Summary
הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.
Abstract
רגולציה של ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בכל התאים. ההמרה, לאחר ההמרה (או עיבוד RNA), הטרנסלtional והשלבים שלאחר ההעברה משמשים לוויסות גנים ספציפיים. ספציפי לרצף חומצות גרעין-מחייב חלבונים היעד רצפים ספציפיים לשלוט ביטוי גנים מרחביים או זמני. אתרי הכריכה בחומצות גרעין מאופיינים בדרך כלל בניתוחי מבצעים. עם זאת, לחלבונים רבים של עניין אין אתר מחייב ידוע לאפיון כזה. כאן אנו מתארים גישה כדי לזהות אתרי איגוד לא ידועים בעבר עבור חלבונים כריכת RNA. היא כוללת בחירה איטרטיבית והגברה של רצפים החל במאגר רצף אקראי. בעקבות מספר סיבובים של צעדים אלה-תמלול, כריכה והגברה-הרצפים המועשרת מנצנצים כדי לזהות אתרי איגוד מועדפים. הצלחה בגישה זו מפוקחת על ידי שימוש באיגוד מתורבת. לאחר מכן, בתוך מבחנה ובvivo פונקציונלי ניתן להשתמש כדי להעריך את הרלוונטיות הביולוגית של הרצפים שנבחרו. גישה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של אתר מחייב שאינו ידוע בעבר עבור כל חלבון של איגוד RNA שעבורו קיים שיטה להפריד בין מאוגד לחלבון וללא מאוגד.
Introduction
בביולוגיה של התאים, רגולציה. גנטית ממלאת תפקיד מרכזי באחד או מספר שלבים לאורך מסלול ביטוי הגן, גנים יש את הפוטנציאל להיות מוסדר. שלבים אלה כוללים תמלול (ייזום, התארכות וסיום), כמו גם שחבור, פוליאדלציה או 3 ' היווצרות בסוף, RNA ייצוא, התרגום mRNA, ו ריקבון/לוקליזציה של תעתיקים העיקרי. בשלבים אלה, חומצות גרעין מחייב חלבונים לווסת את רגולציה גנים. זיהוי של אתרי איגוד עבור חלבונים כאלה הוא היבט חשוב של לימוד בקרת גנים. ניתוח מועד והשוואת הרצף פילוגנטי שימשו כדי לגלות רצפי רגולציה או מחייב חלבונים אתרים בחומצות גרעין, כגון היזמים, אחוי אתרים, מרכיבים פוליאדלציה, ואותות טרנסלtional1, מיכל השני , מיכל שלוש , ד.
שחבור טרום-mRNA הוא צעד אינטגרלי במהלך ביטוי גנים ורגולציה. רוב הגנים המיונקים, כולל אלה בבני האדם, יש היפוגנים. חלק גדול של התעתיקים האלה הוא לחילופין משולב, הפקת מספר mrna ו איזופורמים חלבון מאותו גן או תעתיק ראשוני. איזוטפסים אלה הם בעלי תפקידים ספציפיים לתאים והתפתחותיים בביולוגיה של התא. האתר של 5 ' אחוי, נקודת ההסתעפות, והאתר הנמצא במערכת העיכול/3, מהווה אותות קריטיים הכפופים לרגולציה. בתקנה שלילית, האתר החזק ביותר במקום הוא מודחק, ואילו בתקנה חיובית האתר מופעל בצורה אחרת. שילוב של אירועים אלה מייצר שפע של איזוטפסים ברורים מבחינה פונקציונלית. כריכת ה-RNA חלבונים לשחק תפקידים מרכזיים אלה שחבור האירועים החלופיים.
חלבונים רבים ידועים כאשר האתרים המחייבים (s) או יעדי RNA נשארים להיות מזוהים5,6. קישור חלבונים רגולטוריות למטרות ביולוגיות שלהם במטה או רצפים הוא לעתים קרובות תהליך מורכב. עבור חלבונים כאלה, זיהוי של היעד שלהם RNA או מחייב אתר הוא צעד חשוב בהגדרת פונקציות ביולוגיות שלהם. לאחר מזוהה אתר מחייב, זה יכול להיות מאופיין עוד באמצעות ניתוחים מולקולריים סטנדרטיים ביוכימיים.
