Summary
De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.
Abstract
Een fundamenteel doel in de biologie is om te begrijpen hoe patronen ontstaan tijdens de ontwikkeling. Verschillende groepen hebben aangetoond dat patronen in vitro kunnen worden bereikt wanneer stamcellen ruimtelijk beperkt zijn tot micro patronen, waardoor experimentele modellen worden opgezet die unieke mogelijkheden bieden om in vitro de fundamentele principes van biologische Organisatie.
Hier beschrijven we onze eigen implementatie van de methodologie. We hebben een foto-patterning techniek aangepast om de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur te reduceren, zodat het gemakkelijker wordt om de methode in een standaard cel biologie laboratorium te vestigen. We ontwikkelden ook een gratis, open-source en eenvoudig te installeren beeldanalyse kader om de preferentiële positionering van subpopulaties van cellen binnen kolonies van standaard vormen en-maten nauwkeurig te meten. Deze methode maakt het mogelijk om het bestaan van patronen gebeurtenissen te onthullen, zelfs in schijnbaar ongeorganiseerde populaties van cellen. De techniek biedt kwantitatieve inzichten en kan worden gebruikt voor het ontkoppelen van invloeden van de omgeving (bijv. fysieke signalen of endogene signalering), op een bepaald patroon proces.
Introduction
In zoogdier systemen is patronen een emergente eigenschap van het collectief gedrag van cellen en zo kunnen patronen in vitro worden vormgegeven, indien passende aanwijzingen aan de cellen1,2,3,4, 5 , 6. een manier om het intrinsieke vermogen van de cellen te onthullen om in vitro zelf te organiseren, is door de cellen te dwingen groepen/kolonies te vormen van een gedefinieerde vormen en maten7,8,9,10 . Een techniek die dit mogelijk maakt is micropatterning11. Micropatterning maakt het mogelijk om de locatie waar extracellulaire matrix (ECM) moleculen op een oppervlak worden afgezet nauwkeurig te definiëren. Dit, op zijn beurt dicleert waar de cellen kunnen hechten en daarom bepaalt hoe cellen ruimtelijk organiseren.
Micropatterning is een techniek met tal van toepassingen, bijvoorbeeld micropatterning maakt standaardisatie van initiële omstandigheden voorafgaand aan differentiatie12mogelijk. Belangrijk is dat micropatterning het mogelijk maakt om eenvoudig de grootte, vorm en afstand van celkolonies te beheersen en deze eigenschap kan worden gebruikt om experimenten uit te werken die gericht zijn op het ondervragen van de collectieve respons van de cellen op morfogen of op fysieke signalen7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Er zijn verschillende micropatterning methoden ontwikkeld11. Photopatterning technieken zijn misschien wel de eenvoudigste methoden om18te vestigen. Deze benaderingen hebben ook het voordeel van precisie, omdat ze kunnen worden gebruikt om de vorm van enkele cellen18,19,20te beheersen. Ze vereisen echter ook dure gespecialiseerde apparatuur, waaronder een spin coater, een plasma kamer en een UVO (UV-ozon) reiniger die over het algemeen niet direct beschikbaar zijn in standaard biologie laboratoria. Om het aannemen van de techniek te vergemakkelijken, hebben we het protocol aangepast om alleen de UVO-lamp te vereisen. We starten met de in de handel verkrijgbare plastic dia's die met een schaar kunnen worden gesneden of met een perforator naar het gewenste formaat.
Een belangrijk nut van micropatterns is de mogelijkheid om kolonies te standaardiseren om individuele kolonies over meerdere replicaten te vergelijken. Dit maakt het mogelijk om te vragen in hoeverre de patroonvorming binnen deze kolonies reproduceerbaar is, en om factoren te onderzoeken die de robuustheid van het patronen proces beïnvloeden. Belangrijk is dat de kwantificering van "gemiddelde" patronen in meerdere gestandaardiseerde kolonies ook patroon processen kan onthullen die anders niet zouden blijken. Het voordeel van het kunnen kwantificeren van patronen op gestandaardiseerde kolonies is afhankelijk van de mogelijkheid om de eiwit expressie nauwkeurig te meten, idealiter op het niveau van één cel. Cellen op micro patronen zijn echter vaak strak verpakt, waardoor ze moeilijk te segmenteren zijn met hoge nauwkeurigheid. Cellen organiseren zich ook vaak in drie in plaats van twee dimensies en het kan lastig zijn om driedimensionale (3D) informatie tijdens segmentatie te detecteren en te behouden. Zodra de cellen met succes zijn gesegmenteerd, zijn er rekenmethoden nodig voor het extraheren van patronen uit de resulterende gegevenssets.
We hebben segmentatie-en beeldanalyse tools ontwikkeld om deze problemen te helpen overwinnen. Deze analysemethode maakt alleen gebruik van gratis en open-source software en vereist geen kennis van Command Line of programmering om te implementeren. Om de methode hier te illustreren, gebruiken we muizen embryonale stam (mES) cellen die spontaan een marker van vroege differentiatie brachyury (tbra)21,22uitdrukken. Hoewel geen schijnbare ruimtelijke ordening visueel detecteerbaar is, maakt de methode het mogelijk om een kaart te maken van de preferentiële positionering van T + cellen in kolonies. We tonen ook aan dat Tbra-patronen contrasteert met het ontbreken van een voorkeurs lokalisatie van de cellen die Id1 uitdrukken, een directe uitlezen van het botmorfogenetische eiwit (BMP)-traject23. We bespreken ook de huidige beperkingen van de methode en hoe deze techniek kan worden aangepast aan andere experimentele systemen.
Protocol
Opmerking: een overzicht van de methode wordt gegeven in afbeelding 1.
1. masker ontwerp
- Ontwerp de photomask volgens de richtlijnen beschreven in Azioune et al.18. Raadpleeg de tabel met materialen voor een verwijzing naar de software-en masker fabrikant die voor deze studie wordt gebruikt.
Opmerking: meerdere geometrieën, grootten of spatiëring tussen vormen kunnen op één masker worden gemaakt. De UV-lamp past op een 15 cm photomask die tot 49 verschillende ontwerpen kan bevatten (uitgaande van 2 cm x 2 cm chips).
2. micro patroon fabricage procedure
- Bereid de benodigde materialen voor.
