder unika möjligheter att identifiera, in vitro, de grundläggande principerna för biologisk organisation.
Här beskriver vi vår egen implementering av metodiken. Vi anpassade en foto-mönkning teknik för att minska behovet av specialiserad utrustning för att göra det lättare att fastställa metoden i ett standard cellbiologi laboratorium. Vi utvecklade också en fri, öppen källkod och lätt att installera bildanalys ram för att exakt mäta den förmånliga placeringen av sub-populationer av celler i kolonier av standard former och storlekar. Denna metod gör det möjligt att avslöja förekomsten av mönster händelser även i till synes oorganiserade populationer av celler. Tekniken ger kvantitativa insikter och kan användas för att frikoppla påverkan av miljön (t. ex. fysiska signaler eller endogena signalering), på en given mönjande process.
Introduction
I däggdjurs system är mönster en framväxande egendom av det kollektiva beteendet hos celler och så, mönster kan bildas in vitro-om lämpliga signaler ges till cellerna1,2,3,4, ,5 , 6. ett sätt att avslöja den inneboende förmågan hos cellerna att själv organisera in vitro är att tvinga cellerna att bilda grupper/kolonier av en definierad former och storlekar7,8,9,10 . En teknik som möjliggör detta är micropatterning11. Micropatterning gör det möjligt att exakt definiera den plats där extracellulära matrix (ECM) molekyler deponeras på en yta. Detta, i sin tur dikterar där cellerna kan följa och därför styr hur celler rumsligt organisera.
Micropatterning är en teknik med många tillämpningar, till exempel micropatterning möjliggör standardisering av initiala förhållanden före differentiering12. Viktigt, micropatterning gör det möjligt att enkelt kontrollera storlek, form och avstånd av cellkolonier och denna egenskap kan användas för att utforma experiment som syftar till förhör den kollektiva reaktionen av cellerna till morphogen eller till fysiska signaler7 , 8 , 10 , 13 , fjorton , 15 , 16 , 17.
Flera micropatterning metoder har utvecklats11. Photopatterning tekniker är kanske de enklaste metoderna för att etablera18. Dessa metoder har också fördelen av precision eftersom de kan användas för att styra formen av enskilda celler18,19,20. Men de kräver också dyra specialiserad utrustning inklusive en spinn coater, en plasma kammare och en UVO (UV-ozon) renare som i allmänhet inte lätt tillgängliga i standard biologi laboratorier. För att underlätta antagandet av tekniken, anpassade vi protokollet för att kräva endast UVO lampan. Vi utgår från kommersiellt tillgängliga plast rutschbanor som kan klippas med sax eller med hålslag till önskat format.
Ett viktigt verktyg för mikromönster är möjligheten att standardisera kolonier för att jämföra enskilda kolonier över flera replikat. Detta gör det möjligt att fråga i vilken utsträckning mönster bildning inom dessa kolonier är reproducerbar, och att utforska faktorer som påverkar robustheten i mönstringsprocessen. Viktigt är att kvantifiering av "genomsnittliga" mönster över flera standardiserade kolonier också kan avslöja mönstrar processer som annars inte skulle vara uppenbara. Fördelen med att kunna kvantifiera mönkning på standardiserade kolonier beror på att kunna exakt mäta proteinuttryck, helst på en enda cellnivå. Men celler på mikromönster är ofta tätt packade, vilket gör dem svåra att segmentera med hög noggrannhet. Celler organiserar också ofta sig i tre i stället för två dimensioner, och det kan vara svårt att upptäcka och bevara tredimensionell (3D) information under segmentering. När celler har segmenterats framgångsrikt behövs beräkningsmetoder för att extrahera mönster information från de resulterande datauppsättningarna.
Vi har utvecklat segmentering och bildanalys verktyg för att hjälpa till att övervinna dessa problem. Denna analysmetod använder bara fri och öppen källkod och kräver inte kunskap om kommandoraden eller programmering för att implementera. För att illustrera metoden här, använder vi mus embryonala stem (MES) celler som spontant uttrycker en markör för tidig differentiering brachyury (TBRA)21,22. Även om ingen uppenbar rumslig arrangemang är visuellt detekterbar, metoden tillåter skapandet av en karta över preferens positionering av T + celler i kolonier. Vi visar också att TBRA mönster kontrasterar med avsaknaden av en preferens lokalisering av cellerna uttrycker Id1, en direkt avläsning av ben Morphogenetic Protein (BMP) väg23. Vi diskuterar också metodens nuvarande begränsningar och hur denna teknik kan anpassas till andra experimentella system.
Protocol
Anm.: en översikt över metoden finns i figur 1.
1. mask design
- Designa photomasken enligt de riktlinjer som beskrivs i Azioune et al.18. Se tabellen av material för en hänvisning till programvaran och mask tillverkare som används för denna studie.
Observera: flera geometrier, storlekar eller avstånd mellan formerna kan skapas på en mask. UV-lampan kan passa en 15 cm photomasken som kan innehålla upp till 49 olika utföranden (förutsatt 2 cm x 2 cm chips).
2. mikromönster tillverkningsförfarande
- Förbered de nödvändiga materialen.
- Bered en lösning på 0,1% poloxamer 407 (10 mg för 10 mL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och låt skaka i rumstemperatur. Den poloxamer 407 tar ca 20 min att lösa.
- Lay laboratorium film (se tabellen av material) i botten av en 10 cm fyrkantig petriskål. Detta kommer att användas som kammare för Matrix deposition.
