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Developmental Biology

Micropaterns और मात्रात्मक इमेजिंग का उपयोग कर Mammalian कोशिकाओं के उभरते स्थानिक संगठन मानचित्रण

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59634
Automatic Translation
1, 1, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, Institute for Stem Cell Research, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

Summary

यहाँ प्रस्तुत विधि मात्रात्मक इमेजिंग के साथ micropatterning का उपयोग करता है स्तनधारी संस्कृतियों के भीतर स्थानिक संगठन प्रकट करते हैं. तकनीक एक मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए आसान है और इन विट्रो में पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एक पथीय प्रणाली प्रदान करता है।

Abstract

जीव विज्ञान में एक मौलिक लक्ष्य को समझने के लिए कैसे पैटर्न विकास के दौरान उभरने है. कई समूहों ने दिखाया है कि पैटर्न इन विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है जब स्टेम सेल स्थानिक micropatterns पर सीमित कर रहे हैं, इस प्रकार प्रयोगात्मक मॉडल जो की पहचान करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान की स्थापना, इन विट्रो में, जैविक के मौलिक सिद्धांतों संगठन.

यहाँ हम पद्धति के अपने कार्यान्वयन का वर्णन. हम यह आसान एक मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में विधि स्थापित करने के लिए बनाने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता को कम करने के लिए एक फोटो-पैटर्निंग तकनीक अनुकूलित। हम भी एक मुक्त, खुला स्रोत और छवि विश्लेषण ढांचे को स्थापित करने के लिए आसान विकसित करने के लिए ठीक मानक आकार और आकार की कालोनियों के भीतर कोशिकाओं के उप आबादी की अधिमानी स्थिति को मापने के लिए. इस विधि यह भी कोशिकाओं के प्रतीत होता है अव्यवस्थित आबादी में पैटर्न घटनाओं के अस्तित्व को प्रकट करने के लिए संभव बनाता है. तकनीक मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और एक दिया पैटर्न प्रक्रिया पर, पर्यावरण के प्रभावों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, शारीरिक संकेत या अंतर्जात संकेतन), .

Introduction

स्तनधारी प्रणालियों में, पैटर्न कोशिकाओं के सामूहिक व्यवहार की एक आकस्मिक संपत्ति है और इसलिए, पैटर्न इन विट्रो में फार्म कर सकते हैं अगर उचित संकेत कोशिकाओं को प्रदान की जाती हैं1,2,3,4, 5 , 6. कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता को प्रकट करने का एक तरीका यह है कि कोशिकाओं को परिभाषित आकृतियों और आकारोंकेसमूह/ . एक तकनीक जो इस को सक्षम बनाती है वह माइक्रोपैटर्निंग11है । माइक्रोपैटर्निंग से उस स्थान को ठीक से परिभाषित करना संभव हो जाता है जहां सतह पर बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) अणु जमा किए जाते हैं। यह, बारी में जहां कोशिकाओं का पालन कर सकते हैं और इसलिए नियंत्रित करता है कि कैसे कोशिकाओं स्थानिक रूप से व्यवस्थित dictates.

माइक्रोपैटर्निंग कई अनुप्रयोगों के साथ एक तकनीक है, उदाहरण के लिए, micropatterning भेदभाव12से पहले प्रारंभिक स्थितियों के मानकीकरण सक्षम बनाता है. महत्वपूर्ण बात, micropaterning यह आसानी से आकार, आकार और सेल कालोनियों के अंतराल को नियंत्रित करने के लिए संभव बनाता है और इस संपत्ति morphogen या शारीरिक संकेतों के लिए कोशिकाओं की सामूहिक प्रतिक्रिया पूछताछ करने के उद्देश्य से प्रयोगों वसीयत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.

अनेक सूक्ष्मपैटर्न विधियों को11विकसित किया गया है . फोटोपैटर्न तकनीक शायद सबसे आसान तरीकेसे 18स्थापित कर रहे हैं . इन दृष्टिकोणों में परिशुद्धता का भी लाभ होता है क्योंकि उनका उपयोग एकल कोशिकाओं18,19,20के आकार को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है . हालांकि, वे भी एक स्पिन कोटर, एक प्लाज्मा कक्ष और एक UVO (यूवी-ओजोन) क्लीनर जो आम तौर पर मानक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं सहित महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता है. तकनीक को अपनाने की सुविधा के लिए, हम प्रोटोकॉल अनुकूलित केवल UVO दीपक की आवश्यकता है. हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्टिक स्लाइड जो कैंची के साथ या वांछित प्रारूप करने के लिए एक छेद पंच के साथ काटा जा सकता है से शुरू करते हैं।

माइक्रोपैटर्न की एक महत्वपूर्ण उपयोगिता कई प्रतिकृतिओं में अलग-अलग कालोनियों की तुलना करने के लिए कालोनियों के मानकीकरण की क्षमता है। यह यह पूछने के लिए संभव बनाता है कि इन कालोनियों के भीतर पैटर्न गठन किस हद तक पुन: उत्पादन योग्य है, और उन कारकों का पता लगाने के लिए जो पैटर्निंग प्रक्रिया की मजबूती को प्रभावित करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि कई मानकीकृत कालोनियों में "औसत" पैटर्न का परिमाणीकरण भी पैटर्निंग प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकता है जो अन्यथा स्पष्ट नहीं होगा। मानकीकृत कालोनियों पर पैटर्न की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने का लाभ प्रोटीन अभिव्यक्ति को सही ढंग से मापने में सक्षम होने पर निर्भर करता है, आदर्श रूप से एकल सेल स्तर पर। हालांकि, micropatterns पर कोशिकाओं अक्सर कसकर पैक कर रहे हैं, उन्हें उच्च सटीकता के साथ खंड करने के लिए मुश्किल बना. कक्ष भी अक्सर खुद को दो आयामों के बजाय तीन में व्यवस्थित करते हैं, और विभाजन के दौरान तीन-आयामी (3D) जानकारी का पता लगाना और उसे संरक्षित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है. एक बार कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित किया गया है, परिणामी डेटासेट से पैटर्न जानकारी निकालने के लिए अभिकलन विधियों की आवश्यकता होती है।

हमने इन समस्याओं को दूर करने में मदद करने के लिए विभाजन और छवि विश्लेषण उपकरण विकसित किए हैं। इस विश्लेषण विधि केवल स्वतंत्र और मुक्त स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है और कमांड लाइन या प्रोग्रामिंग को लागू करने के ज्ञान की आवश्यकता नहीं है. यहाँ विधि को समझाने के लिए हम माउस भ्रूणीय तने (एमईएस) कोशिकाओं का प्रयोग करते हैं जो स्वतः ही प्रारंभिक विभेदन ब्रैकीयूरी (टीबरा)21,22के मार्कर को व्यक्त करती हैं। जबकि कोई स्पष्ट स्थानिक व्यवस्था नेत्रहीन पता लगाने योग्य है, विधि कालोनियों में टी + कोशिकाओं की अधिमानी स्थिति के एक नक्शे के निर्माण की अनुमति देता है. हम यह भी बताते हैं कि Id1 व्यक्त कोशिकाओं की एक अधिमानी स्थानीयकरण के अभाव के साथ Tbra पैटर्न विरोधाभासों, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMP) मार्ग23का एक सीधा readout . हम भी विधि की वर्तमान सीमाओं पर चर्चा और कैसे इस तकनीक अन्य प्रयोगात्मक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Protocol

नोट: विधि का ओवरव्यू चित्र 1में प्रदान किया गया है।

1. मास्क डिजाइन

  1. Azioune एट अल में वर्णित दिशा निर्देशों के अनुसार photomask डिजाइन18. इस अध्ययन के लिए प्रयुक्त सॉफ्टवेयर और मुखौटा निर्माता के संदर्भ के लिए सामग्री तालिका देखें।
    नोट: एकाधिक geometries, आकार या आकार के बीच रिक्ति एक मुखौटा पर बनाया जा सकता है. यूवी लैंप एक 15 सेमी photomask जो 49 विभिन्न डिजाइनों (2 सेमी x 2 सेमी चिप्स मानते हुए) को शामिल कर सकते हैं फिट कर सकते हैं.