- Bereid een oplossing van 0,1% poloxameer 407 (10 mg voor 10 mL) in fosfaatgebufferde Saline (PBS) en laat op een shaker bij kamertemperatuur. De poloxameer 407 zal ongeveer 20 minuten duren om op te lossen.
- Lag laboratorium film (Zie de tabel van de materialen) in de bodem van een 10 cm vierkante Petri schaal. Dit zal worden gebruikt als de kamer voor matrix depositie.
- Reinig het oppervlak van de photomask, eerst met 100% aceton, vervolgens met 100% isopropanol en tenslotte met ddH2O. Indien mogelijk, lucht drogen de photomask of anderszins drogen het masker met schone papieren handdoek.
- Maak een vierkant, stijf en ondoorzichtig stukje plastic met exact dezelfde grootte als de photomask (later aangeduid als ' Holder ').
Opmerking: dit wordt gebruikt om plastic dekstroken in contact te houden met de photomask tijdens de verlichtings stap. - Draai de UVO-lamp aan en voer gedurende 10 minuten een verwarmende verlichting uit.
- Creëer photopatterned chips.
Opmerking: het is mogelijk om de procedure aan te passen om chips van elke gewenste grootte te maken. Voor het gemak beschrijven we hier de procedure voor het genereren van een 12 mm ronde micro patroon chip.- Gebruik een 12 mm gatpunch, snijd hydrofobe plastic glijbanen om 12 mm ronde dekstroken te maken en plaats ze in een schone nieuwe Petri schaal.
VOORZICHTIG: gebruik handschoenen te allen tijde om huidcontact met het oppervlak van het plastic te voorkomen, omdat dit de oppervlaktebehandeling kan beschadigen. - Verwijder voorzichtig de beschermende folie van de dekstroken met een pincet.
Opmerking: Vermijd beschadiging van het plastic oppervlak omdat dit de plaatsing van de cellen op de chip tijdens de zaaien procedure kan beïnvloeden (punt 3). - Plaats de photomask op een schoon en stabiel oppervlak (bijv. een photomask-doosje), de chromen zijde naar boven gericht en voeg een druppel van 2 μL ddH2O toe op de positie van het gewenste spaan ontwerp.
- Leg een dekslip op de druppel ddH2O en druk zachtjes.
Opmerking: Zorg ervoor dat de kunststof kant die de photomask gezichten is de zijde die werd beschermd door de film die werd verwijderd in de vorige stap. - Plaats de houder bovenop de kunststof glijbanen en bevestig deze sandwich met klemmen zorgvuldig om de plastic stukken in contact te houden met de photomask.
Let op: plaats de klemmen zo dicht mogelijk bij de locatie van de plastic glaasjes om ervoor te zorgen dat de plastic glaasjes perfect onderhouden worden in contact met het oppervlak van de photomask. - Plaats de montage in de UVO-lamp op ongeveer 2 cm van de lichtbron en verlicht 10 min.
Opmerking: de kracht van het licht wordt geschat op 6 mW/cm2 bij 254 nm golflengte wanneer de chip op een afstand van 2 cm van de bron wordt geplaatst. - Houd de sandwich met de photomask onderaan en verwijder voorzichtig de klemmen met behoud van de druk met één hand om te voorkomen dat de dia's bewegen tijdens het demonteren van de sandwich. Verwijder de houder, zorg ervoor dat alle plastic stukken nog steeds op het masker en niet vast aan de houder.
- Voeg ddH2O bovenop de chips toe en maak de spanen voorzichtig los van de photomask.
Opmerking: als de plastic chip vastzit aan de photomask, koppelt u de chip los met een plastic pipetpunt om de chip te duwen terwijl u een pincet iets boven de chip houdt in het geval dat de chip plotseling loskoppelt. - Plaats ten slotte de fotomopatterned chips in de matrix afzetting kamer.
Opmerking: Zorg ervoor dat de verlichte kant van de chip naar boven is gericht.
- Gebruik een 12 mm gatpunch, snijd hydrofobe plastic glijbanen om 12 mm ronde dekstroken te maken en plaats ze in een schone nieuwe Petri schaal.
- Stort de matrix.
Opmerking: alle procedures in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een weefselcultuur kap.- Filtreer de poloxameer 407-oplossing door een polyethersulfon (PES) filter van 0,22 μm.
- Bereid de ECM-coating oplossing door het mengen van 500 μg/mL steriele gefilterde poloxameer 407 en 1 mg/mL gelatine.
Opmerking: Zie ook tabel 1 voor aanvullende informatie over andere mogelijke ECM-moleculen. - Voeg 200 μL van de coating oplossing toe op elke verlichte chip. De laboratorium film zal voorkomen dat de druppel buiten de chip valt.
- Voeg een 3 cm Petri schaaltje met ddH2O toe om de verdamping te beperken en plaats deze met de chip bij 4 °c 's nachts.
3. seeding procedure
Opmerking: de hieronder beschreven stappen zijn geoptimaliseerd voor CGR8 muis embryonale stamcellen (mESC)24 met behulp van standaard MESC medium (Zie ook de tabel met materialen). Het is echter in principe mogelijk om de procedure voor elk celtype aan te passen. Merk ook op dat de conventionele celcultuur van muizen embryonale stamcellen hier niet wordt beschreven als uitgebreide documentatie kan elders worden gevonden25.
- Zuig de coating oplossing op en inbroed de spanen tweemaal gedurende ten minste 5 minuten met steriele PBS.
- Bereid ondertussen een celsuspensie van 5,5 x 105 cellen/ml in warm medium.
- Pipet keer 200 μL celsuspensie op elke chip (~ 100.000 cellen/cm2).
- Sluit de zaaien kamer en laat de cellen zich 1 uur in de incubator houden.
- Vul na 1 uur de putjes van een multi well plate (4-Wells of 24-Wells plaat afhankelijk van het aantal chips) met 500 μL/goed van warm medium en breng de spanen over in de plaat met steriele pincet.
- Schud de plaat krachtig om niet-aanhandige cellen los te maken. Aspireren het medium en onmiddellijk vervangen door vers warm medium. Controleer onder de Microscoop of patronen zichtbaar zijn (Figuur 2a).
Opmerking: de adhesie tijd moet mogelijk worden geoptimaliseerd bij het gebruik van andere cellijnen dan mESC of andere matrix eiwitten (Zie ook tabel 2). - Herhaal deze stap totdat de patronen duidelijk zichtbaar zijn, zoals weergegeven in Figuur 2a.