- Rengör ytan på Photomask, först med 100% aceton, sedan med 100% isopropanol och slutligen med ddH2O. Om möjligt, lufttorka foto ask eller på annat sätt torka masken med ren pappershandduk.
- Förbered en fyrkantig, styv och ogenomskinlig plastbit med exakt samma storlek som photomasken (senare kallad "Holder").
Anmärkning: detta kommer att användas för att bibehålla plast täckglas i kontakt med photomasken under belysnings steget. - Vrid UVO-lampan och kör en värmande belysning i 10 minuter.
- Skapa fotomönstrade chips.
Obs: det är möjligt att anpassa proceduren för att skapa marker av önskad storlek. För enkelhetens skull beskriver vi här proceduren för att generera en 12 mm rund mikromönstrad chip.- Med en 12 mm Hålslag, skära hydrofoba plast bilder för att skapa 12 mm runda täckglas och placera dem i en ren ny petriskål.
FÖRSIKTIGHET: Använd handskar hela tiden för att undvika hudkontakt med ytan av plasten eftersom detta kan skada ytbehandlingen. - Ta försiktigt bort skyddsfilmen från täckglas med pincett.
Anmärkning: Undvik att skada plastytan eftersom detta kan påverka placeringen av cellerna på chippet under sådd förfarandet (avsnitt 3). - Placera photomasken på en ren och stabil yta (t. ex. photomasken-Box), krom sida vänd uppåt och tillsätt en 2 μL droppe ddH2O vid positionen för den önskade spåndesignen.
- Lägg en täckslip på droppe ddH2O och tryck försiktigt.
Obs: se till att den plast sida som vetter mot photomasken är den sida som skyddades av filmen som togs bort i det tidigare steget. - Placera hållaren ovanpå plastglasen och fäst försiktigt denna smörgås med klämmor för att bibehålla plastbitarna i kontakt med Photomask.
Anmärkning: placera klämmorna så nära som möjligt till platsen för plastglasen för att säkerställa att plastglasen är perfekt underhållna i kontakt med ytan på Photomask. - Placera aggregatet i UVO-lampan på ca 2 cm från ljuskällan och Lys upp i 10 minuter.
Obs: Ljusets kraft uppskattas vara 6 mW/cm2 vid 254 nm våglängd när chippet är placerat på ett avstånd av 2 cm från källan. - Håll smörgåsen med photomasken längst ner och försiktigt bort klämmorna samtidigt som trycket med en hand för att förhindra att bilderna från att röra sig medan demontering av smörgås. Ta bort hållaren och se till att alla plastbitar fortfarande sitter på masken och inte fastnar på hållaren.
- Lägg till ddH2O ovanpå markerna och ta försiktigt loss spånorna från Photomask.
Anmärkning: om Plastchip har fastnat på Photomask, lossa chip med hjälp av en plastpipett tips för att driva chip medan du håller pincett något över chip i fall chip lossnar plötsligt. - Slutligen, placera de fotomönstrade markerna i Matrix deposition kammaren.
Obs: se till att den belysta sidan av chippet är vänd uppåt.
- Med en 12 mm Hålslag, skära hydrofoba plast bilder för att skapa 12 mm runda täckglas och placera dem i en ren ny petriskål.
- Deponera matrisen.
Anmärkning: alla procedurer i detta avsnitt bör utföras i en vävnad kultur huva.- Filtrera poloxamer 407 lösning genom ett 0,22 μm polyetersulfon (PES) filter.
- Bered ECM-beläggnings lösningen genom att blanda 500 μg/mL steril filtrerad poloxamer 407 och 1 mg/mL gelatin.
Anm.: Se även tabell 1 för ytterligare information om andra möjliga ECM-molekyler. - Tillsätt 200 μL av beläggnings lösningen på varje upplyst chip. Laboratorie filmen kommer att förhindra att nedgången faller utanför chippet.
- Tillsätt en 3 cm petriskål fylld med ddH2O för att begränsa avdunstning och placera den med chip vid 4 ° c över natten.
3. sådd förfarande
Anmärkning: stegen som beskrivs nedan har optimerats för CGR8 Mouse embryonala stamceller (mESC)24 med standard mesc medium (se även tabellen av material). Det är dock i princip möjligt att anpassa förfarandet för vilken celltyp som helst. Observera också att konventionell cellkultur av mus embryonala stamceller inte beskrivs här som omfattande dokumentation kan hittas någon annanstans25.
- Aspirera på beläggnings lösningen och inkubera spånorna två gånger i minst 5 minuter med steril PBS.
- Under tiden, Förbered en cellsuspension av 5,5 x 105 celler/ml i varmt medium.
- Pipet 200 μL cellsuspension på varje chip (~ 100 000 celler/cm2).
- Stäng sådd kammaren och låt cellerna att hålla sig i 1 h i inkubatorn.
- Efter 1 h, Fyll brunnarna i en multispot tallrik (4-brunn eller 24-bra tallrik beroende på antalet chips) med 500 μl/brunn av varmt medium och överföra markerna i plattan med steril pincett.
- Skaka plattan kraftigt för att lossa icke-adherenta celler. Aspirera mediet och omedelbart ersätta med färskt varmt medium. Kontrollera under mikroskopet för att se om mönstret är synligt (figur 2A).
Obs: vidhäftnings tid kan behöva optimeras vid användning av andra cellinjer än mESC eller andra mat ris proteiner (se även tabell 2). - Upprepa detta steg tills mönstren blir tydligt synliga som visas i figur 2A.
Obs: detta steg är kritisk och avgör framgången för förfarandet. En alltför intensiv tvättprocedur kan lossna cellerna, i motsats till otillräcklig tvättning kan resultera i att celler förblir fästa i mellan mönstren (figur 2C, d).