2. माइक्रोपैटर्न विनिर्माण प्रक्रिया

  1. आवश्यक सामग्री तैयार करें।
    1. फॉस्फेट बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) में 0.1% पोलोक्सामर 407 (10 मिलीग्राम 10 एमएल) का घोल तैयार करें और कमरे के तापमान पर शेकर पर छोड़ दें। पोलोक्सामर 407 को भंग होने में लगभग 20 मिनट का समय लगेगा।
    2. प्रयोगशाला फिल्म रखना (सामग्री की मेजदेखें) एक 10 सेमी वर्ग पेट्री पकवान के तल में. यह मैट्रिक्स जमाव के लिए कक्ष के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
    3. photomask की सतह को साफ करें, पहले 100% एसीटोन के साथ, फिर 100% आइसोप्रोपेनोल के साथ और अंत में डीडीएच2ओ के साथ। यदि संभव हो तो, हवा photomask सूखी या अन्यथा साफ कागज तौलिया के साथ मुखौटा सूखी.
    4. फोटोमास्क (बाद में 'धारक' के रूप में संदर्भित पर) के रूप में सटीक एक ही आकार के साथ प्लास्टिक का एक वर्ग, कठोर और अपारदर्शी टुकड़ा तैयार करें।
      नोट: यह रोशनी कदम के दौरान photomask के साथ संपर्क में प्लास्टिक coversps बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    5. पर UVO दीपक मुड़ें और 10 मिनट के लिए एक वार्मिंग रोशनी चलाते हैं.
  2. फोटोपैटर्न चिप्स बनाएँ।
    नोट: यह किसी भी वांछित आकार के चिप्स बनाने के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए संभव है। सादगी के लिए, हम यहाँ एक 12 मिमी दौर micropaterned चिप उत्पन्न करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन.
    1. एक 12 मिमी छेद पंच का उपयोग करना, हाइड्रोफोबिक प्लास्टिक स्लाइड में कटौती 12 मिमी दौर coverslips बनाने के लिए और उन्हें एक साफ नई पेट्री डिश में जगह है.
      चेतावनी: प्लास्टिक की सतह के साथ त्वचा संपर्क से बचने के लिए हर समय दस्ताने का उपयोग करें क्योंकि यह सतह उपचार को नुकसान पहुंचा सकता है।
    2. ध्यान से चितने के साथ कवरलिप्स से सुरक्षात्मक फिल्म को हटा दें।
      नोट: प्लास्टिक की सतह को नुकसान पहुंचाने से बचें क्योंकि यह बीज बोने की प्रक्रिया (अनुभाग 3) के दौरान चिप पर कोशिकाओं की नियुक्ति को प्रभावित कर सकता है।
    3. एक साफ और स्थिर सतह (उदा., photomask बॉक्स), क्रोम पक्ष का सामना करना पड़ पर photomask प्लेस, और वांछित चिप डिजाइन की स्थिति में डीडीएच2हे की एक 2 डिग्री एल ड्रॉप जोड़ें।
    4. डीडीएच2हे की बूंद पर एक कवरस्लिप रखें और धीरे से दबाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक की ओर जो photomask चेहरे पक्ष है जो फिल्म है कि पहले चरण में हटा दिया गया था द्वारा संरक्षित किया गया है.
    5. प्लास्टिक स्लाइड के शीर्ष पर धारक प्लेस और ध्यान से clamps के साथ इस सैंडविच को ठीक करने के क्रम में photomask के साथ संपर्क में प्लास्टिक के टुकड़े को बनाए रखने के लिए.
      नोट: clamps के रूप में संभव के रूप में प्लास्टिक स्लाइड के स्थान के लिए बंद रखें ताकि यह सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक स्लाइड पूरी तरह से photomask की सतह के साथ संपर्क में बनाए रखा जाता है.
    6. प्रकाश स्रोत से लगभग 2 सेमी पर UVO दीपक में विधानसभा प्लेस और 10 मिनट के लिए रोशन.
      नोट: जब चिप को स्रोत से 2 बउ की दूरी पर रखा जाता है तो प्रकाश की विद्युत 6 उडधधब2 2 पर 254 दउ तरंगदैर्घ्य होने का अनुमान है।
    7. नीचे photomask के साथ सैंडविच पकड़ो और ध्यान से clamps हटा जबकि एक हाथ से दबाव बनाए रखने के लिए के बारे में जाने से रोकने के लिए, जबकि सैंडविच disassembling. धारक निकालें, यह सुनिश्चित करना है कि सभी प्लास्टिक के टुकड़े मुखौटा पर अब भी कर रहे हैं और धारक के लिए अटक नहीं.
    8. चिप्स के ऊपर डीडीएच2ओ डालें और चिप्स को फोटोमास्क से धीरे-धीरे अलग कर लें।
      नोट: यदि प्लास्टिक चिप photomask करने के लिए अटक गया है, चिप एक प्लास्टिक pippette टिप का उपयोग कर चिप को अलग करते हुए चिप के मामले में चिप detaches अचानक ऊपर चिमटी पकड़े.
    9. अंत में, मैट्रिक्स जमाव कक्ष के भीतर photopatterned चिप्स जगह है.
      नोट: सुनिश्चित करें कि चिप के प्रबुद्ध पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
  3. मैट्रिक्स जमा करें.
    नोट: इस खंड में सभी प्रक्रिया एक ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए.
    1. एक 0.22 डिग्री m polyethersulfone (PES) फिल्टर के माध्यम से poloxamer 407 समाधान फ़िल्टर करें।
    2. 500 ग्राम/एमएल बाँझ फ़िल्टर्ड पोलोक्सामर 407 और 1 मिलीग्राम/एमएल जिलेटिन के मिश्रण से ईसीएम कोटिंग समाधान तैयार करें।
      नोट: अन्य संभावित ECM अणुओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए तालिका 1 भी देखें।
    3. प्रत्येक प्रबुद्ध चिप पर कोटिंग समाधान के 200 डिग्री एल जोड़ें। प्रयोगशाला फिल्म चिप के बाहर गिरने से ड्रॉप को रोकने जाएगा.
    4. वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए डी डी एच2ओ से भरा 3 सेमी पेट्री डिश जोड़ें और इसे चिप के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. सीडिंग प्रक्रिया

नोट: नीचे वर्णित चरणों CGR8 माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है (MESC)24 मानक एमईएससी माध्यम का उपयोग कर (सामग्री की तालिकाभी देखें). हालांकि, यह सिद्धांत रूप में किसी भी सेल प्रकार के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए संभव है। यह भी ध्यान दें कि माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की पारंपरिक कोशिका संस्कृति का वर्णन यहाँ नहीं किया गया है क्योंकि विस्तृत प्रलेखन कहीं और25पाया जा सकता है .

  1. कोटिंग समाधान को प्रेरित करें और बाँझ पीबीएस के साथ कम से कम 5 मिनट के लिए चिप्स को दो बार इनक्यूबेट करें।
  2. इस बीच, गर्म माध्यम में 5.5 x 105 कोशिकाओं/एमएल का एक सेल निलंबन तैयार करें।
  3. प्रत्येक चिप पर सेल निलंबन के पाइप 200 $L ($100,000 कोशिकाओं /
  4. बीज कक्ष को बंद करें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 1 एच के लिए पालन करने के लिए छोड़ दें।
  5. 1 ज के बाद, एक मल्टीवेल प्लेट (4-वेल या 24-वेल प्लेट के कुओं को चिप्स की संख्या के आधार पर भरें) 500 डिग्री सेल्सियस/
  6. प्लेट को जोरदार ढंग से हिलाएं ताकि गैर-अनुकूल कोशिकाओं को अलग किया जा सके। मध्यम को प्रेरित करें और तुरंत ताजा गर्म माध्यम के साथ बदलें। सूक्ष्मदर्शी के नीचे जांचकर यह पता लगाने के लिए कि पैटर्निंग दिखाई देती है या नहीं (चित्र 2क)
    नोट: एमईएससी या अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन के अलावा अन्य सेल लाइनों का उपयोग करते समय आवृति समय ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है (तालिका 2देखें)।
  7. इस चरण को तब तक दोहराएँ जब तक कि चित्र 2कमें दर्शाए अनुसार प्रतिमान स्पष्ट रूप से दिखाई न दें.
    नोट: यह चरण महत्वपूर्ण है और प्रक्रिया की सफलता निर्धारित करता है। एक धोने की प्रक्रिया जो बहुत तीव्र है कोशिकाओं को अलग कर सकती है, इसके विपरीत अपर्याप्त धुलाई के परिणामस्वरूप प्रतिमाओं के बीच में संलग्न कोशिकाओं का परिणाम हो सकता है (चित्र 2ग,डी)।

4. निर्धारण

नोट: संस्कृति में 48 एच के बाद कोशिकाओं घने कालोनियों जो कड़ाई से पैटर्न के आकार का पालन करना चाहिए (जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है).