Opmerking: deze stap is van cruciaal belang en bepaalt het succes van de procedure. Een te intense wasprocedure kan de cellen losmaken, in tegenstelling tot onvoldoende wassen kunnen cellen tussen de patronen blijven zitten (figuur 2c, d).
4. fixatie
NB: na 48 h in de cultuur moeten de cellen dichte kolonies vormen die de vorm van de patronen nauwgezet volgen (zoals weergegeven in Figuur 2b).
- Het verlaten van de chips in de plaat, verwijderen ~ 90% van het medium, waardoor net genoeg medium om te voorkomen dat de spanen te drogen.
Opmerking: het is belangrijk dat de chip nooit droogt om vlekken artefacten te vermijden en om celloslating van het oppervlak te voorkomen. Vanwege de hydrofobiciteit van het spaan oppervlak tussen de lijm patronen, kan de chip de neiging hebben om de-NAT te maken. In dit stadium, de fixeer kan grote koepels kolonies te loskoppelen van de chip veroorzaken. Wast moet zeer zacht zijn, idealiter uitgevoerd door middel van Pipetteer vloeistof aan de zijkant van de put en niet direct op de chip. - Voeg ten minste 500 μL Paraformaldehyde (PFA) gebaseerde fixatie oplossing per put toe en incuberen gedurende 10 minuten.
Opmerking: als kolonies bijzonder dik lijken (meer dan 5 cellagen), kan het nodig zijn om de fixatietijd aan te passen tot 20 min. - Na fixatie 3 keer wassen met de wasoplossing (PBS met 0,01% poloxameer 407). Een extra wasbeurt met 50 mM NH4cl verdund in wasoplossing kan worden geintercaleerd om de resterende PFA-kruiskoppelings activiteit te doven.
- Inincuberen de monsters gedurende ten minste 30 min in blokkerende oplossing.
Opmerking: in dit stadium kunnen monsters gedurende ongeveer een week vóór de kleuring bij 4 °C worden bewaard. Als dat zo is, verzegelen de plaat met laboratorium folie om verdamping te voorkomen.
5. immunokleuring
- Maak een kleurings kamer door een vel laboratorium folie in de bodem van een 10 cm vierkante Petri schaaltje te plaatsen.
- Bereid antilichaam oplossingen (Zie tabel 3 voor een lijst van antilichamen en verdunningen die in dit artikel worden gebruikt).
- Plaats de chip in de kleurings kamer met de zijde die de cellen naar boven ondersteunt en voeg onmiddellijk 100 μL primaire antilichaam oplossing toe aan de chip.
Let op: in dit stadium, chips moeten niet gemakkelijk de-NAT zoals in stap 4,1. Echter, zorg moet nog steeds worden genomen, want het is belangrijk dat de chips niet drogen. Als meerdere chips moeten worden verwerkt, moet u stap 5,3 op elke chip sequentieel toepassen. - Inbroed voor 1 uur op een ronddraaiend platform bij kamertemperatuur.
Opmerking: als de cellen grote 3D-structuren hebben gevormd, kan een langere incubatietijd nodig zijn om uniforme kleuring van het monster mogelijk te maken. Incubatietijd kan worden verhoogd tot 24 uur. De kleurings kamer moet echter een schotel van 3 cm gevuld met water bevatten en de kleurings kamer moet met een laboratorium folie worden verzegeld om verdamping te voorkomen. - Breng de chips in een frisse multi well plaat en was 3 keer met de wasoplossing.
- Voer incubatie met secundaire antilichamen uit zoals beschreven in stap 5,3 en 5,4.
- Monteer de chip op een microscopie dia met 20 μL standaard montage medium (bijv. Mowiol).
6. Imaging
Opmerking: Imaging kan worden uitgevoerd op een standaard confocale Microscoop. Hier geven we alleen aanbevelingen om een beeldkwaliteit te garanderen die voldoende is voor de daaropvolgende kwantitatieve analyse.
Let op: om te voorkomen dat elke operator bias, de kolonies tot beeld moeten alleen worden gekozen met behulp van de nucleaire envelop signaal (om te zien of een kolonie goed volgt de vorm van het patroon). Vermijd het controleren van het signaal van belang-markers, behalve bij het aanpassen van de Microscoop-instellingen.
- Zorg ervoor dat de bijboekings bitdiepte 12 of 16 bits is.
- Identificeer de juiste instellingen om het dynamische bereik voor elk beeld kanaal te maximaliseren. Vermijd in het bijzonder het knippen van afbeeldingen.
- Neem een kanaal op om de micro patroon autofluorescentie te afbeelen (Zie Figuur 3).
- Pas de beeldgrootte en zoomfactor aan om Voxel-grootten te verkrijgen variërend tussen 0,1 en 0,6 μm in de x-en y-assen en variërend tussen 0,2 en 2 μm in de z-as.
Opmerking: bijvoorbeeld, in deze studie, we gebruikten een omgekeerde Scanning confocale Microscoop met een 40x doelstelling (numerieke diafragma gelijk aan 1,3), een beeldgrootte van 1024 x 1024 pixels zonder digitale zoom en een z-stapgrootte van 0,5 μm. Dit resulteerde in een Voxel-formaat van 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm. - Definieer voor elke kolonie de minimale en maximale positie langs de z-as om ervoor te zorgen dat de hele kolonie wordt verworven. Ten minste één vlak met een laag tot geen signaal moet onder en boven de kolonie worden opgenomen.
- Zorg ervoor dat de z-stack oriëntaties consistent worden verworven (altijd van boven naar beneden of altijd van beneden naar boven)
- Pas de scansnelheid, beeldresolutie, frame Middelings-en detector winsten aan om een optimale tussen beeldkwaliteit en beeld tijd te bepalen. Als indicatie was de beeld tijd voor één kolonie zoals weergegeven in Figuur 3 ongeveer 2 – 3 min. Voer de beeld verwerving uit.
Let op: alle afbeeldingen, om vergelijkbaar te zijn, moeten worden verworven op dezelfde Microscoop met dezelfde objectieve en acquisitie-instellingen. - Sla aan het einde van de overname alle afbeeldingen op en wijs een unieke naamgevingsconventie toe om de experimentele voorwaarde te identificeren die elke afbeelding vertegenwoordigt.