4. fixering
Anmärkning: efter 48 h i kulturen cellerna bör bilda täta kolonier som strikt följer formen på mönstren (som visas i figur 2b).
- Lämnar marker i plattan, ta bort ~ 90% av mediet, lämnar precis tillräckligt medium för att förhindra att spånorna torkar.
Obs: det är viktigt att spånan aldrig torkar för att undvika fläckar och för att förhindra cell avlossning från ytan. På grund av den hydrofobicitet av spånytan mellan adhesiva mönster, kan chippet ha en tendens att de-våt. I detta skede kan fixativ orsaka stora kupade kolonier att lossna från chip. Tvättar bör vara mycket skonsam, helst utföras av Pipettera vätska på sidan av brunnen och inte direkt på chip. - Tillsätt minst 500 μL av PARAFORMALDEHYD (PFA)-baserad Fixeringslösning per brunn och inkubera i 10 min.
Anmärkning: om kolonier verkar särskilt tjocka (mer än 5 cellskikt), kan det vara nödvändigt att justera bindningstiden till 20 min. - Efter fixering, tvätta 3 gånger med tvättlösningen (PBS med 0,01% poloxamer 407). En extra tvätt med 50 mm NH4cl utspädd i tvättlösning kan vara interkalenderat att släcka resterande PFA tvär bindnings aktivitet.
- Inkubera proverna i minst 30 minuter i blockeringslösning.
Anmärkning: i detta skede kan proverna förvaras vid 4 ° c i ungefär en vecka före färgning. Om så är det, täta plattan med laboratorie film för att förhindra avdunstning.
5. immunofärgning
- Förbered en färgning kammare genom att placera ett ark av laboratorie film i botten av en 10 cm fyrkantig petriskål.
- Bered antikropps lösningar (se tabell 3 för en lista över antikroppar och utspädningar som används i denna artikel).
- Placera spånan i färg kammaren med den sida som stöder cellerna vänd uppåt och tillsätt omedelbart 100 μL primär antikropps lösning på chippet.
FÖRSIKTIGHET: i detta skede bör chips inte lätt de-våt som i steg 4,1. Emellertid, försiktighet bör fortfarande vidtas eftersom det är viktigt att markerna inte torkar. Om flera chips måste bearbetas, tillämpa steg 5,3 på varje chip sekventiellt. - Inkubera i 1 h på en roterande plattform i rumstemperatur.
Anmärkning: om cellerna har bildat stora 3D-strukturer, kan en längre inkubationstid krävas för att möjliggöra en enhetlig färgning av provet. Inkubationstiden kan ökas upp till 24 timmar. Dock måste färg kammaren innehålla en 3 cm skål fylld med vatten och färg kammaren måste förseglas med laboratorie film för att förhindra avdunstning. - Överför spånorna till en fräsch multispot-platta och tvätta 3 gånger med tvättlösningen.
- Utför inkubering med sekundära antikroppar enligt beskrivningen i steg 5,3 och 5,4.
- Montera chip på en mikroskopi glida med 20 μL av alla vanliga monteringsmedel (t. ex., Mowiol).
6. Imaging
Anmärkning: avbildning kan utföras på ett standard konfokalmikroskop. Här ger vi bara rekommendationer för att säkerställa en bildkvalitet som kommer att räcka för den efterföljande kvantitativa analysen.
Varning: för att undvika att operatören är partisk bör kolonierna till bild endast väljas med hjälp av den nukleära kuvert signalen (för att se om en koloni på rätt sätt följer mönstret). Undvik att kontrollera signalen från markörer av intresse förutom vid justering av Mikroskop inställningar.
- Se till att förvärvs bitdjupet är 12 eller 16 bitar.
- Identifiera lämpliga inställningar för att maximera det dynamiska omfånget för varje bild kanal. Undvik särskilt bild klippning.
- Inkludera en kanal för att avbilda mikromönstret autofluorescence (se figur 3).
- Justera bildstorlek och zoomfaktor för att erhålla Voxel-storlekar mellan 0,1 och 0,6 μm i x-och y-axlarna och mellan 0,2 och 2 μm i z-axeln.
Obs: till exempel i denna studie använde vi en inverterad skanning konfokala Mikroskop med en 40x mål (numerisk bländare lika med 1,3), en bildstorlek på 1024 x 1024 pixlar utan digital zoom och en z-stegs storlek på 0,5 μm. Detta resulterade i en Voxel-storlek på 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm. - För varje koloni, definiera den lägsta och högsta positionen längs z-axeln för att säkerställa att hela kolonin förvärvas. Minst ett plan med låg till ingen signal bör inkluderas nedan och ovanför kolonin.
- Se till att z-stack riktlinjer förvärvas konsekvent (antingen alltid uppifrån och ned eller alltid botten till toppen)
- Justera skanningshastigheten, bildupplösningen, bild Rute medelvärdet och detektorns vinster för att identifiera en optimal mellan bildkvalitet och avbildnings tid. Som en indikation var bildbehandlings tiden för en koloni som visas i figur 3 cirka 2 – 3 min. utför bild förvärvet.
FÖRSIKTIGHET: alla bilder, för att vara jämförbara, måste förvärvas på samma Mikroskop med samma mål och förvärvs inställningar. - I slutet av förvärvet sparar du alla avbildningar och tilldelar en unik namngivningskonvention för att identifiera det experimentella villkoret som varje avbildning representerar.