  1. थाली में चिप्स छोड़कर, मध्यम के 90% $ निकालें, बस पर्याप्त माध्यम छोड़ने के लिए सुखाने से चिप्स को रोकने के.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि चिप कभी नहीं सूखता है धुंधला कलाकृतियों से बचने के लिए और सतह से सेल टुकड़ी को रोकने के लिए. चिपकने वाला पैटर्न के बीच चिप सतह की हाइड्रोफोबिकता के कारण, चिप de-wet करने के लिए एक प्रवृत्ति हो सकती है। इस स्तर पर, स्थिर बड़ी गुंबदवाली कालोनियों चिप से अलग करने के लिए कारण हो सकता है. Washes बहुत कोमल होना चाहिए, आदर्श अच्छी तरह से और नहीं सीधे चिप पर तरल pipeting द्वारा प्रदर्शन किया.
  2. पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के कम से कम 500 जेडएल को अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट के अनुसार आधारित निर्धारण समाधान जोड़ें।
    नोट: कालोनियों विशेष रूप से मोटी (5 से अधिक सेल परतों) दिखाई देते हैं, तो यह 20 मिनट के लिए निर्धारण समय को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. निर्धारण के बाद, धोने के समाधान के साथ 3 बार धो लें (0.01% poloxamer 407 के साथ पीबीएस). धुलाई समाधान में पतला 50 एम एम एनएच4सीएल का उपयोग करके एक अतिरिक्त धोने को अवशिष्ट पीएफए क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि को बुझाने के लिए इंटरकेलाटेड किया जा सकता है।
  4. समाधान को अवरुद्ध करने में कम से कम 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस स्तर पर, नमूने धुंधला करने से पहले के बारे में एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि हां, तो वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ थाली सील.

5. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. एक 10 सेमी वर्ग पेट्री डिश के नीचे में प्रयोगशाला फिल्म की एक चादर रखकर एक धुंधला कक्ष तैयार करें।
  2. एंटीबॉडी समाधान तैयार करें (इस लेख में उपयोग किए गए एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने की सूची के लिए तालिका 3 देखें)।
  3. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं का समर्थन पक्ष के साथ धुंधला कक्ष में चिप प्लेस और तुरंत चिप पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
    चेतावनी: इस स्तर पर, चिप्स आसानी से कदम 4.1 में के रूप में गीला नहीं करना चाहिए. हालांकि, देखभाल अभी भी लिया जाना चाहिए क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि चिप्स सूखी नहीं है. यदि एकाधिक चिप्स संसाधित करने के लिए है, तो चरण 5.3 क्रमिक रूप से प्रत्येक चिप के लिए लागू होते हैं।
  4. कमरे के तापमान पर एक घूर्णन मंच पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: यदि कोशिकाओं ने बड़ी 3D संरचनाओं का गठन किया है, तो नमूने के समान धुंधला करने की अनुमति देने के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है। इनक्यूबेशन समय को 24 ज तक बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, धुंधला कक्ष में पानी से भरा एक 3 सेमी पकवान होना चाहिए और धुंधला कक्ष वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील किया जाना चाहिए।
  5. चिप्स को एक ताजा मल्टीवेल प्लेट में स्थानांतरित करें और धोने के घोल के साथ 3 बार धोएं।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन प्रदर्शन के रूप में चरण 5.3 और 5.4 में वर्णित है.
  7. किसी भी मानक बढ़ते माध्यम (उदा., मोवीओल) के 20 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर चिप को माउंट करें।

6. इमेजिंग

नोट: इमेजिंग एक मानक confocal माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है. यहाँ हम केवल एक छवि गुणवत्ता जो बाद मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त हो जाएगा सुनिश्चित करने के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं.

चेतावनी: किसी भी ऑपरेटर पूर्वाग्रह से बचने के लिए, छवि के लिए कालोनियों केवल परमाणु लिफाफा संकेत का उपयोग कर चुना जाना चाहिए (एक कॉलोनी ठीक से पैटर्न के आकार का पालन करता है देखने के लिए)। माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का समायोजन करते समय छोड़कर ब्याज के मार्करों के संकेत की जाँच से बचें.

  1. सुनिश्चित करें कि प्राप्ति बिट गहराई 12 या 16 बिट्स है।
  2. प्रत्येक छवि चैनल के लिए डायनेमिक श्रेणी को अधिकतम करने के लिए उपयुक्त सेटिंग्स की पहचान करें। विशेष रूप से, छवि कतरन से बचें.
  3. माइक्रोपैटर्न ऑटोफ्लोरेसेंस की छवि बनाने के लिए एक चैनल शामिल करें (चित्र 3देखें)।
  4. x- और y-axes में 0.1 और 0.6$m के बीच लेकर voxel आकार प्राप्त करने के लिए छवि आकार और ज़ूम कारक समायोजित करें और z-अक्ष में 0.2 और 2 $m के बीच लेकर।
    नोट: उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, हम एक उल्टे स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप एक 40x उद्देश्य के साथ इस्तेमाल किया (संख्यात्मक एपर्चर 1.3 के बराबर), डिजिटल ज़ूम के बिना 1024 x 1024 पिक्सल की एक छवि आकार और 0.5 डिग्री के एक z-चरण आकार. इसके परिणामस्वरूप 0ण्38 उ x 0ण्38 उ x 0ण्5 उ का वोसेल आकार हुआ।
  5. प्रत्येक कॉलोनी के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरी कॉलोनी का अधिग्रहण किया गया है, z-अक्ष के साथ न्यूनतम और अधिकतम स्थिति को परिभाषित करें। कम से कम कोई संकेत के लिए कम के साथ एक विमान के नीचे और कॉलोनी के ऊपर शामिल किया जाना चाहिए.
  6. सुनिश्चित करें कि z-स्टैक ओरिएंटेशन ्सरकेल प्राप्त किए जाते हैं (या तो हमेशा ऊपर से नीचे या हमेशा नीचे से ऊपर)
  7. छवि गुणवत्ता और इमेजिंग समय के बीच एक इष्टतम की पहचान करने के लिए स्कैनिंग गति, छवि संकल्प, फ्रेम औसत, और डिटेक्टर लाभ समायोजित करें। एक संकेत के रूप में, चित्र 3 में दर्शाए अनुसार एक उपनिवेश के लिए इमेजिंग समय लगभग 2-3 न्यूनतम था। छवि अर्जन को निष्पादित करें।
    चेतावनी: सभी छवियों, क्रम में तुलनीय होने के लिए, एक ही उद्देश्य और अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ एक ही माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया जाना चाहिए.
  8. अधिग्रहण के अंत में, सभी छवियों को बचाने और प्रत्येक छवि का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रयोगात्मक स्थिति की पहचान करने के लिए एक अद्वितीय नामकरण कन्वेंशन आवंटित.
    नोट: चित्र 4 एक उदाहरण के रूप में देखें, इस कन्वेंशन बाद में विश्लेषण प्रक्रिया के दौरान उपयोग किया जाएगा। ध्यान दें कि छवियों BioFormats 26द्वारा समर्थित है जो किसी भी स्वरूप में सहेजा जा सकता है। यदि कालोनियों को देखने के क्षेत्र से बड़ा कर रहे हैं, ImageJ की सिलाई प्लगइन27इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी ध्यान दें कि सिलाई के मामले में, रोशनी रोल बंद सुधार आवश्यक हो सकता है।

7. छवि विश्लेषण

नोट: इस कार्यविधि के लिए अनुशंसित कंप्यूटर विनिर्देशों है: 16 GB RAM, एक बहु-कोर 3.33 GHz CPU, और कम से कम 50 GB डिस्क स्थान (या अधिक चिप्स छवि किया गया है की संख्या के आधार पर)। सॉफ्टवेयर लिनक्स, विंडोज और MacOS पर परीक्षण किया गया है। PickCells जटिल बहुआयामी छवियों में कोशिकाओं के सामूहिक संगठन के विश्लेषण के लिए समर्पित एक ग्राफिक यूजर इंटरफेस के साथ एक पार मंच छवि विश्लेषण अनुप्रयोग है (Blin एट अल, तैयारी में). ध्यान दें कि PickCells पर अधिक जानकारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट यहाँ उल्लेख मॉड्यूल के लिए प्रलेखन ऑनलाइन पाया जा सकता है: https://pickcellslab.frama.io/docs/. यह भी ध्यान दें कि इंटरफ़ेस परिवर्तन के अधीन है के रूप में हम सॉफ्टवेयर में सुधार रखने के. इंटरफ़ेस क्या आंकड़ा या वीडियो में दिखाया गया है से अलग है, तो कृपया देखें ऑनलाइन मैनुअल.