לגישה המתוארת כאן יש שני יתרונות. ראשית, הוא יכול לזהות אתר מחייב לא ידוע בעבר עבור חלבון של עניין. שנית, יתרון נוסף של גישה זו הוא שהוא מאפשר בו זמנית מוטזיס רוויה, שאחרת תהיה עבודה אינטנסיבית להשגת מידע דומה על דרישות הרצף בתוך אתר האיגוד. כך, הוא מציע כלי מהיר, קל יותר, פחות יקר לזהות אתרי כריכת חלבון ב-RNA. במקור, גישה זו (SELEX או האבולוציה שיטתית של ליגנדס על ידי העשרה מעריכית) שימש כדי לאפיין את האתר מחייב עבור בקטיוגה T4 DNA פולימראז (הגן 43 חלבון), אשר חופף עם האתר המחייב הריבוכמה ב-mRNA שלה. אתר הכריכה מכיל רצף לולאה של 8 בסיסים, המייצג 65,536 גרסאות אקראיים לניתוח7. שנית, הגישה השתמשה גם באופן עצמאי כדי להראות כי אתרים מסוימים מחייב או aptamers עבור צבעים שונים ניתן לבחור מתוך בריכה של כ 1013 רצפים8. למעשה, גישה זו היתה בשימוש נרחב בהקשרים שונים רבים כדי לזהות aptamers (RNA או רצפי DNA) עבור כריכת ליגנדס רבים, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, תאים, ועבור מזרז9. כדוגמה, aptamer אלף יכול להפלות בין שתי הנגזרות האלה, קפאין ו-הפסלין, אשר שונים על ידי נוכחות של קבוצת מתיל אחד בקפאין10. השתמשנו בהרחבה בגישה זו (SELEX או הגברה בחירה איטראטיבית) כדי ללמוד כיצד להשתמש בחלבונים מבוססי RNA הפועלים באמצעות שחבור או בתקנה11, אשר יהיה הבסיס לדיון להלן.
הספרייה האקראית: השתמשנו בספריה אקראית של 31 נוקלאוטידים. השיקול האורך עבור הספרייה האקראית היה מבוסס באופן רופף על הרעיון כי הU2AF הכללית גורם השחבור65 נקשר לרצף בין רצף נקודת ההסתעפות לבין 3 ' אחוי האתר. בממוצע, המרווח בין האותות האלה במטזואים הוא בטווח של 20 עד 40 נוקלאוטידים. חלבון אחר סקס-קטלני היה ידוע לאגד רצף הרגולציה מאופיין גרוע ליד 3 ' אחוי האתר של היעד שלה pre-mRNA, שנאי. כך, בחרנו אזור אקראי של 31 נוקלאוטידים, מוקף באתרי כריכה פריימר עם אתרי אנזים הגבלה כדי לאפשר הגברה PCR והחזקה של היזם T7 RNA פולימראז עבור שעתוק מבחנה. גודל הספרייה התיאורטית או המורכבות היה 431 או כ-1018. השתמשנו בחלק קטן של הספרייה הזאת כדי להכין את בריכת ה-RNA האקראית שלנו (~ 10-12-1015) עבור הניסויים המתוארים להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 1 מספק סיכום של שלבי מפתח בתהליך הגברה בחירה איטראטיבי (selex).
1. יצירת תבנית ספריה אקראית
- לסנתז את פריימר קדימה 5 '- Gtaאטקגנולג ' טtgatcaGATTCTGATCCA-3 ' ואת פריימר הפוכה 5 '-GCGACGgatccaagcttca-3 ' על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA.
הערה: התחל והספרייה האקראית יכולות להיות מעוצבות באופן מסחרי. - סינתזה של ספריה אקראית לאחר התבנית 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) מוצרים לפי סינתזה כימית. השתמש תערובת שווה של ארבעה זרחעות במהלך סינתזה עבור 31 מיקומים אקראיים המוצגת לעיל כ N.
הערה: הרצף של תבנית הספריה מכיל 31 נוקלאוטידים אקראיים (N1 to N31) ורצפים מאגפים עבור איגוד התחל הקדמי והאחורי. התחל הקדמי כולל את הרצף T7 RNA פולימראז (מסומן בקו תחתון) עבור תמלול והגבלה באתר Bcl1 (נטוי) עבור שיבוט. ההילוך ההפוך מכיל אתרי אנזים הגבלה BamH1 ו hindiii (נטוי) כדי להקל על השיבוט.