Anm.: se figur 4 som exempel kommer denna konvention att användas senare under analysförfarandet. Observera att bilder kan sparas i alla format som stöds av bioformat 26. Om kolonier är större än synfält, kan sy plugin av ImageJ användas27. Observera också att i händelse av sömnad, kan belysningen rulla bort korrigering vara nödvändigt.
7. bildanalys
Anmärkning: rekommenderade DATORSPECIFIKATIONER för den här proceduren är: 16 GB RAM, en multi-core 3,33 GHz CPU, och minst 50 GB ledigt hårddiskutrymme (eller mer beroende på antalet marker som har avbildas). Programvaran har testats på Linux, Windows och MacOS. PickCells är en plattformsoberoende bildanalysprogram med ett grafiskt användargränssnitt tillägnad analysen av den kollektiva organisationen av cellerna i komplexa flerdimensionella bilder (Blin et al, under utarbetande). Observera att mer information om PickCells samt dokumentation för de specifika modulerna som nämns här kan hittas på nätet: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Observera också att gränssnittet kan ändras när vi fortsätter att förbättra programvaran. Om gränssnittet skiljer sig från vad som visas i figuren eller videon, se onlinehandboken.
- Installera och kör PickCells efter den dokumentation som finns tillgänglig online.
- Importera bilder och kontrollera riktigheten av den tillhandahållna informationen (figur 4-1).
- Dokumentera namnet på varje kanal.
- Segmentets kärnor baserat på den nukleära kuvert signalen med hjälp av nessys modul28 (figur 4-2) och ger ett prefix ("kärnor" till exempel) som kommer att användas för att namnge de genererade segmenterade bilderna.
ANMÄRKNINGAR: dokumentationer om användning och parameter justeringar finns på https://framagit.org/pickcellslab/nessys. - Inspektera och redigera segmenteringar vid behov med segmenteringseditorn (figur 4-3)
Anmärkning: om segmenteringsprocessen inte ger tillfredsställande resultat, manuellt ta bort bilder i databasmappen och även ta bort "segmentera resultat" nod i Metamodel vy. Upprepa sedan steg 7,4 och 7,5. Om segmenteringen av endast en liten delmängd av bilder inte ger tillfredsställande resultat, sedan använda Nessys fristående program (se länken i 7,4), försök segmentering på "felaktiga bilder" och ersätta motsvarande fil i databasmappen). - Segmentera mönstret autofluorescence signal med hjälp av den grundläggande segmenteringsmodulen (figur 4-4)
- Ange ett prefix ("mönster" till exempel) som ska användas för att namnge de genererade segmenterade bilderna.
- Välj den kanal som innehåller autofluorescenssignalen.
- Tillämpa brusreducering; vanligtvis med ett Gaussiskt filter med en kernel-storlek på 10 x 10 x 0,5 voxels ger tillfredsställande resultat.
- Ställ in det undre tröskelvärdet så att bakgrunden visas i blått medan förgrundsbilden visas som vit. Ange också den övre tröskeln till sitt maximala värde för att undvika att höga intensiteter utesluts från slutresultatet (röda områden).
- Välj hoppa över för det sista steget.
- Klicka på Slutför och vänta tills alla bilder bearbetas.
- När det gäller kärnor, segmentering resultat kan nu visuellt inspekteras och korrigeras om det behövs med hjälp av segmentering redaktör modul (figur 4-5).
- Skapa kärnor-objekt och beräkna grundläggande objekt funktioner.
- Starta modulen inneboende funktioner från aktivitetsfältet till vänster om huvudgränssnittet (bild 4-6).
- Stäng ellipsoid-montören och Surface Extractor -panelerna för att bara hålla panelen grundläggande funktioner öppen.
- Välj Nucleus som objekttyp och välj prefixet som anges i steg 7,4 för "segmenterade bilder".
- Tryck på Compute och vänta tills alla bilder har bearbetats.
Obs: efter detta steg, kommer det inte att vara möjligt att redigera kärnor segmenteringar igen.
- Skapa mönster objekt och beräkna grundläggande objekt funktioner. Upprepa steg 7.8.1 till 7.8.4, men den här gången väljer du Anpassad typ som objekttyp och prefixet som anges i steg 7.6.1 för segmenterade bilder.
ANMÄRKNINGAR: efter det här steget kommer det inte att vara möjligt att redigera mönster segmenteringar igen. - Lagra namnet på bilden som varje kärna tillhör som ett Nucleus-attribut.
- Klicka på Data ≫ nytt attribut och välj Nucleus i popup-dialogrutan och klicka på OK.
- Välj samla in data från andra objekt som är anslutna till noden och klicka på Nästa.
- I den vänstra panelen väljer du bild och dubbelklickar sedan på förhörs markeringen under flaggan Slutför på panelen Sök vägs definition för att ange bildnoden som mål för banan.
- Expandera fönstret tillgängliga attribut i den vänstra panelen och välj attributet Name .
- Expandera åtgärdsfönstret för reducering och välj Skaffa ett, klicka sedan på knappen ändra och klicka på Nästa.
- Skriv "bild namn", tryck på TAB-tangenten och klicka på OK.
- Skapa ett "normaliserat koordinat"-attribut i kärnor-objekt (figur 4-7).
- Anpassa steg 7.10.1 till 7.10.6 för att lagra koordinaterna för mönstret axelcentroid som ett Nucleus-attribut. Namnge det nya attributet "Mönsterkoordinat".
- Klicka sedan på Data ≫ nytt attribut, Välj Nucleus och klicka på OK.
- Välj definiera en funktion mellan rumsliga eller riktade vektorer för noden och klicka på Nästa.