  1. स्थापित करें और ऑनलाइन उपलब्ध दस्तावेज़ के बाद PickCells चलाएँ।
  2. छवियों को आयात करें और प्रदान की गई जानकारी की सटीकता की जाँच करें (चित्र 4-1)।
  3. प्रत्येक चैनल का नाम दस्तावेज़ करें.
  4. खंड नाभिक नेसिस मॉड्यूल28 का उपयोग कर परमाणु लिफाफा संकेत के आधार पर (चित्र 4-2) और एक उपसर्ग प्रदान ("नाभिक" उदाहरण के लिए) जो उत्पन्न खंडित छवियों के नाम के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: उपयोग और पैरामीटर समायोजन के बारे में दस्तावेज़https://framagit.org/pickcellslab/nessys पर पाया जा सकता है।
  5. निरीक्षण और विभाजन यदि आवश्यक हो तो संपादित करें, विभाजन संपादक मॉड्यूल का उपयोग कर (चित्र 4-3)
    नोट:: किसी भी कारण के लिए विभाजन प्रक्रिया संतोषजनक परिणाम प्रदान नहीं किया है, तो मैन्युअल रूप से डेटाबेस फ़ोल्डर में छवियों को हटाएँ और भी MetaModel दृश्य में 'विभाजन परिणाम' नोड हटाएँ। फिर, चरण 7.4 और 7.5 दोहराएँ. छवियों का केवल एक छोटा सबसेट के विभाजन संतोषजनक परिणाम प्रदान नहीं किया है, तो उसके बाद Nessys स्टैंडअलोन अनुप्रयोग का उपयोग करें (7.4 में लिंक देखें), 'गलत छवियों' पर विभाजन का प्रयास करें और डेटाबेस फ़ोल्डर में इसी फ़ाइल को प्रतिस्थापित)
  6. मूल विभाजन मॉड्यूल का उपयोग करके पैटर्न ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को विभाजित करें (चित्र 4-4)
    1. एक उपसर्ग ("पैटर्न" उदाहरण के लिए) प्रदान करें जिसका उपयोग जेनरेट किए गए सेगमेंट किए गए चित्रों को नाम देने के लिए किया जाएगा.
    2. स्वत: प्रवाह संकेत युक्त चैनल का चयन करें.
    3. शोर में कमी लागू करें; आम तौर पर 10 x 10 x 0.5 voxels के एक कर्नेल आकार के साथ एक gausian फिल्टर का उपयोग संतोषजनक परिणाम देता है.
    4. अग्र सीमा सेट करें ताकि अग्रभूमि सफेद दिखाई देते समय पृष्ठभूमि नीले रंग में दिखाई दे. अंतिम परिणाम (लाल क्षेत्रों) से बाहर रखा जा रहा उच्च तीव्रता से बचने के लिए भी अपने अधिकतम मान के लिए ऊपरी सीमा सेट करें।
    5. अंतिम चरण के लिए छोड़ें का चयन करें.
    6. क्लिक करें खत्म और सभी छवियों को संसाधित कर रहे हैं जब तक प्रतीक्षा करें.
  7. न्यूक्लिय के लिए के रूप में, विभाजन परिणाम अब नेत्रहीन निरीक्षण किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो विभाजन संपादक मॉड्यूल का उपयोग कर सही (चित्र 4-5)।
  8. नाभिक वस्तुओं बनाएँ और बुनियादी वस्तु सुविधाओं की गणना.
    1. मुख्य इंटरफ़ेस के बाईं ओर कार्य पट्टी से आंतरिक सुविधाओं मॉड्यूल लॉन्च करें (चित्र 4-6)।
    2. केवल मूल सुविधाएँ पैनल खुला रखने के लिए दीर्घवृत्त भंताभ और सतह चिमटा पैनल बंद करें।
    3. ऑब्जेक्ट प्रकार के रूप में न्यूक्लियस चुनें और "खंडित छवियों" के लिए चरण 7.4 में दिए गए उपसर्ग चुनें.
    4. प्रेस कम्प्यूट और सभी छवियों को संसाधित किया गया है जब तक प्रतीक्षा करें.
      नोट: इस चरण के बाद, नाभिक विभाजनों को फिर से संपादित करना संभव नहीं होगा।
  9. प्रतिमान ऑब्जेक्ट बनाएँ और मूल ऑब्जेक्ट सुविधाएँ परिकलित करें. 7.8.1 से 7.8.4 तक चरण दोहराएँ, केवल इस बार कस्टम प्रकार को ऑब्जेक्ट प्रकार के रूप में और विभाजित छवियोंके लिए चरण 7.6.1 में दिए गए उपसर्ग का चयन करें.
    नोट: इस चरण के बाद, यह पैटर्न विभाजन फिर से संपादित करने के लिए संभव नहीं होगा।
  10. छवि का नाम स्टोर प्रत्येक नाभिक एक नाभिक विशेषता के रूप में संबंधित है.
    1. डेटा पर क्लिक करें और नई विशेषता का चयन करें पॉपअप संवाद में न्यूक्लियस का चयन करें और क्लिक करें .
    2. नोड से कनेक्ट अन्य ऑब्जेक्ट्स से डेटा एकत्रित करें का चयन करें और अगलाक्लिक करें.
    3. बाएँ फलक में, छवि का चयन करें और फिर छवि नोड को पथ के लक्ष्य के रूप में सेट करने के लिए पथ परिभाषा फलक में समाप्त ध्वज के अंतर्गत पूछताछ चिह्न पर डबल क्लिक करें.
    4. बाएँ फलक पर उपलब्ध विशेषताएँ फलक का विस्तार करें और नाम विशेषता का चयन करें।
    5. रिडक्शन कार्रवाई फलक विस्तृत करें और एक प्राप्त करेंका चयन करें, फिर परिवर्तन बटन पर क्लिक करें और अगलाक्लिक करें.
    6. "छवि नाम" लिखें, टैब कुंजी दबाएँ और ठीकक्लिक करें.
  11. नाभिक वस्तुओं में एक "सामान्यीकृत निर्देशांक" विशेषता बनाएँ (चित्र 4-7)।
    1. 7.10.1 से 7.10.6 के लिए एक नाभिक विशेषता के रूप में पैटर्न centroid के निर्देशांक स्टोर करने के लिए चरणों अनुकूलन. इस नई विशेषता "पैटर्न निर्देशांक" को नाम दे.
    2. फिर, डेटा पर क्लिक करें और नईविशेषता, न्यूक्लियस का चयन करें और ठीकक्लिक करें.
    3. नोड के स्थानिक या दिशात्मक सदिशों के बीच किसी फ़ंक्शन को परिभाषित करें का चयन करें और अगलाक्लिक करें.
    4. फ़ंक्शन के प्रकार के लिए Array Operationका चयन करें, V1 के लिए आइटम वेक्टर का चयन करें और फिर Centroidका चयन करें, और V2 के लिए आइटम वेक्टर का चयन करें और फिर पैटर्न समन्वयई.
    5. अगलाक्लिक करें, नाम फ़ील्ड में "सामान्यीकृत समन्वय" लिखें और समाप्त करें क्लिक करें.
  12. डेटा को टैब से अलग की गई मान फ़ाइल में निर्यात करें.

8. आर विश्लेषण

  1. डाउनलोड करें और Rstudio स्थापित करें।
    नोट: सॉफ़्टवेयर जानकारी और डाउनलोड लिंक https://www.rstudio.com/ पर उपलब्ध हैं।
  2. इस विश्लेषण के लिए आवश्यक R स्क्रिप्ट डाउनलोड करें।
    नोट: लिपियों GitLab भंडार से डाउनलोड किया जा सकता है: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
  3. Rstudio खोलें.
    नोट: पहली बार स्क्रिप्ट चला रहे हैं, तो आवश्यक R पैकेज (ggplot2 और स्केल) स्थापित करें।
  4. Rstudio से, binnedmap-template खोलें। आर स्क्रिप्ट.
  5. कार्य निर्देशिका को स्रोत फ़ाइल स्थान पर सेट करें.
  6. चित्र 5में दर्शाए अनुसार स्थानिक मानचित्रों को प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट को किसी दिए गए डेटासेट में अनुकूलित करने के लिए लिपि में दिए गए निर्देशों का पालन करें .
  7. घनत्व नक्शे उत्पन्न करने के लिए स्क्रिप्ट चलाएँ.