2. הדור של בריכת הספרייה האקראית DNA
- לצרף את T7 RNA פולימראז היזם לספרייה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המכיל 1 μM DNA תבנית ספרייה אקראית, 1 μM של כל פריימר, 20 מ"מ טריס (pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 50 Mm-kcl, 0.1 μg/μl acetylated, 2 יחידות של taq < /c1 > פולימראז, ו-200 μM כל אחד dNTPs (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deאוקסיציטוטידין, ו deoxyadenosine triphosphate).
- השתמש בחמישה מחזורים של דנטורציה, ריפוי ושלבי הרחבה (94 ° c עבור 1 דקות, 53 ° c במשך 1 דקות, ו-72 ° c עבור 1 דקות) של ה-PCR ואחריו מחזור אחד של הארכה (72 ° c עבור 10 דקות).
3. סינתזה של בריכה 0 RNA
- הגדרת תגובת תמלול של 100 μL12. לערבב T7 מאגר תמלול, 1 μm ספרייה אקראית בריכה DNA, 5 מ"מ dithiotiol (dtt), 2 מ"מ guanosine טריפוספט (gtp), 1 מ"מ כל אחד אדנוזין טריפוספט (ATP), cytidine טריפוספט (ctp), ו uridine טריפוספט (utp), ו 2 יחידות/μl T7 RNA פולימו.
הערה: ניתן להשתמש ב-RNA בציוד מסחרי באמצעות ערכות מסחריות הזמינות עם אפשרות של T7 או SP6 RNA. - מודטה את תערובת התגובה לעיל בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 h ב 37 ° c.
- ג'ל לטהר את ה-RNA ב -10% מתוך ג'ל פוליאקרילמיד.
- לזהות את המיקום של התעתיקים על ג'ל ידי צביעת אותו עם מתילן כחול או אוטומטי על ידי כולל עקבות של רדיואקטיביות (0.5 μL או פחות של α-32P utp) בתגובת תמלול.
- הניחו את פרוסת הג בצינור הצנטריפוגה והתפרסו לחתיכות קטנות יותר, לדוגמה, בעזרת טיפ הומוגניצר. הוסף מאגר פרוטטינואז K (PK) (100 mM טריס, pH 7.5, 150 mM הנאל, 12.5 mM EDTA, 1% נתרן dodecyl סולפט) כדי לטבול את חתיכות ג'ל. השאירו את השפופרת על מרחק של 2 שעות עד הלילה בטמפרטורת החדר.
- ספין בתוך מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה (14,000 rpm או 16,873 x g) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את פסולת ג'ל ולשחזר את פתרון המאגר.
- מערבולת המדגם פעמיים עם נפח שווה של פנול-כלורופורם ופעם אחת עם כלורופורם.
- לערבב את השלב מימית מלמעלה עם כמות אחת בעשירית של סודיום אצטט (3.0 M, pH 5.2), 10 μg של tRNA או 20 μg של הגליקוגן, ו אתנול (2 – 3 כרכים, מאוחסנים ב-20 ° c). השאירו את הצינורות ב-80 ° c בשביל 1 h.
- ספין את הצינורות המכילים את הפתרון עבור 5 – 10 דקות ב 4 ° c ב מיקרוצנטריפוגה (14,000 rpm או 16,873 x g). הסר את הסופרנטנט בזהירות. לשטוף את הגלולה RNA עם 70% אתנול וספין עבור 2 – 5 דקות.. ומכה את האתנול בזהירות האוויר יבש את הגלולה RNA.
- מסיסות הגלולה RNA ב 50 μL של מים שטופלו באמצעות דיאתיל פירוקרבונט (DEPC). השאירו את הדגימה ב-20 ° c לאחסון.
הערה: לטהר את ה-RNA באמצעות עמודות הספין הזמינות מסחרית, אשר משמשות כיום יותר להסרת רדיואקטיביות משולב ולשמש חלופה מהירה ונוחה יותר לטיהור RNA.
התראה: השתמש במגן זכוכית אקרילי, בכפפות ובאמצעי זהירות אחרים להגנה מפני רדיואקטיביות.