- För typ av funktion Välj array operation, för v1 Välj objekt vektor och sedan Centroid, och för v2 Välj objekt vektor och sedan mönster samordnandee.
- Klicka på Nästa, skriv "Normalised koordinat" i fältet namn och klicka på Slutför.
- Exportera data till en tabbavgränsad värde fil.
8. R-analys
- Hämta och installera RStudio.
Obs: programvaruinformation och nedladdningslänkar finns på https://www.rstudio.com/. - Hämta de R-skript som krävs för den här analysen.
Obs: skript kan laddas ner från GitLab repository: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr. - Öppna RStudio.
Om du kör skripten för första gången installerar du de nödvändiga R-paketen (ggplot2 och skalor). - Från RStudio, öppna binnedmap_template. R-skript.
- Ange arbetskatalogen till källfilens plats.
- Följ instruktionerna i skriptet för att anpassa skriptet till en given datauppsättning för att få rumsliga kartor som visas i figur 5.
- Kör skriptet för att generera densitet kartor.
Representative Results
Den foto-Patterning metod som beskrivs här gör det möjligt att exakt organisera odlade celler i kolonier av definierade former och storlekar. Framgången för detta förfarande bör tydligt framgå omedelbart efter det att cellen seedning förfarande (steg 3,7) som vidhålla celler kommer Cluster enligt photomasken design som visas i figur 2A. Vid 1 h efter cell sådd, individuella mönster får inte helt konfluenta (endast ett fåtal celler per mönster), men, som cellerna förökar sig med tiden, mönster kommer att bli helt koloniserade med endast mycket få celler utanför limytorna (figur 2b). Det exakta utseendet på kulturen kommer att vara cellinsberoende. Till exempel, mESC form kupade-formade kolonier10. Ett chip där mönkning inte är klart 1 till 2 h efter cell sådd indikerar fel i ingreppet (figur 2C, d).
Stora och tjocka kolonier kan ibland vara utmanande att fläcka homogent. Vi föreslår att fixa och permeabilize cellerna i ett steg (avsnitt 4) eftersom detta kan förbättra antikropps inträngning29. Detta är skälet till att den valda fixativ lösningen innehåller ett rengöringsmedel. Figur 3 visar fluorescenssignalen som förväntas efter immunofärgning. Observera att ljusa Id1 positiva celler finns inom täta regioner (ljusa NPC regioner) av kolonierna (figur 3a). Tips som detta är användbara för att bedöma kvaliteten på antikropps färgning förfarande. Observera också att mikromönstren som skapats med den nuvarande tekniken är autofluorescent. Denna signal (figur 3a, B lämnade de flesta bilder) är användbar under analys stadiet för att rumsligt registrera kolonier med varandra och skapa de resultat som visas i figur 5. Den autofluorescence signalen är i allmänhet den ljusaste när provet är upphetsad med en 405 nm Laser och denna kanal bör lämnas utan färgning för detta ändamål. Figur 3 visar också hur cellerna är exakt begränsade på mönster av olika former.
Analysen av bild data utförs i PickCells, en fri och öppen källkod som utvecklats i vårt labb (Blin et al., under utarbetande). Denna programvara innehåller bildanalysmodulerna för att läsa och sortera konfokalbilder (figur 4-1), till segment (figur 4-2,4-4) och komminister segmenterade objekt (figur 4-3, 4-5), för att beräkna objekt funktioner som koordinater eller medel intensitet (figur 4-6) och för att exportera data (figur 4-7, 4-8). Viktigt, vi utvecklade en robust nukleär segmentering metod som kallas Nessys28 som är särskilt lämpad för täta och heterogena populationer av celler såsom celler som odlas på mikromönster (figur 3). Figur 4 -2 visar en representativ utgång av nessys modul där varje enskild cell är korrekt ges en unik färg identitet. Endast minimal redigering bör vara nödvändigt, men redigering är möjligt om användaren bestämmer så (figur 4-3). Slutligen PickCells ger ett antal visualiserings moduler för att visualisera data. Ett exempel ges i figur 4-6: en ringformad koloni återges i 3D där kärnor är färgkodade enligt deras position längs z-axeln. När analysen har validerats i Pickcell, kan data exporteras för att skapa de rumsliga kartorna i R med hjälp av de skript som finns tillgängliga på (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) som visas i figur 530.
Vi har nyligen visat att rumslig inneslutning av mesc på små (30 000 μm2) skiva eller ellips micropatterns guidar mönstrar av en subpopulation av celler som uttrycker mesodermala markör TBRA10. Således, för att illustrera vår metod här, frågar vi om mönkning av TBRA kan påverkas av BMP-signalering i större kolonier (90 000 μm2). Figur 5a visar att när mesc odlas på stora skiv mikromönster begränsas TBRA +-cellerna företrädesvis till utkanterna av mönstret (TBRA + densitetskarta), där den lokala CELLTÄTHETEN är den lägsta (se den blå kartan till vänster i figur 5a ). Denna mönkning av TBRA bekräftas av kartan över genomsnittlig TBRA-intensitet.
Dessa data visar att metoden kan avslöja sub-visuell information. Faktum är att från figur 3, visuell inspektion av en koloni är inte tillräckligt för att identifiera någon form av rumslig organisation i TBRA uttryck. Detta förklaras bland annat av den viktiga kolonin för kolonivariationer som kvantifieras och visas i den högra panelen i figur 5a.
Tekniken visar också att det inte finns några detekterbara mönster för Id1 (ett mål för BMP-signalering) som kan tyda på att T-mönster inte drivs av BMP-signalering i detta sammanhang.