Opmerking: Zie Figuur 4 als voorbeeld wordt dit Verdrag later tijdens de analyseprocedure gebruikt. Merk op dat afbeeldingen kunnen worden opgeslagen in elk formaat dat wordt ondersteund door BioFormats 26. Als kolonies groter zijn dan het gezichtsveld, kan de stiksels plugin van ImageJ worden gebruikt27. Houd er ook rekening mee dat in geval van stiksels, verlichtings correctie nodig kan zijn.
7. beeldanalyse
Opmerking: de aanbevolen computerspecificaties voor deze procedure is: 16 GB RAM, een multi-core 3,33 GHz CPU, en ten minste 50 GB schijfruimte (of meer, afhankelijk van het aantal chips die zijn afgebeeld). De software is getest op Linux, Windows en MacOS. PickCells is een platformoverschrijdende beeldanalyse applicatie met een grafische gebruikersinterface gewijd aan de analyse van de collectieve organisatie van de cellen in complexe multidimensionale beelden (Blin et al, in voorbereiding). Merk op dat meer informatie over PickCells en documentatie voor de specifieke modules die hier worden vermeld, online te vinden is: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Merk ook op dat de interface onderhevig is aan verandering als we de software blijven verbeteren. Als de interface verschilt van wat wordt weergegeven in de afbeelding of video, raadpleeg dan de online handleiding.
- Installeer en voer PickCells uit na de online beschikbare documentatie.
- Importeer afbeeldingen en controleer de juistheid van de verstrekte informatie (Figuur 4-1).
- Documenteer de naam van elk kanaal.
- Segment kernen gebaseerd op het nucleaire envelop signaal met behulp van de nessys-module28 (Figuur 4-2) en geef een voorvoegsel ("kernen" bijvoorbeeld) die zal worden gebruikt om de gegenereerde gesegmenteerde afbeeldingen een naam te geven.
Opmerking: Documentatie over gebruiks-en parameter aanpassingen u vinden op https://framagit.org/pickcellslab/nessys. - Inspecteer en bewerk zo nodig segmentaties met behulp van de segmentatie-Editor module (Figuur 4-3)
Opmerking: als het segmentatie proces om welke reden dan ook geen bevredigende resultaten heeft opgeleverd, Verwijder handmatig afbeeldingen in de databasemap en verwijder het knooppunt ' segmentatie resultaat ' in de metamodel -weergave. Herhaal vervolgens stap 7,4 en 7,5. Als de segmentatie van slechts een kleine subset van afbeeldingen geen bevredigende resultaten opgeleverd, gebruik dan de Nessys standalone applicatie (Zie de link in 7,4), proberen segmentatie op de ' defecte afbeeldingen ' en vervang het bijbehorende bestand in de databasemap). - Segmenteer het patroon autofluorescentie signaal met behulp van de basis segmentatie module (Figuur 4-4)
- Geef een voorvoegsel (bijvoorbeeld "patroon") dat wordt gebruikt om de gegenereerde gesegmenteerde afbeeldingen een naam te geven.
- Selecteer het kanaal met het autofluorescentie signaal.
- Apply ruisonderdrukking; over het algemeen met behulp van een Gaussiaanse filter met een kernel grootte van 10 x 10 x 0,5 voxels geeft bevredigende resultaten.
- Stel de lagere drempelwaarde in zodat de achtergrond blauw wordt weergegeven terwijl de voorgrond wit wordt weergegeven. Stel ook de bovengrens in op de maximale waarde om te voorkomen dat hoge intensiteiten worden uitgesloten van het eindresultaat (rode gebieden).
- Selecteer overslaan voor de laatste stap.
- Klik op Voltooien en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.
- Wat nuclei betreft, kunnen segmentatie resultaten nu visueel worden geïnspecteerd en indien nodig gecorrigeerd met behulp van de segmentatie-Editor module (Figuur 4-5).
- Maak kernen-objecten en bereken elementaire object functies.
- Start de module intrinsieke onderdelen vanuit de taakbalk aan de linkerkant van de Hoofdinterface (Figuur 4-6).
- Sluit het beletselteken fitter en de Surface Extractor om alleen het deelvenster basisfuncties open te houden.
- Kies Nucleus als objecttype en kies het voorvoegsel dat is opgegeven in stap 7,4 voor "gesegmenteerde afbeeldingen".
- Druk op Compute en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.
Opmerking: na deze stap is het niet mogelijk om de kernen segmentaties opnieuw te bewerken.
- Maak patroon objecten en bereken elementaire object functies. Herhaal de stappen 7.8.1 naar 7.8.4, alleen deze tijd kiest u aangepast type als objecttype en het voorvoegsel dat is opgegeven in stap 7.6.1 voor gesegmenteerde afbeeldingen.
Opmerking: na deze stap is het niet mogelijk om de patroon segmentaties opnieuw te bewerken. - Sla de naam van de afbeelding op waarvan elke Nucleus deel uitmaakt als een Nucleus-kenmerk.
- Klik op Data ≫ nieuw attribuut en selecteer Nucleus in het pop-upvenster en klik op OK.
- Selecteer gegevens verzamelen van andere objecten die zijn verbonden met het knooppunt en klik op volgende.
- Selecteer in het linkerdeelvenster afbeelding en dubbelklik vervolgens op het ondervragend merk onder de vlag Voltooien in het deelvenster paddefinitie om het afbeeldings knooppunt in te stellen als doel van het pad.
- Vouw het deelvenster beschikbare kenmerken in het linkerdeelvenster uit en selecteer het kenmerk name .
- Vouw het deelvenster reductie bewerking uit en selecteer Get One, klik vervolgens op de knop wijzigen en klik op volgende.
- Typ "image name", druk op de tab-toets en klik op OK.
- Creëer een "genormaliseerd coördinaat" attribuut in kernen objecten (Figuur 4-7).
- Pas stappen 7.10.1 aan 7.10.6 voor het opslaan van de coördinaten van het patroon centroïde als een Nucleus kenmerk. Noem dit nieuwe attribuut "patroon coördinaat".
- Klik vervolgens op Data ≫ nieuw attribuut, selecteer Nucleus en klik op OK.
- Selecteer een functie definiëren tussen ruimtelijke of richtingsvectoren van het knooppunt en klik op volgende.
- Voor type functie Selecteer array bewerking, voor v1 Selecteer item vector en vervolgens Centroïde, en voor v2 Selecteer item vector en vervolgens patroon coordinate.
- Klik op volgende, typ "genormaliseerde coördinaat" in het veld naam en klik op Voltooien.
- Exporteer de gegevens naar een bestand met door tabs gescheiden waarde.