4. התגובה של איגוד החלבונים והפרדת ה-RNA המאוגד
- לבצע את הכריכה של חלבון רנ א ב 10 mM טריס-HCl, pH 7.5 בנפח של 100 μL על ידי הוספת המרכיבים הבאים לריכוזים סופיים אלה: 50 mM KCl, 1 מ"מ DTT, 0.09 μg/μL סרום בקון, ב0.5 יחידות/μl RNasin, 0.15 μg/μL , 1 מ"מ EDTA, ו 30 μL של רקומביננטי חלבון מתאים (PTB) ריכוז. הוסף RNA מהבריכה המתאימה.
הערה: ה65 U2AF הגורם בדרך כלל מאגד את המערכת הבין-ממדית של מערכת העיכול/3-בדרכי הייצור של מודל introns מדגם עם זיקה מחייבת (קבוע שיווי משקל או Kd) של כ 1 – 10 ננומטר. לכן, שני סיבובים הראשונים של כריכה השתמשו בריכוז חלבון 10 מתקפל מעל Kd עבור U2AF65; עבור חלבונים SXL ו PTB, הריכוז ההתחלתי בטווח זה היה רק הניחוש הטוב ביותר שלנו. זה מובטחת כי מינים הרצוי RNA כי יכול לאגד, למרות רצפי זיקה נמוכה גם כרוך בפוטנציאל. בסיבובים 3 ו-4 (תמלול, כריכה והגברה), ריכוז החלבון הופחת בשלושה קיפולים (שלב 4.1). הדבר נעשה כדי למנוע ברציפות מינים בעלי זיקה נמוכה של RNA. - מניחים את הצינורות המכילים את תגובות הכריכה כ -30 דקות ב -25 ° c בבלוק טמפרטורה (או על הקרח).
- אנגיופלסטיקה את ה-RNA המאוגד מ-RNA הלא מאוגד עבור 4 הסיבובים הראשונים של הגברה בחירה באמצעות השלבים הבאים.
- לסנן את המדגם (100 μL) בטמפרטורת החדר דרך מסנן ניטרוצלולוזה מחובר סעפת ואקום.
הערה: מתחם ה-RNA-חלבון, אך לא ה-RNA הלא מאוגד, נשאר על הפילטר. - קוצצים את המסנן באמצעות RNA שנשמר לרסיסים בעזרת להב גילוח סטרילי; נכניס את זה. לצינור הצנטריפוגה לשחזר את ה-RNA על ידי הנופל בעדינות את הצינור למינימום של 3 h (או לילה) עם חתיכות מסנן שקוע ב-מאגר פרוטטינואז K (PK).
- Deproteinize ה-RNA לדוגמה על ידי vortexing אותו בנוכחות של נפח שווה של פנול-כלורופורם (1:1) ולאחר מכן של כלורופורם. לשחזר את השלב מימית בכל פעם על ידי תפרידו את המדגם במהירות גבוהה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מערבבים עם סודיום אצטט (0.1 נפח של 3.0 M, pH 5.2) ו אתנול (2 – 3 כרכים של אתנול מוחלט, 200 הוכחה). להשאיר את הצינור ב-80 מקפיא ° c במשך 30 דקות, צנטריפוגה אותו במהירות גבוהה עבור 10 דקות, ו, בעקבות שטיפת כביסה וייבוש (שלב 3.8), מסיסות RNA במים שטופלו DEPC. שלבים אלה מתוארים לעיל (שלבים 3.6 עד 3.9).
- לסנן את המדגם (100 μL) בטמפרטורת החדר דרך מסנן ניטרוצלולוזה מחובר סעפת ואקום.
- הפרד את שברי ה-RNA המאוגדים בחלבון משברים לא מאוגדים עבור 2 הסיבובים האחרונים (סיבובים 5 ו -6; תמלול, כריכה והגברה) כדלקמן. הפחת את ריכוז החלבון בתגובת האיגוד (שלב 4.1) באמצעות שלושה מקפלים נוספים לקבלת לחץ נוסף בבחירה כדי להעשיר רצפי קשירה בעלי אהדה גבוהה ומעדיפים להסיר רצפים בעלי זיקה נמוכה.