Micropatterning gör det möjligt att tvinga kolonier att anta nästan alla önskade geometri. Detta är särskilt användbart för att förhöra hur systemet reagerar på olika geometrier. Vi kan till exempel resonera om att en morfogengradient byggs upp i mitten av kolonin, vilket skapar ett hål i kolonin som skulle störa denna gradient. Intressant att vi fortfarande Observera mönstringen på en ring mikromönster om än på ett mindre robust sätt (Figur 5b).
Figur 1: översikt över metoden. Diagrammet som visar metodens huvudsteg. För varje steg anges den uppskattade tiden under namnet på uppgiften och en Schematisk illustration illustrerar syftet med proceduren. En hänvisning till en relevant siffra anges också när den finns tillgänglig. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kultur utseende 1 h och 48 h efter sådd cellerna på mikromönster. Brightfield bilder av mESC seedade på mikromönster. (a) förväntad cell organisation 1 h efter sådd bör mönstren vara tydligt identifierbara. (b) förväntat resultat efter 48 h kulturer. mESC har ökat och är fortfarande strikt begränsade till mönstret former. (c – d) Möjliga icke-optimala resultat, antingen mycket få celler följer plasten utom i utkanten av bilden (c) eller celler följer mellan mönstren (d). Se tabell 2 för en felsökningsguide. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa konfokalbilder av immunfärgade kolonier som odlas på mikromönster.
Representativa mESC-kolonier efter immunofluorescens för (a) Id1 och nukleär pore Complex eller (B) TBRA och LaminB1. För varje färgning, en koloni som odlas på en skiva mikromönster och en koloni som odlas på en ring micropattern visas. Enskilda kanaler tillhandahålls som gråskalebilder. Lägg märke till den tydliga Auto-Fluorescence signalen av micropattern (405 nm Laser excitation). Scale bar representerar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: flödesschema för bildanalys proceduren. En lista över 3D-konfokalbilder importeras till Pickcell för analys (1). Det här exemplet visar ett experiment med två distinkta former (skivor och ringar som i figur 2). Bild Namngivningskonventionen visas på vänster och PickCells gränssnitt till höger. Därefter används Nessys-modulen för att automatiskt segmentera kärnor (2). I skärmdumpen får varje enskild kärna en unik färg som indikerar exakt segmentering. Den autofluorescence av mönstret är också segmenterad, denna gång, med hjälp av "Basic segmentering" modul (4). Bakgrund visas i blått och vitt signalen kommer att definieras som mönstret form. Segmenterade former inspekteras visuellt för att säkerställa korrekt segmentering och redigerad om det behövs med segmenteringseditorn (3 – 5). Skärmbilderna visar konturerna för de identifierade formerna. De rosa och gula formerna har redigerats. Slutligen, objekt funktioner beräknas och exporteras till fil som senare bearbetas till R (6 – 7). En skärmdump av en koloni som återges som en 3D-vy tillhandahålls (6). För steg 2 till 6 ikoner som finns i PickCells gränssnitt vid skrivande stund denna artikel ges bredvid steg index. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat för två olika transkriptionsfaktorer och mikromönsterformer
Binned spatial karta för mESC odlas för 48 h på (a) skivformade mikromönster eller (B) ringformade mikromönster. För varje mikromönsterform visas kartan över celltäthet, oavsett cellfenotyp, till vänster med en blå färgskala. Sedan för varje markör (TBRA på den översta raden och Id1 på den nedersta raden), tre distinkta kartor tillhandahålls, från vänster till höger: cell densitet karta över markör uttrycker endast celler (tröskel baserad analys), kartan över den genomsnittliga markör intensitet (log2) och kartan över standardavvikelsen för markörens intensitet. Intensiteter ges som godtyckliga fluorescensenheter. För varje karta ges formen mikromönster som en vit kontur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| ECM-typ | Gelatin | Fibronektin | Basalmembran matris | |
| Koncentration | ECM-koncentrationen | 1 mg/mL | 20 μg/mL | 200 μg/mL |
| Poloxamer 407 koncentration | 500 μg/mL | 400 μg/mL | 1 mg/mL | |
| Testad med | mESC | Ja | Ja | Ja |
| mEpiSC | Nej | Ja | Ja | |
| Serum fritt medium | Nej | Ja | Ja |
Tabell 1: testade koncentrationer av poloxamer 407 och ECM. Denna tabell ger en översikt över koncentrationerna av ECM och poloxamer 407 som vi testade i vårt labb. För varje kombination av ECM/poloxamer 407, visas den celltyp för vilken mönstret har uppnåtts, samt om kulturen innehöll serum eller inte. mESC = mus embryonal stamcell, mEpiSC = mus epiblast stamceller.