8. R-analyse
- Download en installeer Rstudio.
Opmerking: software-informatie en downloadkoppelingen zijn beschikbaar op https://www.rstudio.com/. - Download de R-scripts die nodig zijn voor deze analyse.
Opmerking: scripts kunnen worden gedownload van de GitLab repository: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr. - Open Rstudio.
Opmerking: als u de scripts voor de eerste keer uitvoert, installeert u de vereiste R-pakketten (ggplot2 en Scales). - Open de binnedmap_template in Rstudio. R-script.
- Stel de werkmap in op de locatie van het bronbestand.
- Volg de instructies in het script om het script aan te passen aan een bepaalde gegevensset om ruimtelijke kaarten te verkrijgen zoals weergegeven in afbeelding 5.
- Voer het script om dichtheids toewijzingen te genereren.
Representative Results
De hier beschreven foto-patterning methode maakt het mogelijk om gekweekte cellen nauwkeurig te organiseren in kolonies van gedefinieerde vormen en maten. Het succes van deze procedure moet duidelijk zichtbaar zijn onmiddellijk na de celseeding-procedure (stap 3,7), omdat de cellen in de cel worden afgestemd op het photomask-ontwerp zoals weergegeven in Figuur 2a. Bij 1 h na het zaaien van cellen kunnen individuele patronen niet volledig samengaan (slechts een paar cellen per patroon), maar naarmate de cellen na verloop van tijd toenemen, zullen patronen volledig gekoloniseerd worden met slechts zeer weinig cellen buiten de Kleef vlakken (Figuur 2b). Het exacte uiterlijk van de cultuur zal afhankelijk zijn van de cellijn. Bijvoorbeeld, mESC vorm kolonies in koepel vorm10. Een chip waarbij patronen niet helder zijn 1 tot 2 uur na het zaaien van cellen geeft aan dat de procedure is mislukt (figuur 2c, d).
Grote en dikke kolonies kunnen soms een uitdaging zijn om homogeen te vlekken. Wij stellen voor om te repareren en permeabilize de cellen in één stap (sectie 4) als dit kan verbeteren antilichaam penetratie29. Dit is de reden waarom de gekozen fixatieve oplossing een reinigingsmiddel bevat. Figuur 3 toont het fluorescentie signaal dat na immunokleuring wordt verwacht. Merk op dat heldere Id1 positieve cellen worden gevonden in dichte gebieden (heldere NPC-gebieden) van de kolonies (Figuur 3a). Hints zoals deze zijn nuttig om de kwaliteit van de antilichaam kleurings procedure te beoordelen. Merk ook op dat de micro patronen gemaakt met de huidige techniek zijn auto fluorescerende. Dit signaal (afbeelding 3a, B links de meeste afbeeldingen) is nuttig tijdens de analyse fase om kolonies met elkaar te registreren en de resultaten te creëren die worden weergegeven in Figuur 5. Het autofluorescentie signaal is over het algemeen de helderste wanneer het monster opgewonden is met een 405 nm laser en dit kanaal moet zonder vlekken voor dit doel worden achtergelaten. Figuur 3 laat ook zien hoe de cellen nauwkeurig worden beperkt op patronen van verschillende vormen.
De analyse van beeldvormende gegevens wordt uitgevoerd in PickCells, een gratis en open-source software ontwikkeld in ons lab (Blin et al., in voorbereiding). Deze software bevat de beeldanalyse modules om confocale beelden (Figuur 4-1) te lezen en te sorteren, om te segmenteren (Figuur 4-2,4-4) en om gesegmenteerde objecten te cureren (Figuur 4-3, 4-5), om object te berekenen eigenschappen zoals coördinaten of gemiddelde intensiteit (Figuur 4-6) en om de gegevens te exporteren (Figuur 4-7, 4-8). Belangrijk, we ontwikkelden een robuuste nucleaire segmentatie methode genaamd Nessys28 die is vooral geschikt voor dichte en heterogene populaties van cellen, zoals cellen geteeld op micro patronen (Figuur 3). Figuur 4 -2 toont een representatieve uitvoer van de nessys-module waar elke afzonderlijke cel nauwkeurig een unieke kleuridentiteit krijgt. Slechts minimale bewerking moet nodig zijn, maar bewerking is haalbaar als de gebruiker dit besluit (Figuur 4-3). Eindelijk PickCells biedt een aantal visualisatie modules om de gegevens te visualiseren. Een voorbeeld is gegeven in Figuur 4-6: een ringvormige kolonie wordt gerenderd in 3D, waar kernen in kleur gecodeerd zijn volgens hun positie langs de z-as. Zodra de analyse is gevalideerd in PickCells, kunnen gegevens worden geëxporteerd om de ruimtelijke kaarten in R te maken met behulp van de scripts die beschikbaar zijn op (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) zoals weergegeven in afbeelding 530.
We hebben onlangs aangetoond dat de ruimtelijke opsluiting van mESC op kleine (30.000 μm2) schijf of ellips micropatterns het patroon begeleidt van een subpopulatie van cellen die de mesodermale marker tbra10uitdrukken. Dus, om onze methode hier te illustreren, vragen we of het patroon van Tbra kan worden beïnvloed door BMP-signalering in grotere kolonies (90.000 μm2). Figuur 5a laat zien dat wanneer MESC worden geteeld op grote schijf Micropatterns, tbra + cellen bij voorkeur beperkt tot de omtrek van het patroon (tbra + dichtheids kaart), waar de lokale celdichtheid de laagste is (Zie de blauwe kaart aan de linkerkant van figuur 5a ). Dit patroon van Tbra wordt bevestigd door de kaart van de gemiddelde intensiteit van de Tbra.
Deze gegevens tonen aan dat de methode subvisuele informatie kan onthullen. Sterker nog, uit Figuur 3is een visuele inspectie van één kolonie niet voldoende om enige vorm van ruimtelijke ordening in de tbra-uitdrukking te identificeren. Dit wordt met name verklaard door de belangrijke kolonie van de variabiliteit van de kolonie die wordt gekwantificeerd en weergegeven in het meest rechtse paneel van figuur 5a.
De techniek toont ook aan dat er geen detecteerbaar patroon bestaat voor Id1 (een doelwit van BMP-signalering), wat kan aangeven dat T-patroon niet wordt aangestuurd door BMP-signalering in deze context.