- הטלת מראש מקורית פוליאקרילמיד ג'ל (5% עם 60:1 אקרילאמיד: bis-אקרילי) במאגר של 0.5 x TBE (טריס-Borate-EDTA) לפני הגדרת RNA לעיל: כריכת חלבון (שלב 4.1) התגובה. אלקטרופורז ג'ל זה בחדר קר (4 ° c) על ידי החלת 250 V במשך 15 דקות.
- פיפטה לעיל RNA: תגובות כריכת חלבון (צעד 4.1) לתוך בארות שונות של ג'ל זה.
הערה: החלבון מאוחסן ב-80 ° c ומדולל לפני השימוש ב -20 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל) פיפראזין-1-חומצה אתאנסולתית (HEPES), pH 8.0, 20% גליצרול, 0.2 מ"מ מילימטר ethilenediamגנול חומצה (EDTA), 0.05% NP-40, ו 1 מ"מ dithioitol (DTT). תוספת של 0.5 – 1.0 מעכב פרוטאז מילימטר פנילתאן פלואור (PMSF) הוא אופציונלי. בתגובת הקשירה, מאגר זה תורם כ-6% גליצרול, המאפשר העמסה ישירה של דגימות בבארות ללא צורך בערבוב של מאגר העמסה-ג'ל נפרד. - אנגיופלסטיקה ה-RNA המאוגד מרנ א לא מאוגד באמצעות אלקטרופורזה בג בחדר קר (4 ° c) ב-250 V עבור 1 עד 2 שעות. תהליך זה ידוע גם בשם השינוי הניידות של ג'ל.
הערה: משך האלקטרופורזה משתנה בהתאם לתכונות ה-RNA והחלבון המשמש לכריכה. - לחשוף את ג'ל לסרט רנטגן ולזהות את המיקום של RNA מאוגד באמצעות אדיגרפיה אוטומטית. חותכים את הפרוסה ג'ל עם RNA מאוגד ולהכניס אותו לתוך צינור.
- מודטה את הפרוסה ג'ל מעוך במאגר PK המשמש הימנעות עבור 3 שעות או לילה.
- חזור על שלבים 3.5 עד 3.9 המתוארים לעיל. בקצרה, ומערבולת הדגם ה-RNA לדוגמה במרץ הראשון עם פנול-כלורופורם ולאחר מכן עם כלורופורם.
- לערבב אצטט נתרן אתנול עם השלב מימית לאחר הוצאת כלורופורם. בעקבות דגירה ב-80 ° c מקפיא, ספין ב 4 ° צ' עבור 5 – 10 דקות כדי לאסוף את הגלולה RNA. לשטוף את הגלולה RNA עם אתנול ואוויר יבש אותו על ידי עזיבת המכסה של הצינור פתוח. לפזר את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC.
הערה: מעבר לעקידת התנועה של הג עבור שבירה מאפשר חיסול של מינים לא רצויים של RNA שייתכן שהיו מועשרים לכריכה, לדוגמה, למסנן הניטרוצלולוזה כאן (או לכל מטריצה) הנמצאת בשימוש בסיבובים הראשוניים לצורך שבירה.
5. תעתיק הפוך והגברה הPCR
- לסנתז cDNA מן ה-RNA מומס באמצעות היפוך הטרנססקריפט ואת פריימר הפוכה על-ידי מארג התגובה 20 μL (2 μL של 10x RT מאגר, 2 μL של היפוך הפוכה AMV, 1 μM לאחור פריימר, 10 μL של RNA, RNase מעכבי אופציונלי) ב 42 ° c עבור 60 דקות
- להגביר את cDNA באמצעות 20-25 PCR מחזורי כפי שמתואר בשלב 2.1.
6. תמלול וכריכת חלבון
- חזור על התהליך של סינתזה RNA, כריכת חלבון, הפרדת החלבון כרוך ושבריר לא מאוגד, כמתואר בסעיף 3 – 5 לעיל.
7. ניתוח של אינטראקציות רנ א-חלבון
- השתמש בערך התזוזה של הג (שלב 4.4) או בקביעת הכריכה (שלב 4.3) כדי לקבוע זיקה וספציפיות של איגוד עבור בריכות נבחרות או רצפים בודדים בתוך כל מאגר (ראה שלב 8.3).