Representative Results

यहाँ वर्णित फोटो-पैटर्निंग विधि परिभाषित आकृतियों और आकारों की कालोनियों में सुसंस्कृत कोशिकाओं को व्यवस्थित करना संभव बनाती है। इस प्रक्रिया की सफलता को कोशिका बीजन प्रक्रिया (चरण 3-7) के तुरंत बाद स्पष्ट रूप से स्पष्ट किया जाना चाहिए क्योंकि कापालन कक्ष चित्र 2कमें दर्शाए अनुसार फोटोमास्क डिजाइन के अनुसार क्लस्टर होंगे। सेल बोने के बाद 1 एच पर, व्यक्तिगत पैटर्न पूरी तरह से confluent नहीं हो सकता है (केवल पैटर्न प्रति कुछ कोशिकाओं), हालांकि, के रूप में कोशिकाओं को समय के साथ proliferate, पैटर्न चिपकने वाला सतहों के बाहर केवल बहुत कुछ कोशिकाओं के साथ पूरी तरह से उपनिवेश हो जाएगा (चित्र 2b). संस्कृति की सटीक उपस्थिति सेल लाइन निर्भर हो जाएगा. उदाहरण के लिए, एमईएससी गुंबददार आकार की कालोनियों10रूप में। एक चिप जहां सेल सीडिंग के बाद पैटर्न 1 से 2 एच स्पष्ट नहीं होता है, प्रक्रिया की विफलता को इंगित करता है (चित्र 2ग, घ) ।

बड़े और मोटी कालोनियों कभी कभी सजातीय दाग के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. हम एक चरण में कोशिकाओं को ठीक करने और permeabilize करने का सुझाव देते हैं (खंड 4) के रूप में यह एंटीबॉडी प्रवेश29में सुधार कर सकते हैं. यही कारण है कि चुना fixative समाधान एक डिटर्जेंट शामिल है. चित्र ााालु3 में फ्लोरोसेंट संकेत दिखाया गया है जो इम्यूनोस्टेनिंग के बाद अपेक्षित होता है। ध्यान दीजिए कि ब्राइट इद1 सकारात्मक कोशिकाएं कालोनियों के घने क्षेत्रों (ब्राइट एनपीसी क्षेत्रों) में पाई जाती हैं (चित्र 3क) इस तरह के रूप में संकेत एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रिया की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयोगी होते हैं। यह भी ध्यान दें कि वर्तमान तकनीक के साथ बनाए गए माइक्रोपैटर्न ऑटोफ्लोरेसेंट हैं। यह संकेत (चित्र 3क, बी अधिकांश छवियों को छोड़ दिया) विश्लेषण चरण के दौरान उपयोगी है एक दूसरे के साथ स्थानिक रूप से पंजीकृत कालोनियों और चित्र 5में दिखाया परिणाम बनाने के लिए. autofluorence संकेत आम तौर पर प्रतिभाशाली है जब नमूना एक 405 एनएम लेजर के साथ उत्साहित है और इस चैनल इस उद्देश्य के लिए धुंधला बिना छोड़ दिया जाना चाहिए. चित्र 3 यह भी दर्शाता है कि कोशिकाएँ विभिन्न आकृतियों के प्रतिमानों पर किस प्रकार विवश होती हैं।

इमेजिंग डेटा का विश्लेषण PickCells में किया जाता है, एक स्वतंत्र और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर हमारी प्रयोगशाला में विकसित (Blin एट अल., तैयारी में). इस सॉफ्टवेयर को पढ़ने और सॉर्ट confocal छवियों के लिए छवि विश्लेषण मॉड्यूल शामिल हैं (चित्र 4-1), खंड करने के लिए ( चित्र4-2,4-4) और क्यूरेट खंडित वस्तुओं (चित्र 4-3,4-5), वस्तु की गणना करने के लिए निर्देशांक या औसत तीव्रता जैसी विशेषताएं (चित्र 4-6) और डेटा निर्यात करने के लिए (चित्र 4-7,4-8)। महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने नेसिस28 नामक एक मजबूत परमाणु विभाजन विधि विकसित की है जो विशेषरूप से कोशिकाओं की सघन और विषम आबादी के लिए उपयुक्त है जैसे कि माइक्रोपैटर्न्स पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं (चित्र 3)) । चित्र 4 -2 Nessys मॉड्यूल जहां प्रत्येक व्यक्ति सेल सही एक अद्वितीय रंग पहचान दी जाती है की एक प्रतिनिधि उत्पादन से पता चलता है. केवल न्यूनतम संपादन आवश्यक होना चाहिए, लेकिन संपादन संभव है उपयोगकर्ता तो तय करना चाहिए (चित्र 4-3) . अंत में PickCells डेटा कल्पना करने के लिए दृश्य मॉड्यूल के एक नंबर प्रदान करता है. चित्र4-6में एक उदाहरण दिया गया है: एक वलय-आकार की कॉलोनी 3D में प्रदान की जाती है जहाँ नाभिक को z-अक्ष के साथ उनकी स्थिति के अनुसार रंग-कोडेड किया जाता है। एक बार विश्लेषण PickCells में मान्य है, डेटा पर उपलब्ध लिपियों का उपयोग आर में स्थानिक नक्शे बनाने के लिए निर्यात किया जा सकता है (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) के रूप में चित्र 530में दिखाया गया है.

हमने हाल ही में दिखाया है कि छोटे (30,000 मी2) डिस्क या दीर्घवृत्त माइक्रोपैटर्नपरपर पर एमईएससी का स्थानिक परिरोध मध्याधर्ममार्कर टीबरा10को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की उपजनसंख्या के पैटर्न का मार्गदर्शन करता है . इस प्रकार, यहाँ अपनी विधि को समझाने के लिए, हम पूछते हैं कि क्या टीब्रा कापैटर्न बीएमपी सिग्नलिंग से बड़ी कालोनियों (90,000 डिग्री उ 2) से प्रभावित हो सकता है। चित्र 5क से पता चलता है कि जब एमईएससी बड़े डिस्क माइक्रोपैटर्न पर उगाया जाता है, तो टीब्रा+ कोशिकाओं को पैटर्न (टीब्रा+ घनत्व मानचित्र) की परिधि तक वरीयता से प्रतिबंधित किया जाता है, जहां स्थानीय कोशिका घनत्व सबसे कम होता है (चित्र 5क के बाईं ओर नीले मानचित्र को देखें) ). Tbra के इस पैटर्न मतलब Tbra तीव्रता के नक्शे से पुष्टि की है.

ये डेटा प्रदर्शित करता है कि विधि उप-दृश्य जानकारी प्रकट कर सकते हैं। वास्तव में, चित्र 3से, एक कॉलोनी के दृश्य निरीक्षण के लिए Tbra अभिव्यक्ति में स्थानिक संगठन के किसी भी रूप की पहचान करने के लिए पर्याप्त नहीं है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण कॉलोनी द्वारा कॉलोनी परिवर्तनशीलता के लिए समझाया गया है जो परिमाणित है और चित्र 5कके सबसे सही पैनल में दिखाया गया है।

तकनीक यह भी पता चलता है कि कोई डिटेक्टेबल पैटर्न Id1 के लिए मौजूद है (BMP संकेतन का एक लक्ष्य) जो संकेत हो सकता है कि टी पैटर्न इस संदर्भ में बीएमपी संकेतन द्वारा संचालित नहीं है.