Micropatterning maakt het mogelijk om kolonies te dwingen om bijna elke gewenste geometrie aan te nemen. Dit is met name handig om te ondervragen hoe het systeem reageert op verschillende geometrieën. We kunnen bijvoorbeeld de reden hebben dat als een morfogen gradiënt in het midden van de kolonie opbouwt, het creëren van een gat in de kolonie deze gradiënt zou verstoren. Interessant is dat we nog steeds patronen observeren op een ring micro patroon, zij het op een minder robuuste manier (Figuur 5b).
Figuur 1: overzicht van de methode. Het diagram dat de belangrijkste stappen van de methode weergeeft. Voor elke stap wordt de geschatte hoeveelheid tijd aangegeven onder de naam van de taak en een schematische voorstelling van het doel van de procedure. Een verwijzing naar een relevant cijfer wordt ook verstrekt indien beschikbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Cultuur uiterlijk 1 uur en 48 uur na het zaaien van de cellen op micro patronen. Brightfield-beelden van mESC zijn op micro patronen geseeid. a) verwachte celorganisatie 1 uur na het zaaien moeten de patronen duidelijk herkenbaar zijn. b) verwacht resultaat na 48 h van de culturen. mESC zijn toegenomen en zijn nog steeds strikt beperkt tot de patroon vormen. (c-d) Mogelijke niet-optimale uitkomsten, ofwel zeer weinig cellen houden zich aan het plastic, behalve aan de omtrek van de dia (c) of cellen zich tussen de patronen (d) hechten. Zie tabel 2 voor een gids voor probleemoplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve confocale beelden van immuunbevlekte kolonies die op micro patronen zijn geteeld.
Representatieve mESC-kolonies na immunofluorescentie voor (A) Id1 en nucleair porie complex of (B) tbra en LaminB1. Voor elke kleuring, een kolonie geteeld op een schijf micro patroon en een kolonie geteeld op een ring micro patroon wordt getoond. Afzonderlijke kanalen worden geleverd als afbeeldingen met een grijs schaal. Let op het duidelijke automatische fluorescentie signaal van het micro patroon (405 nm Laser excitatie). Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: stroomdiagram van de beeldanalyse procedure. Een lijst met 3D-confocale beelden wordt voor analyse geïmporteerd in PickCells (1). Dit voorbeeld toont een experiment met twee verschillende vormen (schijven en ringen zoals in Figuur 2). De naamgevingsconventie voor afbeeldingen wordt weergegeven aan de linker-en PickCells-interface aan de rechterkant. Vervolgens wordt de Nessys-module gebruikt om automatisch kernen te segmenteren (2). In de screenshot krijgt elke individuele Nucleus een unieke kleur die nauwkeurige segmentatie aangeeft. De auto fluorescentie van het patroon is ook gesegmenteerd, dit keer, met behulp van de ' basis segmentatie ' module (4). Achtergrond wordt weergegeven in blauw en wit signaal wordt gedefinieerd als de patroon vorm. Gesegmenteerde vormen worden vervolgens visueel geïnspecteerd om nauwkeurige segmentatie te garanderen, en indien nodig bewerkt met behulp van de segmentatie-Editor module (3 – 5). De schermafbeeldingen tonen de omtrek van de gedetecteerde vormen. De roze en gele vormen zijn bewerkt. Ten slotte worden objecten functies berekend en geëxporteerd naar een bestand dat later wordt verwerkt tot R (6 – 7). Een screenshot van een kolonie weergegeven als een 3D-weergave is voorzien (6). Voor de stappen 2 tot 6 de pictogrammen gevonden in de PickCells-interface op het moment van schrijven van dit artikel worden gegeven naast de stap-index. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve resultaten voor twee verschillende transcriptiefactoren en micro patroon vormen
Binned ruimtelijke kaart voor mESC geteeld voor 48 h op (a) schijfvormige micro patronen of (B) ringvormige micro patronen. Voor elke micropattern vorm wordt de kaart van celdichtheid, ongeacht het fenotype van de cel, links met een blauwe kleur schaal getoond. Vervolgens voor elke marker (Tbra op de bovenste rij en Id1 op de onderste rij), drie verschillende kaarten worden verstrekt, van links naar rechts: celdichtheids kaart van marker die alleen cellen uitdrukt (op drempel gebaseerde analyse), de kaart van de gemiddelde markerings intensiteit (LOG2) en de kaart van de standaarddeviatie van de markerings intensiteit. Intensiteiten worden gegeven als willekeurige fluorescentie-eenheden. Voor elke kaart wordt de micro patroon vormgegeven als een witte omtrek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| ECM-type | Gelatine | Fibronectin | Membraan matrix in de kelder | |
| Concentratie | ECM-concentratie | 1 mg/mL | 20 μg/mL | 200 μg/mL |
| Poloxamer 407 concentratie | 500 μg/mL | 400 μg/mL | 1 mg/mL | |
| Getest met | mESC | Ja | Ja | Ja |
| Mepisa | No | Ja | Ja | |
| Serum vrij medium | No | Ja | Ja |
Tabel 1: geteste concentraties van poloxameer 407 en ECM. Deze tabel geeft een overzicht van de concentraties van ECM en poloxameer 407 die we in ons laboratorium hebben getest. Voor elke ecu/poloxamer 407-combinatie wordt het celtype waarvoor het patroon succesvol is bereikt, getoond, evenals de vraag of de cultuur serum bevatte of niet. mESC = embryonale stamcel van de muis, Mepisa = muis epiblast stamcel.