- השתמש באדיגרפיה אוטומטית או ב-פוספור צמידה כדי לזהות ולכמת להקות בשבר המאוגד ובשבר לא מאוגד.
8. השכפול והרצף
- לעכל את המוצר הסופי של ה-DNA של PCR עם אנזימים הגבלה Bcl1 ו-hindiii עבור 1 – 2 h, פסיקים עם pGEM3 מתעכל כראוי או מ אחרים הנושאים את אתרי ההגבלה מ 2 h אל הלילה, להפוך את המוצר הקשר לתוך תאים חיידקיים המוסמכת בהלם חום או אלקטרופורציה באמצעות נהלים ביולוגיים סטנדרטיים מולקולריים13.
- לגדל חיידקים לילה על ידי ציפוי התאים שעברו שינוי על צלחות אגר עם לוריא ברטני (LB) בינונית ואמפיצילין (50 μg/mL) ב 37 ° c. בחר מושבות כדי לחסן צינורות תרבות המכילים LB נוזל בינוני עם אמפיצילין ולגדול ב 37 ° c בחממה רועדת לילה. באמצעות פרוטוקול בידוד. סטנדרטי מסוג13
הערה: ערכות מסחריות זמינות לטיהור פלמיד. - רצף את הפלמידים עם מוסיף DNA באמצעות פרוטוקול הפסקת רצפי שרשרת dideoxy, בעקבות הוראות היצרן עבור רצף14.
הערה: ניתן לבצע רצף בבית או לעשות באופן מסחרי.
9. יישור רצף
- יישור רצפים והשגת אתר של איגוד בקונצנזוס באמצעות כלי יישור מקוונים זמינים
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התצפיות הבאות מדגימות הגברה מוצלחת של בחירה (SELEX). ראשית, ניתחנו את המאגר 0 ואת הרצפים שנבחרו לכריכה לחלבון המשמש את הגישה האיטרטיבית לבחירה. איור 2 מראה כי מערכת החלבונים (ptb) של היונקים המ, מראה כריכה מחייבת בקושי לגילוי 0, אך הזיקה גבוהה למאגר הרצף הנבחר. בקושי היתה אפשרות לזהות את הכריכה למאגר 0 כאשר השתמשנו ב-300 לפחות ריכוז חלבונים גבוה יותר עבור איגוד מאשר בשימוש עבור המאגר שנבחר. לפיכך, היה לפחות הבדל של כמה מאות בקיפול חלבונים בין הבריכה האקראית או ההתחלתית לבין הבריכה שנבחרה. התבוננות זו מאשרת כי פרוטוקול הגברה הבחירה המתואר כאן הוא מוצלח.
שנית, שמנו את המאגר הנבחר וקבענו אתר מחייב הסכמה. רצף הקונצנזוס המתקבל מהיישור של רוב הרצפים שנבחרו מתוך המאגר הנבחר של היונקים הנבחרים היה: GCCUG (Y/G) האוקייאם (Y/G) CCC. זה מראה כי יש לנו בחרה מיוחד pyrimidine עשיר לאגד PTB11. כאשר ביצעת איטרטיבי הגברה עבור התחום של ה-RNA -binding של הדרוזולה ptb, העשירו רצפי CU-rich שהופרעו על ידי גואנוסינוסים. בין רצפי האהדה הגבוהים שנבחרו דרוזוהילה ptb היה רצף עשיר של 84% pyrimidine: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. למעשה, רצף זה דומה לרצף pyrimidine עשיר הקיים בתוך אינטרון אלפא-troyosin אשר נקשר עם אהדה גבוהה והוא מוסדר על ידי היונקים ptb15. השתמשנו בהצלחה בגישה זו שוב ושוב כדי ללמוד מאפיינים של איגוד RNA ופונקציות שחבור לרגולטורים וגורם מחדיר11,15,16. טבלה 1 מציגה דוגמאות מוצלחות של חלבוני RNA-binding שבהם השתמשו selex לזיהוי אתר האיגוד המועדף או הקונצנזוס שלהם.