माइक्रोपैटर्निंग कालोनियों को लगभग किसी भी वांछित ज्यामिति को अपनाने के लिए मजबूर करना संभव बनाता है। यह विशेष रूप से कैसे प्रणाली विभिन्न geometries के लिए प्रतिक्रिया पूछताछ करने के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, हम कारण हो सकता है कि अगर एक morphogen ढाल कॉलोनी के केंद्र में बनाता है, कॉलोनी में एक छेद बनाने के इस ढाल को बाधित करेगा. दिलचस्प बात यह है कि हम अभी भी एक अंगूठी माइक्रोपैटर्न पर पैटर्न का अवलोकन करते हैं यद्यपि कम मजबूत तरीके से (चित्र 5ख) ।

Figure 1
चित्र 1: विधि का ओवरव्यू. विधि के मुख्य चरणों को दर्शाने वाला आरेख. प्रत्येक चरण के लिए, कार्य के नाम के अंतर्गत अनुमानित समय इंगित किया जाता है और एक योजनाबद्ध प्रक्रिया के उद्देश्य को दर्शाता है. एक प्रासंगिक आंकड़ा के लिए एक संदर्भ भी उपलब्ध होने पर प्रदान की जाती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: संस्कृति उपस्थिति 1 ज और 48 एच micropatterns पर कोशिकाओं बोने के बाद. एमईएससी के ब्राइटफील्ड छवियों को माइक्रोपैटर्न पर बीज दिया जाता है। (क) बीज बोने के बाद अपेक्षित सेल संगठन 1 ज, पैटर्न स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य होना चाहिए। (ख) संस्कृतियों के 48 ज के बाद अपेक्षित परिणाम। एमईएससी बढ़ गया है और अभी भी सख्ती से पैटर्न आकार तक ही सीमित हैं। (सी-डी) संभावित गैर इष्टतम परिणाम, या तो बहुत कुछ कोशिकाओं स्लाइड (ग) की परिधि को छोड़कर प्लास्टिक का पालन करें या कोशिकाओं पैटर्न (घ) के बीच में पालन करें। समस्या निवारण मार्गदर्शिका के लिए तालिका 2 देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइक्रोपैटर्न पर उगाई जाने वाली इम्यूनोसमेंट्स कालोनियों के प्रतिनिधि confocal छवियों।
(A ) Id1 और न्यूक्लियरपोर कॉम्प्लेक्स या (B) टीबरा और लैमिनबी1 के लिए इम्यूनोफ्लूरेंस के बाद प्रतिनिधि एमईएससी कॉलोनियां। प्रत्येक धुंधला के लिए, एक डिस्क micropattern पर हो एक कॉलोनी और एक कॉलोनी एक अंगूठी micropatern पर हो दिखाया गया है. अलग-अलग चैनल ों को ग्रे स्केल छवियों के रूप में प्रदान किया जाता है। माइक्रोपैटर्न (405 एनएम लेजर उत्तेजना) के स्पष्ट ऑटो-प्रवाह संकेत पर ध्यान दें। स्केल बार 50 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: छवि विश्लेषण प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट. 3 डी confocal छवियों की एक सूची विश्लेषण के लिए PickCells में आयात किया जाता है (1). यह उदाहरण दो अलग-अलग आकृतियों (चित्र 2के रूप में)। छवि नामकरण कन्वेंशन बाईं ओर दिखाया गया है और दाईं ओर PickCells इंटरफ़ेस. फिर, Nessys मॉड्यूल स्वचालित रूप से खंड नाभिक के लिए प्रयोग किया जाता है (2). स्क्रीनशॉट में, प्रत्येक व्यक्ति नाभिक सटीक विभाजन का संकेत एक अद्वितीय रंग दिया जाता है. पैटर्न के autofluorence भी विभाजित है, इस बार, 'मूल विभाजन' मॉड्यूल का उपयोग कर (4). पृष्ठभूमि नीले और सफेद संकेत में प्रकट होता है पैटर्न आकार के रूप में परिभाषित किया जाएगा. खंडित आकार तो नेत्रहीन सटीक विभाजन सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण कर रहे हैं, और विभाजन संपादक मॉड्यूल का उपयोग कर यदि आवश्यक संपादित (3-5)। स्क्रीनशॉट पता लगाया आकार की रूपरेखा दिखाते हैं. गुलाबी और पीले आकार संपादित किया गया है. अंत में, वस्तुओं सुविधाओं की गणना और बाद में R (6-7)में संसाधित किया जा करने के लिए फ़ाइल को निर्यात कर रहे हैं। एक 3 डी दृश्य के रूप में गाया एक कॉलोनी के एक स्क्रीनशॉट प्रदान की जाती है (6). चरण 2 से 6 के लिए इस आलेख लिखने के समय PickCells इंटरफ़ेस में पाए गए चिह्न चरण अनुक्रमणिका के आगे दिए गए हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: दो अलग प्रतिलेखन कारकों और micropaterna आकार के लिए प्रतिनिधि परिणाम
एमईएससी के लिए बिन्ड स्थानिक मानचित्र 48 एच पर (ए) डिस्क के आकार का माइक्रोपैटर्न या (बी) अंगूठी के आकार का माइक्रोपैटर्न के लिए विकसित किया गया है। प्रत्येक micropattern आकार के लिए, सेल घनत्व के नक्शे, सेल phenotype के बावजूद, एक नीले रंग के पैमाने के साथ बाईं ओर दिखाया गया है. फिर प्रत्येक मार्कर के लिए (शीर्ष पंक्ति पर Tbra और नीचे पंक्ति पर Id1), तीन अलग नक्शे प्रदान की जाती हैं, बाएँ से दाएँ: मार्कर के सेल घनत्व नक्शा केवल व्यक्त कोशिकाओं (थ्रेसहोल्ड आधारित विश्लेषण), औसत मार्कर तीव्रता का नक्शा (log2) और के नक्शे मार्कर तीव्रता के मानक विचलन. तीव्रता को मनमाने ढंग से फ्लोरोसेंट इकाइयों के रूप में दिया जाता है। प्रत्येक नक्शे के लिए, micropatern आकार एक सफेद रूपरेखा के रूप में दिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ईसीएम प्रकार जिलेटिन फाइब्रोनेक्टिन बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स
एकाग्रता ईसीएम एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल 20 ग्राम/ 200 ग्राम/
पोलोक्सामर 407 एकाग्रता 500 ग्राम/ 400 ग्राम/ 1 मिलीग्राम/एमएल
के साथ परीक्षण किया गया एमईएससी हाँ हाँ हाँ
एमईपीएससी नहीं हाँ हाँ
सीरम मुक्त माध्यम नहीं हाँ हाँ

तालिका 1: poloxamer 407 और ECM की सांद्रता का परीक्षण किया. इस तालिका ECM और poloxamer 407 कि हम अपनी प्रयोगशाला में परीक्षण की सांद्रता का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है. प्रत्येक ECM/poloxamer 407 संयोजन के लिए, सेल प्रकार जिसके लिए पैटर्न सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दिखाया गया है कि क्या संस्कृति सीरम निहित है या नहीं. एमईएससी - माउस भ्रूणीय स्टेम सेल, एमईपीएससी ] माउस एपिब्लास्ट स्टेम सेल।

प्रक्रिया अवलोकन संभावित समस्या समाधान
माइक्रोपैटर्निंग कम सेल अनुलग्नक अनुपयुक्त ईसीएम/पोलोक्सामर 307 संकेन्द्रण अनुपात ECM/poloxamer 307 एकाग्रता अनुपात बढ़ाएँ
कक्ष अनुलग्नक समय बहुत छोटा कोशिकाओं को ठीक से पैटर्न (चरण 3.4) का पालन करने के लिए पर्याप्त समय देने के लिए ऊष्मायन समय बढ़ाएँ। इस चरण को अनुकूलित करने के लिए, माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जाँच करने से कोशिका आकारिकी में परिवर्तन का पता लगाने में मदद मिल सकती है जो यह दर्शाता है कि कोशिकाओं ने पालन करना शुरू कर दिया है।
washes भी तीव्र (कदम 3.6) मध्यम की जगह, सीधे चिप्स पर मध्यम pipeting से बचें. इसके बजाय, धीरे के बजाय अच्छी तरह से की दीवारों पर माध्यम पाइप
कोशिकाओं पैटर्न के बीच पालन अनुपयुक्त ईसीएम/पोलोक्सामर 307 संकेन्द्रण अनुपात ECM/poloxamer 407 एकाग्रता अनुपात घटाएँ
कक्ष अनुलग्नक समय बहुत लंबा ऊष्मायन समय घटाएँ (चरण 3.4).
washes अप्रभावी (कदम 3.6) प्लेट को जोरदार ढंग से हिलाना आमतौर पर कोशिकाओं को अतिरिक्त रूप से अलग करने के लिए पर्याप्त होता है। सेल प्रकार जो चिप के लिए दृढ़ता से पालन करते हैं के लिए, चिप पर सीधे pipeting परिणाम में सुधार हो सकता है. washes की संख्या बढ़ाने में भी मदद मिल सकती है, विशेष रूप से यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई सेल इस कदम के बाद माध्यम में चल रहे हैं.
कोशिकाओं को सख्ती से पैटर्न आकार का पालन नहीं करते 'असंगत' कक्ष प्रकार और पैटर्न ज्यामिति किसी दिए गए पैटर्न आकार और सेल प्रकार के लिए इष्टतम पैटर्न आकार का परीक्षण और पहचान करने में सक्षम होने के लिए फोटोमास्क पर जोड़े जाने वाले एकाधिक geometries/आकारों की योजना/ कृपया, चर्चा में 'लिइएसी' अनुभाग देखें
गैर इष्टतम फोटो-पैटर्निंग, यह autofluorence संकेत के तीखेपन को देख कर निदान किया जा सकता है. पैटर्न सीमाओं चित्र 2 में की तरह तेज दिखना चाहिए। यदि पैटर्न की सीमाओं धुंधला दिखाई देते हैं तो फोटो-पैटर्निंग चरण में सुधार करने की आवश्यकता है। धुंधला पैटर्न किनारों से संकेत मिलता है कि प्लास्टिक स्लाइड रोशनी कदम के दौरान मुखौटा की सतह के लिए पर्याप्त बंद नहीं था। सुनिश्चित करें कि photomask करने के लिए स्लाइड पकड़े टुकड़े भी कर रहे हैं और यह कि एक निरंतर और पर्याप्त दबाव रोशनी प्रक्रिया के दौरान विधानसभा के लिए लागू किया जाता है.
धुंधला गैर-समान अभिरंजन एंटीबॉडी ऊष्मायन समय बहुत कम एंटीबॉडी ऊष्मायन समय बढ़ाएँ (कमरे के तापमान पर 24h तक)
बढ़ते प्रक्रिया के दौरान कालोनियों चपटा कोशिकाओं को बढ़ते के लिए आवश्यकता के बिना दोनों इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए चैमलिड या साइटू-कक्षों जैसे एक कक्ष में माइक्रोपैटर्न स्लाइड माउंट करें। यह बेहतर कालोनियों 3 डी संरचना की रक्षा करेगा।
धुंधला प्रक्रिया के दौरान कालोनियों को अलग करना चिप की अपघटन पर्याप्त माध्यम छोड़ दो या 2 pipettes का उपयोग करें, एक मध्यम को दूर करने के लिए और अन्य ताजा समाधान जोड़ने के लिए
कालोनियों माइक्रोस्कोप के नीचे आ गया दिखाई देते हैं माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर चिप बढ़ते समय कालोनियों को खिसक दिया गया था चिप्स बढ़ते जब बहुत कोमल हो. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को बढ़ने की आवश्यकता के बिना इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग दोनों को निष्पादित करने के लिए चैमलिड या साइटोचंबर्स जैसे कक्ष में माइक्रोपैटर्न स्लाइड को माउंट करें। यह कॉलोनी अल्ट्रास्ट्रक्चर को भी संरक्षित करता है।