| Procedure | Observatie | Mogelijke probleem | Oplossing |
| Micropatterning | Lage celbevestiging | ongeschikte ECM/poloxamer 307 concentratie ratio | Verhoog de concentratie ratio ECM/poloxamer 307 |
| Celbijlage tijd te kort | Verhoog de incubatietijd om voldoende tijd te geven aan de cellen om zich goed te houden aan patronen (stap 3,4). Om deze stap te optimaliseren, kan het controleren van de cellen onder een Microscoop helpen bij het detecteren van een verandering in celmorfologie die aangeeft dat de cellen zijn begonnen te hechten. | ||
| Wast te intens (stap 3,6) | Voor het vervangen van medium, Vermijd Pipetteer medium rechtstreeks op de chips. Pipet in plaats daarvan het medium zachtjes op de wanden van de put in plaats | ||
| Cellen houden zich tussen de patronen | ongeschikte ECM/poloxamer 307 concentratie ratio | Verlaag de concentratie ratio ECM/poloxamer 407 | |
| Celbijlage tijd te lang | Verlaag de incubatietijd (stap 3,4). | ||
| Wast ineffectief (stap 3,6) | De plaat krachtig schudden is meestal voldoende om de cellen in overmaat te losmaken. Voor celtypen die de neiging hebben om sterk aan de chip te hechten, kan pipetteren rechtstreeks op de chip het resultaat verbeteren. Het verhogen van het aantal wast kan ook helpen, met name om ervoor te zorgen dat er geen cel zwevend in het medium na deze stap blijven. | ||
| Cellen volgen niet strikt de patroon vorm | ' Incompatibel ' celtype en patroon geometrie | Plan/ontwerp meerdere geometrieën/grootten die aan de photomask worden toegevoegd om de optimale patroon grootte voor een bepaalde patroon vorm en celtype te kunnen testen en identificeren. Raadpleeg de sectie ' beperkingen ' in de discussie | |
| Niet-optimale foto-patterning, dit kan worden gediagnosticeerd door het observeren van de scherpte van het autofluorescentie signaal. Patroon grenzen moeten scherp uitzien zoals in Fig. 2. Als de randen van de patronen wazig worden weergegeven, moet de foto-patterning stap worden verbeterd. | Scherpe patroon randen geven aan dat de plastic Slide niet dicht genoeg bij het oppervlak van het masker was tijdens de verlichtings stap. Zorg ervoor dat de stukken die de glijbanen aan de photomask vasthouden zelfs zijn en dat er tijdens de verlichtings procedure een constante en voldoende druk op de montage wordt uitgeoefend. | ||
| Kleuring | Niet-homogene kleuring | incubatietijd van het antilichaam te kort | Verhoog de incubatietijd van het antilichaam (tot 24 uur bij kamertemperatuur) |
| kolonies afgevlakt tijdens de montage procedure | Monteer micro patroon dia's in een kamer zoals chamlide of cytoo-kamers om zowel immunokleuring als beeldvorming uit te voeren zonder de cellen te hoeven monteren. Dit zal beter de kolonies 3D-structuur te behouden. | ||
| Loskoppelen van kolonies tijdens de kleurings procedure | Dewetting van de chip | Laat voldoende medium staan of gebruik 2 pipetten, één om het medium te verwijderen en de andere om de nieuwe oplossing toe te voegen | |
| Kolonies lijken onder de Microscoop geschoren | kolonies werden geschoren tijdens het monteren van de chip op de microscopie dia | Wees heel voorzichtig bij het monteren van de chips. Als alternatief worden de micropatterns in een kamer, zoals chamlide of cytoochambers, op een andere wijze uitgevoerd om zowel immunokleuring als beeldvorming uit te voeren zonder de cellen te hoeven monteren. Dit behoudt ook de kolonie ultrastructure. |
Tabel 2: gids voor probleemoplossing. Deze tabel geeft een overzicht van mogelijke suboptimale uitkomsten. De potentiële bronnen van de problemen worden ook vermeld samen met de aanbevolen oplossingen.
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het analyseren van emergente patronen in culturen van cellen. Een vereenvoudigde micropatterning benadering wordt gebruikt voor het standaardiseren van de vorm en grootte van celkolonies, en we presenteren beeldanalyse tools en R-scripts die de detectie en kwantificering van patronen binnen deze kolonies mogelijk maken.
De pijpleiding die wij voorstellen is in zekere mate vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde methode31 , waarbij de auteurs zich richten op de cultuuromstandigheden, met behulp van commercieel verkrijgbare micro patronen, om reproduceerbare kiem lagen vorming te verkrijgen in ESC-kolonies voor de studie van vroege gastrulatie-Events in vitro. Ons doel is meer gericht op het leveren van een generaliseerbare pijpleiding voor de ontdekking van patroonvorming in vitro, waar de collectieve organisatie van de cellen pas zichtbaar kan worden na statistische analyse. Daarom bieden we een robuuste beeldanalyse-workflow die de nauwkeurige identificatie en analyse van de nucleaire positie in de 3D-ruimte over meerdere kolonies mogelijk maakt (Zie ook de sectie ' voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode ' van deze discussie). We hebben ook besloten om een eenvoudige in-House micropatterning aanpak te ontwikkelen die een flexibeler en goedkoper alternatief biedt voor commercieel beschikbare oplossingen op de lange termijn, wat hopelijk nuttig zal zijn voor de Gemeenschap.
Ten slotte merken we op dat tijdens de herziening van dit manuscript, een nieuw pakket voor de analyse van patronen in vitro vergelijkbaar met onze R-scripts is uitgebracht32. Dit nieuwe pakket accepteert tabellen van celfuncties als invoer die kunnen worden verkregen van high-throughput Imaging platforms. Wij zijn van mening dat de tabel van kernen-functies die in stap 7 van ons protocol zijn gegenereerd in principe als input voor dit nieuwe pakket kan dienen, hoewel we deze mogelijkheid zelf niet hebben getest.
Aanpassingsvermogen van de methode voor andere celtypen en kolonie geometrieën
We presenteren deze aanpak in de context van het bestuderen van de opkomst van mesodermale transcriptiefactoren in culturen van pluripotente cellen in de aanwezigheid van serum. De methode is echter gemakkelijk aanpasbaar aan andere celtypes en aan serum vrije culturen, hoewel het nodig kan zijn om de concentraties ECM/poloxamer 407 te optimaliseren (Zie tabel 1 voor geteste concentraties en tabel 2 voor een gids voor probleemoplossing). De methode kan ook worden aangepast aan grotere of kleinere maten van micro patronen en aan een breed scala aan vormen op basis van de behoeften van de gebruiker. Bij het vaststellen van de methode is het echter belangrijk om te beseffen dat niet alle combinaties van vorm/celtype optimaal zijn. Bijvoorbeeld, MESC Express hoge niveaus van E-cadherin33,34 waardoor deze cellen te vormen van collectieve structuren spanning gebieden die verstoken zijn van ECM. Deze cellen volgen niet strikt geometrieën met scherpe hoeken of die kleine gaten in het patroon bevatten. Let op bijvoorbeeld dat op de ring van Figuur 3b, de cellen zijn in het proces van het koloniseren van het centrale gebied. In onze handen heeft een kleiner centraal gebied het mESC niet dwingen om ringvormige kolonies te vormen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om een verscheidenheid aan geometrieën op te nemen tijdens het ontwerpen van de photomask om de optimale maten en krommingen te kunnen testen en te identificeren die geschikt zijn voor het celtype keuze.