שלישית, שיטת החדרת מחוץ למערכת העיכול, המבוססת על הבחירה החלופית של 3 ' אחוי האתר, מראה רלוונטיות תפקודית של החלבונים בעלי כריכת רנ א שונה אך חופפים של החלבון המחייב בדרכי העיכול. בעוד במעלה הזרם 3 ' אחוי האתר משמש כברירת מחדל, תוספת של רקומביננטי PTB מוביל להפעלה של חלופה או במורד הזרם 3 ' אחוי האתר (איור 3). לעומת זאת, תוספת של רקומביננטי hnRNP C17 מוביל לדיכוי של שניהם 3 ' אחוי אתרים. תוספת של הרקומביננטי הכללית החדרת גורם U2AF65 היפוך של הופך hnRNP C1-בתיווך 3 ' אחוי באתר הדיכוי (איור 3), כמו גם את האפקט ptb-בתיווך על המטה 3 ' אחוי אתר ההפעלה (נתונים לא מוצגים). הסבר פשוט עבור אפקטים אלה הוא תחרות ישירה בין הכריכה של הכולל אחוי פקטור U2AF65 ו ptb (נקרא גם hnRNP I), אשר מעדיפים לאגד מחדש 3 ' splices אתרים מסוימים, או בין U2AF65 ו hnRNP C, אשר נקשר ו לוחץ מחדש את שני שלושה ' אחוי אתרים.
איור 1: סיכום של שלבי מפתח בתהליך הגברה בחירה איטראטיבי (SELEX). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העשרת מתאמי הכריכה של PTB. הגדלת ריכוז (משולשים מלאים) של רקומביננטי PTB שימש עם מאגר רדיויניום 0 RNA או הבריכה שנבחרה התקבל לאחר שישה סיבובים של הבחירה הגברה. המיקומים של RNA לא מאוגד ו-RNA: מתחם החלבון מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אחוי שיטת החלפת אתרים מאמתת היווצרות של חלבונים בעלי כריכה מקושרת מובחנת. (למעלה) . תרשים של המצע החדיר המצע החדרת מכיל 5 ' אחוי האתר ושני המקומות החלופיים 3 ' האזורים האגף intron. מלבנים (פתוחים, עם קווים אופקיים ומוצקים) הם exons והקו הוא intron. (A-למטה) hnRNP C1 מחדש את הזרם במעלה 3 ' אחוי (ללא הפעלה של המטה במורד 3 ' אחוי), ואילו ptb מוביל ההפעלה של המטה במורד 3 ' אחוי האתר. המצע החדרת מודב. לתמצית גרעינית בתאי הלה מוצרי המפגש (המוצגים על הצדדים) נותחו באמצעות שיטת הארכה מלאה18 עם התחל (בחיצים), המכירים את המפגש בין 5 מנות משותפות לאתר או למטה במורד הזרם. (ב) רקומביננטי U2AF65 (rU2AF65) הופכת את האפקט הדכאני של הhnrnp c1. תוספת של רקומביננטי hnRNP C1, PTB, או rU2AF65 חלבונים לתגובה החדרת מצוין על ידי סמלים +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חלבון | רצף מועדף |
| U2AF65 | U-עשיר המכיל Cs |
| SXL | U-עשיר המכיל 2-4 Gs |
| שחפת | מספר אלף |
| hnRNP C1 | U-עשיר (5-6 לאורך) |
| CstF64 | הג העשיר |
| היירנnp E1/E2 ו-K | סי ריץ ' |
| U2AF65/U2af35 הטרודימר | מיכל שיאיואן |
טבלה 1: אתרי קשירה מועדפים למספר חלבונים מסוג RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חומצות גרעין מחייב חלבונים הם הרגולטורים חשובים של בעלי חיים ופיתוח הצמח. דרישה מרכזית עבור הליך SELEX היא התפתחות של מעשה שניתן להשתמש בו כדי להפריד שברים RNA בעלי מאוגד חלבון ובלתי מאוגד. בעיקרון, היכולת הזאת יכולה להיות בתוך שיטת מחייב מחוץ לחוק, כגון השילוב של איגוד המסננים, שיטת התזוזה של הג לתנועה, או מערך איגוד של מטריצה19 עבור רקומביננטי חלבונים, חלבונים מטוהרים או מכלולי חלבונים. המיקום יכול להיות גם מעשה אנזימטי שבו ניתן להפריד בין הסמנים והמוצרים (או intermediates) בהתאם לגודל או לאמצעים אחרים של20.