तालिका 2: समस्या निवारण मार्गदर्शिका। यह तालिका संभावित उप-अनुकूल परिणामों का अवलोकन प्रदान करती है. समस्याओं के संभावित स्रोत भी अनुशंसित समाधानों के साथ सूचीबद्ध हैं।

Discussion

यहाँ हम कोशिकाओं की संस्कृतियों में आकस्मिक पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. एक सरलीकृत micropaterning दृष्टिकोण सेल कालोनियों के आकार और आकार के मानकीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है, और हम छवि विश्लेषण उपकरण और आर लिपियों कि इन कालोनियों के भीतर पैटर्न का पता लगाने और परिमाणीकरण सक्षम प्रस्तुत करते हैं.

पाइप लाइन हम प्रस्ताव एक पहले से प्रकाशित विधि31 जहां लेखकों संस्कृति की स्थिति पर ध्यान केंद्रित के साथ कुछ हद तक समान है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropatterns का उपयोग कर, ईएससी कालोनियों में reproduible रोगाणु परत गठन प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में प्रारंभिक गैस्ट्रेशन घटनाओं का अध् ययन हमारा उद्देश्य अधिक इन विट्रो में पैटर्न गठन की खोज के लिए एक सामान्य योग्य पाइप लाइन प्रदान करने की दिशा में केंद्रित है जहां कोशिकाओं के सामूहिक संगठन केवल सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद स्पष्ट हो सकता है. इस कारण से, हम एक मजबूत छवि विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं जो कई कालोनियों पर 3 डी अंतरिक्ष में परमाणु स्थिति की सटीक पहचान और विश्लेषण को सक्षम करता है (इस के 'लाभ और सीमाओं को भी देखें' इस खंड चर्चा)। हम भी एक सरल घर में micropaterning दृष्टिकोण है जो लंबे समय में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान के लिए एक और अधिक लचीला और सस्ता विकल्प प्रदान करता है जो हमें उम्मीद है कि समुदाय के लिए उपयोगी हो जाएगा विकसित करने का फैसला किया.

अंत में, हम ध्यान दें कि इस पांडुलिपि के संशोधन के दौरान, हमारे आर लिपियों के समान इन विट्रो में पैटर्न के विश्लेषण के लिए एक नया पैकेज32जारी किया गया है. इस नए पैकेज इनपुट जो उच्च थ्रूपुट इमेजिंग प्लेटफार्मों से प्राप्त किया जा सकता है के रूप में सेल सुविधाओं की तालिकाओं को स्वीकार करता है. हमें विश्वास है कि हमारे प्रोटोकॉल के चरण 7 पर उत्पन्न नाभिक सुविधाओं की तालिका सिद्धांत रूप में इस नए पैकेज के लिए एक इनपुट के रूप में सेवा कर सकता है, हालांकि हम इस संभावना खुद का परीक्षण नहीं किया है.

अन्य सेल प्रकार और कॉलोनी geometries के लिए विधि की अनुकूलनशीलता

हम सीरम की उपस्थिति में pluripotent कोशिकाओं की संस्कृतियों में mesodermal प्रतिलेखन कारकों के उद्भव के अध्ययन के संदर्भ में इस दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. हालांकि, विधि आसानी से अन्य सेल प्रकार के लिए और सीरम मुक्त संस्कृतियों के लिए अनुकूल है, हालांकि यह ECM/poloxamer 407 सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है (एक समस्या निवारण गाइड के लिए परीक्षण सांद्रता और तालिका 2 के लिए तालिका 1 देखें). विधि भी micropatterns के बड़े या छोटे आकार के लिए और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, विधि की स्थापना करते समय, यह पता है कि नहीं सभी आकार / सेल प्रकार संयोजन इष्टतम हैं महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, एमईएससी ई-कैडेरिन33,34 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है जिससे इन कोशिकाओं को ईसीएम से रहित क्षेत्रों में फैले सामूहिक संरचनाओं का निर्माण करने में सक्षम बनाया जा सकता है। इन कोशिकाओं को सख्ती से तेज कोण के साथ geometries का पालन नहीं करते हैं या कि पैटर्न में छोटे छेद शामिल हैं. उदाहरण के लिए ध्यान दीजिए कि चित्र 3ठकी अंगूठी पर कोशिकाएँ केंद्रीय क्षेत्र को उपनिवेशित करने की प्रक्रिया में हैं। हमारे हाथों में एक छोटे केंद्रीय क्षेत्र एमईएससी को रिंग के आकार की कालोनियों के रूप में मजबूर नहीं किया। इसलिए यह अत्यधिक geometries की विविधता शामिल करने के लिए सिफारिश की है, जबकि photomask डिजाइन करने के लिए परीक्षण और इष्टतम आकार और curvatures जो पसंद के सेल प्रकार के लिए उपयुक्त हो जाएगा की पहचान करने में सक्षम हो.

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक को ध्यान में रखना प्रयोग की लंबाई और कोशिकाओं के प्रसार की दर है. कुछ तेजी से बढ़ कोशिका प्रकार के लिए (pluripotent कोशिकाओं सहित) यह कई दिनों में micropatterns पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मुश्किल हो सकता है (MESC के लिए तीन दिन एक अधिकतम है). इसके अलावा, माइक्रोपैटर्न पर कोशिकाओं का बीज हमेशा हर कॉलोनी के लिए इष्टतम रूप से नहीं होता है, इसलिए अतिरिक्त मात्रा में कालोनियों के बीज लेने की सलाह दी जाती है।

लाभ और पैटर्न का पता लगाने विधि की सीमाओं

विधि का एक विशेष लाभ कई प्रतिकृति कालोनियों से छवि विश्लेषण परिणामों के संयोजन से "औसत" पैटर्न का पता लगाने की क्षमता है (चित्र 5)। यह पैटर्न घटनाओं है कि व्यक्तिगत कालोनियों के निरीक्षण से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं प्रकट कर सकते हैं. इस 'औसत' दृष्टिकोण का एक नुकसान यह है कि यह दोहराव पैटर्न के कुछ प्रकार याद कर सकते हैं, उदाहरण के लिए छोटे धब्बे या संकीर्ण धारियों. हालांकि, पैटर्न के इन प्रकार के बजाय ध्यान से चुना पैटर्न आकार8के संयोजन के साथ पता चला जा सकता है. इसके अलावा, यहाँ वर्णित छवि विश्लेषण पाइपलाइन दोनों एकल सेल और कॉलोनी संकल्प पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है जो अंतर-कोलोनी परिवर्तनशीलता के स्तर की जांच करने की संभावना प्रदान करता है (चित्र 5) या एकाधिक पर पड़ोसी विश्लेषण करने के लिए तराजू10|

औसत विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह पता लगाने चैनलों के उपलब्ध फ्लोरोफोर द्वारा सीमित किया जा रहा बिना कई मार्करों के अधिमानी स्थान नक्शा करने का अवसर प्रदान करता है. वास्तव में, हालांकि हम यहाँ प्रस्तुत काम में भेदभाव के केवल दो मार्करों का उपयोग करते हैं, कालोनियों के मानकीकरण और निकालने की क्षमता "औसत" पैटर्न यह संभव आदेश में कालोनियों के विभिन्न सेट से वितरण नक्शे की तुलना करने के लिए बनाता है एक दूसरे को मार्करों के सामान्यीकृत स्थानिक संबंधों को प्रकट करने के लिए.