Een andere belangrijke factor om rekening mee te houden is de lengte van het experiment en de proliferatie van de cellen. Voor sommige snel prolifererende celtypen (inclusief pluripotente cellen) kan het moeilijk zijn om cellen op micropatterns gedurende vele dagen te onderhouden (voor mESC drie dagen is een maximum). Ook is het zaaien van cellen op micro patronen niet altijd optimaal voor elke kolonie, dus het is raadzaam om een overmaat aan kolonies te zaaien om reserveonderdelen te krijgen.
Voordeel en beperkingen van de patroon detectiemethode
Een bijzonder voordeel van de methode is de mogelijkheid om "gemiddelde" patronen te detecteren door het combineren van beeldanalyse resultaten van meerdere replicaten (Figuur 5). Dit kan patronen onthullen die niet blijken uit de inspectie van individuele kolonies. Een nadeel van deze ' Middelings '-aanpak is dat het bepaalde soorten repetitieve patronen kan missen, bijvoorbeeld kleine vlekken of smalle strepen. Echter, deze soorten patroon kan in plaats daarvan worden onthuld met een combinatie van zorgvuldig gekozen patroon maten8. De pijplijn voorbeeld analyse die hier wordt beschreven, biedt ook kwantitatieve gegevens op zowel single cell-als Colony-resoluties die de mogelijkheid bieden om het niveau van Inter-kolonie variabiliteit te onderzoeken (Figuur 5) of om neighbor-analyse uit te voeren op meerdere Weegschaal10.
Een ander belangrijk voordeel van de gemiddeldenmethode is dat het de mogelijkheid biedt om de preferentiële locatie van veel markers in kaart te laten komen zonder te worden beperkt door beschikbare fluor Foren van detectie kanalen. Inderdaad, hoewel we gebruik maken van slechts twee markers van differentiatie in het hier gepresenteerde werk, maakt het vermogen om kolonies te standaardiseren en "gemiddelde" patronen te extraheren het mogelijk om de distributie kaarten van verschillende verzamelingen van kolonies samen te vergelijken in volgorde om de gegeneraliseerde ruimtelijke relaties van markers aan elkaar te onthullen.
Bovendien, hoewel onze focus hier is geweest om markers van differentiatie te bestuderen, kan de analysemethode worden uitgebreid om andere biologische processen te bestuderen waarvoor nucleaire markers beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld micropatterning van een cellijn die een fluorescentie-celcyclus indicator35 (fucci) bevat, zou het mogelijk maken om te bestuderen hoe de geometrie van het kolonie niveau de celcyclus gebeurtenissen in de groep kan beïnvloeden.
Toekomstige richtingen
De methode is geschikt voor middellange doorvoer beeldanalyse, echter, Image Acquisition is momenteel niet volledig geautomatiseerd en kan worden beperkt voor zeer grote experimenten. De reguliere regelingen van kolonies moeten het mogelijk maken om volledig geautomatiseerde overname routines te creëren die vergelijkbaar zijn met wat is ontwikkeld voor het gemiddelde van de enkelvoudige cel20. Echter, omdat de grootte van het veld dat nodig is om een kolonie te beeld is groot, mogelijk vereisen mosaicking, en omdat kolonies zijn driedimensionaal, het is zeer wenselijk om zowel dataset grootte en acquisitie tijd te verminderen door het Imaging alleen relevante kolonies. Daarom kunnen toekomstige inspanningen worden besteed aan het ontwikkelen van een ' intelligente ' Microscoop die relevante kolonies kan identificeren en de beeld coördinaten aan elk monster aanpast. Dit zal niet alleen verminderen tijd en moeite, maar ook voorkomen dat potentiële operator biases.
De analyse pijplijnen kunnen ook efficiënter worden gemaakt door het aantal stappen te verminderen dat de gebruiker moet nemen. We hebben plannen om een mechanisme voor het bouwen van pijpleidingen te bouwen en R rechtstreeks in onze software te integreren (Zie ook problemen met pickcells-API # 3 en pickcells-rjava # 1 in de issue tracker van onze code repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). De volledige automatisering van de analyseprocedure zal tijd en moeite verminderen en potentiële gebruikers fouten beperken.
Tot slot merken we op dat onze analysemethode het dynamische karakter van cellulair patroon nog niet volledig vastlegt. Sommige beperkte dynamische informatie kan worden geëxtraheerd door het onderzoeken van een tijdreeks van momentopnamen van afbeeldingen8,10,36. Echter, de mogelijkheid om de geschiedenis van de celpopulatie op te nemen is zeer wenselijk als we willen beter begrijpen hoe patronen ontstaat. Een beperking is dat het nauwkeurig volgen van afzonderlijke cellen in een 3D-dichte celpopulatie nog steeds een zeer uitdagende taak is37. Onze cel detectiemethode maakt gebruik van de nucleaire envelop en presteert bijzonder goed op dichte en overlappende celpopulaties28. Live verslaggevers van de nucleaire envelop zijn gemakkelijk beschikbaar28,38 en een voordeel van de micropatterning techniek is dat het kan worden gebruikt om te voorkomen dat de cellen verplaatsen buiten het gezichtsveld tijdens de lange termijn beeldvorming. Over het algemeen zijn we ervan overtuigd dat het geautomatiseerd volgen van cellen haalbaar is met behulp van een combinatie van recent opgerichte tools28,39,40 en dat dit nieuwe inzichten moet opleveren in de fundamentele principes van zelforganisatie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een Sir Henry Wellcome post-doctoraats Fellowship (WT100133 to G.B.), een Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA tot S.L.), en een Wellcome Trust PhD studentship to (108906/Z/15/Z tot D.W.). We zijn ook Dr. Manuel Thery dankbaar voor zijn advies over de aanpassing van de photopatterning-techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
| 1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
| 5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
| Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
| Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
| Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
| Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
| Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
| CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
| Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
| Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
| Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
| Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
| mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
| NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
| PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
| PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
| Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
| Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
| Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
| Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |
References
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878 (2018).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939 (2017).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
- Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
- Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366 (2017).
- Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
- Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438 (2009).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514 (2010).
- Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
- Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
- Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
- Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872 (2018).
- Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106 (2010).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
- Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384 (2019).
- Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
- Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839 (2018).
- Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141 (2017).
- Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
- McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).