| Förfarande | Observation | Möjliga problem | Lösning |
| Micropatterning | Lågt cell fäste | olämplig ECM/poloxamer 307 koncentrations förhållande | Öka koncentrationsförhållandet ECM/poloxamer 307 |
| Cell kopplingstid för kort | Öka inkubationstiden för att ge tillräckligt med tid till cellerna för att korrekt följa mönster (steg 3,4). För att optimera detta steg, kontrollera cellerna under ett Mikroskop kan hjälpa till att upptäcka en förändring i cellmorfologi som indikerar att cellerna har börjat att fästa. | ||
| Tvättar för intensiva (steg 3,6) | Vid byte av medium, Undvik pipettering medium direkt på spånorna. Istället försiktigt Pipettera mediet på väggarna i brunnen istället | ||
| Cellerna följer mönstren | olämplig ECM/poloxamer 307 koncentrations förhållande | Minska koncentrationsförhållandet ECM/poloxamer 407 | |
| Cell kopplingstid för lång | Minska inkubationstiden (steg 3,4). | ||
| Tvättningar ineffektiva (steg 3,6) | Skaka plattan kraftigt är oftast tillräckligt för att lossa cellerna i överskott. För celltyper som tenderar att fästa starkt vid spånan kan pipettering direkt på spånan förbättra resultatet. Att öka antalet tvättar kan också hjälpa, särskilt för att säkerställa att ingen cell förblir flytande i mediet efter detta steg. | ||
| Cellerna följer inte strikt mönster formen | "Inkompatibel" celltyp och mönster geometri | Planera/designa flera geometrier/storlekar som ska läggas in på photomasken för att kunna testa och identifiera den optimala mönster storleken för en given mönster form och celltyp. Vänligen se avsnittet "begränsningar" i diskussionen | |
| Icke-optimala foto-mönster, kan detta diagnostiseras genom att observera skärpan i autofluorescence signalen. Mönster gränser ska se skarpa ut som i Fig. 2. Om gränserna för mönstren suddiga sedan foto-mönstrar steg måste förbättras. | Suddiga mönster kanter indikerar att plast glaset inte var tillräckligt nära maskens yta under belysnings steget. Se till att bitarna som håller glasen på photomasken är jämna och att ett konstant och tillräckligt tryck appliceras på aggregatet under belysnings förfarandet. | ||
| Färgning | Icke-homogen färgning | inkubationstid för antikropp för kort | Öka inkubationstiden för antikroppar (upp till 24h vid rumstemperatur) |
| kolonierna tillplattade under monterings proceduren | Mount micropattern glider i en kammare som chamlide eller cytoo-kammare för att utföra både immunofärgning och avbildning utan att behöva montera cellerna. Detta kommer att bättre bevara kolonierna 3D-struktur. | ||
| Avlossa kolonier under infärgnings proceduren | Avfuktning av spånan | Lämna tillräckligt med medium eller Använd 2 pipetter, en för att ta bort mediet och den andra för att lägga till den nya lösningen | |
| Kolonier verkar klippas under mikroskopet | kolonier klipptes under monteringen av chip på mikroskopi Slide | Var mycket skonsam när du monterar spånorna. Alternativt, montera mikromönster glider i en kammare som chamlide eller cytoochambers att utföra både immunofärgning och avbildning utan att behöva montera cellerna. Detta bevarar också kolonin ultrastruktur. |
Tabell 2: felsökningsguide. Den här tabellen ger en översikt över möjliga suboptimala resultat. De potentiella källorna till problemen listas också tillsammans med rekommenderade lösningar.
Discussion
Här beskriver vi en metod för att analysera framväxande mönster i cellkulturer. En förenklad micropatterning metod används för att standardisera formen och storleken på cellkolonier, och vi presenterar bildanalys verktyg och R-skript som gör det möjligt att upptäcka och kvantifiera mönster inom dessa kolonier.
Den pipeline som vi föreslår liknar i viss mån en tidigare publicerad metod31 där författarna fokuserar på odlingsförhållanden, med användning av kommersiellt tillgängliga mikromönster, för att erhålla reproducerbara köns skikt bildning i ESC-kolonier för studie av tidiga gastrulationshändelser in vitro. Vårt mål är mer inriktat mot att tillhandahålla en generaliserbar pipeline för upptäckten av mönster bildning in vitro, där den kollektiva organisationen av cellerna endast kan bli uppenbar efter statistisk analys. Av denna anledning ger vi ett robust bildanalys arbetsflöde som möjliggör korrekt identifiering och analys av nukleär position i 3D-rymden över flera kolonier (se även "fördelen och begränsningarna av mönstret detektionsmetod" i denna diskussion). Vi bestämde oss också för att utveckla en enkel in-House micropatterning strategi som erbjuder ett mer flexibelt och billigare alternativ till kommersiellt tillgängliga lösningar på lång sikt som vi hoppas kommer att vara till nytta för samhället.
Slutligen noterar vi att under översynen av detta manuskript, ett nytt paket för analys av mönster in vitro-liknande våra R-skript har släppts32. Detta nya paket accepterar tabeller med cellfunktioner som indata som kan erhållas från hög genomströmning Imaging plattformar. Vi anser att tabellen över kärnfunktioner som genereras i steg 7 i vårt protokoll i princip kan fungera som ett bidrag till detta nya paket, även om vi inte har testat denna möjlighet själva.
Metodens anpassningsbarhet till andra celltyper och kolonigeometrier
Vi presenterar denna strategi i samband med att studera uppkomsten av mesodermala transkriptionsfaktorer i kulturer av pluripotenta celler i närvaro av serum. Metoden är dock lätt att anpassa till andra celltyper och till serum fria kulturer även om det kan vara nödvändigt att optimera ECM/poloxamer 407-koncentrationerna (se tabell 1 för testade koncentrationer och tabell 2 för en felsökningsguide). Metoden kan också anpassas till större eller mindre storlekar av mikromönster och till ett brett spektrum av former beroende på användarens behov. Men medan fastställandet av metoden, är det viktigt att vara medveten om att inte alla form/celltyp kombinationer är optimala. Till exempel, mesc Express höga nivåer av E-cadherin33,34 så att dessa celler att bilda kollektiva strukturer som spänner över områden som saknar ECM. Dessa celler följer inte strikt geometrier med skarpa vinklar eller som innehåller små hål i mönstret. Observera till exempel att på ringen av figur 3b, cellerna är i färd med att kolonisera det centrala området. I våra händer tvingar ett mindre centralt område inte mESC att bilda ringformade kolonier. Det är därför starkt rekommenderat att inkludera en mångfald av geometrier samtidigt utforma photomasken att kunna testa och identifiera de optimala storlekar och krökningar som kommer att vara lämpade för celltypen av val.