इसके अलावा, हालांकि हमारा ध्यान यहाँ भेदभाव के मार्करों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, विश्लेषण विधि अन्य जैविक प्रक्रियाओं जिसके लिए परमाणु मार्करों उपलब्ध हैं अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. उदाहरण के लिए एक प्रवाह सर्वव्यापकता सेल चक्र सूचक35 (FUCCI) युक्त सेल लाइन के micropaterning यह अध्ययन करने के लिए कैसे कॉलोनी स्तर ज्यामिति समूह में सेल चक्र की घटनाओं को प्रभावित कर सकते हैं संभव बनाना होगा.

भविष्य के निर्देश

विधि मध्यम थ्रूपुट छवि विश्लेषण के लिए अनुकूल है, तथापि, छवि अधिग्रहण वर्तमान में पूरी तरह से स्वचालित नहीं है और बहुत बड़े प्रयोगों के लिए सीमित हो सकता है. कालोनियों की नियमित व्यवस्था से यह संभव हो जाना चाहिए कि एकल सेल औसत20के लिए विकसित की गई सेवाओं के समान ही पूरी तरह से स्वचालित अधिग्रहण दिनचर्या का निर्माण किया जा सके . हालांकि, क्योंकि एक कॉलोनी छवि के लिए आवश्यक क्षेत्र का आकार बड़ा है, संभवतः मोज़ेक की आवश्यकता होती है, और क्योंकि कालोनियों तीन आयामी हैं, यह केवल प्रासंगिक कालोनियों इमेजिंग द्वारा दोनों डेटासेट आकार और अधिग्रहण समय को कम करने के लिए अत्यधिक वांछनीय है। इसलिए, भविष्य के प्रयासों प्रासंगिक कालोनियों की पहचान करने और प्रत्येक नमूने के लिए इमेजिंग निर्देशांक अनुकूलन करने में सक्षम एक 'बुद्धिमान' माइक्रोस्कोप विकसित करने के लिए समर्पित किया जा सकता है। यह न केवल समय और प्रयास को कम करेगा बल्कि संभावित ऑपरेटर पूर्वाग्रहों को भी रोकेगा।

विश्लेषण पाइपलाइनों को भी उपयोगकर्ता द्वारा उठाए जाने वाले चरणों की संख्या को कम करके और अधिक कुशल बनाया जा सकता है। हम एक पाइप लाइन निर्माण तंत्र का निर्माण करने की योजना है और हमारे सॉफ्टवेयर में सीधे आर एकीकृत करने के लिए (देखें भी मुद्दों pickcells-api]3 और pickcells-rजावा [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] के मुद्दे पर नजर रखने में. विश्लेषण प्रक्रिया का पूर्ण स्वचालन समय और प्रयास को कम करने और संभावित उपयोगकर्ता त्रुटियों को सीमित करेगा.

अंत में, हम ध्यान दें कि हमारे विश्लेषण विधि अभी तक पूरी तरह से सेलुलर पैटर्न के गतिशील प्रकृति पर कब्जा नहीं करता है. कुछ सीमित गतिशील जानकारी स्नैपशॉट छवियों8,10,36की एक समय श्रृंखला की जांच करके निकाला जा सकता है. हालांकि, सेल आबादी के इतिहास को रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के नाते अत्यधिक वांछनीय है अगर हम बेहतर समझ कैसे पैटर्न उभर करना चाहते हैं. एक सीमा यह है कि 3 डी घनी कोशिकाओं की जनसंख्या में अलग - अलग कोशिकाओं की सही ट्रैकिंग एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्यबनीहुई है . हमारी कोशिका का पता लगाने की विधि परमाणु लिफाफे का उपयोग करती है और घने और अतिव्यापन वाले कोशिकाओं की संख्या28पर विशेष रूप से अच्छी तरह से कार्य करती है . परमाणु लिफाफे के लाइव पत्रकारों को आसानी से उपलब्ध हैं28,38 और micropaterning तकनीक का एक लाभ यह है कि यह लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान देखने के क्षेत्र के बाहर जाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल मिलाकर, हमें विश्वास है कि कोशिकाओं की स्वचालित ट्रैकिंग हाल ही में स्थापित उपकरण28,39,40 का एक संयोजन का उपयोग कर प्राप्त किया जाएगा और यह मौलिक में नई अंतर्दृष्टि लाना चाहिए कि स्व-संगठन के सिद्धांत।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

यह काम एक सर हेनरी वेलकम पोस्ट-डॉक्टरल फेलोशिप (WT100133 से G.B.), एक वेलकम ट्रस्ट सीनियर फेलोशिप (WT103789AIA से S.L.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एक वेलकम ट्रस्ट पीएचडी छात्रता को (108906/ हम भी photopaterning तकनीक अनुकूलन पर उनकी सलाह के लिए डॉ मैनुअल Thery के आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Gibco 31350-010 handle in fume hood
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask Toppan Photomask Custom design
24-well plates Corning 3526
4-well plates Nunclon Delta 176740
5% Donkey Serum Sigma D9663
Anti Nuclear pore complex Abcam ab24609 Mouse monoclonal, use 1:1000
Anti-Id1 Biocheck 37-2 Rabbit polyclonal, use 1:200
Anti-Lamin B1 Abcam ab16048 Rabbit polyclonal, use 1:1000
Anti-Tbra R&D AF2085 Goat ployclonal, use 1:400
Blocking Solution NA NA 0.1% TritonX-100
0.01% Pluronic F-127
5% Donkey Serum
0.003% Sodium Azide
In PBS
CGR8 mESC NA NA Reference: Mountford et al. PNAS, 1994
Fixation solution NA NA 4% PFA diluted in washing solution
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance
Gelatin Sigma G1890
Glasgow Minimum Essential Medium Sigma G5154
Laboratory Film VWR 291-1212
Layout Editor Software LayoutEditor NA https://layouteditor.com/
Layout Editor Software Klayout NA https://www.klayout.de/
L-glutamine Gibco 25030-024
LIF Millipore ESG1107
MEM NEAA Gibco 11140-035
mESC Culture medium NA NA GMEM
10% FCS
100 U/ml LIF
100 nM 2-mercaptoethanol
1× non-essential amino acids,
2 mM L- glutamine
1 mM sodium pyruvate
NH4Cl 50mM Sigma 9718
Paraformaldehyde Sigma 158127 CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment
PBS (immunostaining) Sigma P4417 Dilute in 200ml of ddH2O
PBS (tissue culture) Gibco 11140-035
Plastic slides Ibidi IB-10813
Poloxamer 407 Sigma P2443
ProLong Gold Antifade Mountant Molecular Probes P36930
Sodium Azide Sigma 8591 CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment
Sodium pyruvate Gibco 11360070
TritonX-100 Sigma T8532
Trypsin Gibco 25200056
UVO cleaner Jetlight, USA 42-220 CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations
Washing Solution NA NA 0.1% TritonX-100
0.01% Pluronic F-127
In PBS

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 146 पैटर्निंग माइक्रोपैटर्न मात्रात्मक स्टेम सेल आकस्मिक व्यवहार
Micropaterns और मात्रात्मक इमेजिंग का उपयोग कर Mammalian कोशिकाओं के उभरते स्थानिक संगठन मानचित्रण
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Wisniewski, D., Lowell, S., Blin, G. … More

Wisniewski, D., Lowell, S., Blin, G. Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging. J. Vis. Exp. (146), e59634, doi:10.3791/59634 (2019).

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