En annan viktig faktor att ta hänsyn till är längden på experimentet och spridningen frekvensen av cellerna. För vissa snabbt prolifererande celltyper (inklusive pluripotenta celler) kan det vara svårt att underhålla celler på mikromönster under många dagar (för mESC tre dagar är maximalt). Också, sådd av celler på mikromönster inte alltid sker optimalt för varje koloni, så det är lämpligt att utsäde ett överskott av kolonier för att få reservdelar.
Fördel och begränsningar av mönstret detektionsmetod
En särskild fördel med metoden är förmågan att detektera "genomsnittliga" mönster genom att kombinera bildanalys resultat från flera replikerande kolonier (figur 5). Detta kan avslöja mönster händelser som inte framgår av inspektion av enskilda kolonier. En nackdel med denna "medelvärdes strategi" är att det kan sakna vissa typer av repetitiva mönster, till exempel små fläckar eller smala ränder. Men dessa typer av mönster kan i stället avslöjas med en kombination av noggrant utvalda mönster storlekar8. Också, den bildanalys pipeline som beskrivs här ger kvantitativa data på både Single cell och Colony resolution erbjuder möjligheten att undersöka graden av Inter-Colony variation (figur 5) eller att utföra granne analys på flera vågar10.
En annan viktig fördel med medelvärdes metoden är att det ger möjlighet att kartlägga den förmånliga placeringen av många markörer utan att begränsas av tillgängliga fluoroforer av detekterings kanaler. Även om vi använder endast två markörer för differentiering i det arbete som presenteras här, kan förmågan att standardisera kolonier och extrahera "genomsnittliga" mönster göra det möjligt att jämföra fördelnings kartorna från olika grupper av kolonier tillsammans för att avslöja de generaliserade rumsliga relationerna mellan markörer och varandra.
Dessutom, även om vårt fokus här har varit att studera differentierings markörer, kan analysmetoden utökas för att studera andra biologiska processer för vilka nukleära markörer finns tillgängliga. Till exempel micropatterning av en cellinjer som innehåller en fluorescens ubiquitination cell cykel indikator35 (Fucci) skulle göra det möjligt att studera hur kolonin nivå geometri kan påverka cell cykel händelser i gruppen.
Framtida riktningar
Metoden är mottaglig för medelhög genomströmning bildanalys, dock, bild förvärv är för närvarande inte helt automatiserad och kan bli begränsande för mycket stora experiment. De regelbundna arrangemangen av kolonier bör göra det möjligt att skapa helt automatiserade förvärvs rutiner som liknar vad som har utvecklats för Single cell genomsnitt20. Men eftersom storleken på det fält som krävs för att bilden en koloni är stor, möjligen kräver mosaik, och eftersom kolonier är tredimensionella, är det mycket önskvärt att minska både dataset storlek och förvärvs tid genom avbildning endast relevanta kolonier. Därför kan framtida insatser ägnas åt att utveckla ett "intelligent" mikroskop som kan identifiera relevanta kolonier och anpassa bildkoordinaterna till varje prov. Detta kommer inte bara att minska tid och ansträngning utan också förhindra potentiella operatörs fördomar.
Analyspipelines kan också göras effektivare genom att minska antalet steg som användaren behöver ta. Vi har planer på att bygga en pipeline-byggningsmekanism och att integrera R direkt i vår programvara (se även frågor pickcells-API # 3 och pickcells-rjava # 1 i frågan Tracker i vår kod förråd [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fullständiga automatiseringen av analys proceduren kommer att minska tid och ansträngning och begränsa potentiella användarfel.
Slutligen, vi noterar att vår analysmetod ännu inte helt fånga den dynamiska karaktären av cellulära mönster. Viss begränsad dynamisk information kan extraheras genom att undersöka en tidsserie med ögonblicksbilder8,10,36. Men att kunna spela in cell populationens historia är mycket önskvärt om vi vill bättre förstå hur mönstret framträder. En begränsning är att korrekt spårning av enskilda celler i en 3D-tät cellpopulation förblir en mycket utmanande uppgift37. Vår cell detektionsmetod använder det nukleära kuvertet och presterar särskilt bra på täta och överlappande cellpopulationer28. Levande reportrar av det nukleära kuvertet är lätt tillgängliga28,38 och en fördel med micropatterning tekniken är att den kan användas för att förhindra att cellerna från att flytta utanför synfältet under långsiktig avbildning. Sammantaget är vi övertygade om att automatiserad spårning av celler kommer att kunna uppnås med hjälp av en kombination av nyligen etablerade verktyg28,39,40 och att detta bör ge nya insikter i de grundläggande principer för självorganisering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av en Sir Henry Wellcome post-doktors stipendium (WT100133 till G.B.), en Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA till S.L.), och en Wellcome Trust PhD Student Ship to (108906/Z/15/Z till D.W.). Vi är också tacksamma mot Dr Manuel thery för hans råd om att anpassa photopatterning teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
| 1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
| 5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
| Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
| Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
| Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
| Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
| Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
| CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
| Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
| Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
| Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
| Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
| mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
| NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
| PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
| PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
| Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
| Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
| Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
| Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |
References
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
- Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
- Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366 (2017).
- Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
- Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438 (2009).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).
- Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
- Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
- Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
- Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872 (2018).
- Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106 (2010).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
- Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).
- Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
- Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839 (2018).
- Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).
- Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
- McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).