בעוד שנעשה שימוש נרחב במוטוטזיס כדי לאפיין אתרי כריכה לחלבונים, הוא מפרך, ורצפים ארוכים יותר וממושכת אינם מנגישים בקלות למוטזיס רוויה. המשמעות של הכריכה האיטראטיבית וגישת ההגברה שתוארה כאן היא שלא רק שהיא מתגברת על חלק מהמגבלות הנ ל, היא יכולה לזהות אתרי איגוד לא ידועים בעבר ולספק מידע חשוב אודות , דרישות הנוקלאוטיד בכל תנוחה בו
שיקול חשוב להצלחת הגברה בחירה איטראטיבי הוא מחייב אהדה וספציפיות. בדרך כלל, 12 כדי 15 סיבובים של הגברה בחירה מועסקים ומרחב רצף של 1012 עד 1015 מולקולות ניתן לדגום באופן שגרתי. ההתקדמות ולבסוף ההצלחה של פרוטוקול הגברה הבחירה יכולה להיות מנוטרת באמצעות שיטת קשירה או רצף ישיר, העוקבת אחר הזיקה או העשרת הרצפים הספציפיים בבריכות ביניים, בהתאמה. בעוד שיטת הכריכה הייתה משמשת באופן מסורתי, הופעתו של רצף הדור הבא מאפשר ניתוח של העשרה רצף בדרכים שאינן אפשריות על-ידי הוראות ברצף של Sanger ידני14.
צעד קריטי בהצלחת SELEX הוא לקפל העשרה של המולקולות הרצויות בכל שלב. מספר המחזורים הנדרשים עבור SELEX משתנה ותלוי במספר גורמים. לדוגמה, אם העשרת הקיפולים של רצפים רצויים או ספציפיים גבוהים יותר בכל סיבוב, פחות סיבובים יהיו מספיקים. עם זאת, אם התשובה מאפשרת שיעור גבוה של רצפים בלתי רצויים במאגר מאוגד, סיבובים נוספים יהיה צורך להעשיר רצפי RNA הרצוי. מגבלה של הטכניקה או תוצאה בלתי מכוונת של הצורך מחזורים נוספים של הגברה הבחירה שיש לזכור היא האפשרות שהוא עשוי להציג פריטים או להעשיר רצפים בעלי מאפיינים שאינם קשורים כגון יכולת להגביר לבסוף, בעוד שיישומים מסוימים נהנים מאוגדן האהדה הגבוה ביותר, עבור שימושים אחרים, יש להשתמש ביתרה במהלך תהליך הגברה הבחירה בין הזיקה והפונקציה של איגוד מאחר שרצפי הכריכה הגבוהים ביותר עשויים לא בהכרח להיות רצפים הפונקציונליים ביותר בהקשרים ביולוגיים (למשל, אם רצף מזוהה מספר פעמים על ידי חלבונים שונים במהלך שחבור).
בין השינויים ופתרון התקלות כדי לשפר את ההליך, ניתן ליישם בחירה שלילית או בחירת מונה כדי להגדיל את הפירוט. באופן דומה, שימוש בפרוטוקולי חלוקה למחיצות שונים, כגון שיטת הכריכה של המסנן ואחריו מבצע השינוי הניידות של הג, יכול למנוע העשרה של רצפים לא רצויים התאגד, לדוגמה, למסנן הניטרוגליצרין או מטריצת עמודה21. בהתחשב בכך חלבונים-גרעין אינטראקציות חומצות יש גם ספציפי וגם לא ספציפי רכיבים, מאגר תנאים כגון מלח ו-pH יש השפעות על אינטראקציות ה-RNA חלבון. יתר על כן, השימוש בריכוז החלבון המתאים יכול להיות השפעה ישירה על שמירה של קלסרים חזקים, חלשים ולא ספציפיים. לחץ בחירה ניתן להגדיל בסיבובים רצופים, למשל, על ידי כלילת RNA מתחרה, הפחתת ריכוז החלבון, או צמצום זמן הדגירה. לכן, שיקולים זהירים ואופטימיזציה של פרמטרים אלה יכולים להשפיע על התוצאה של פרוטוקול SELEX.
לאחרונה, וריאציות רבות או שינויים של פרוטוקול SELEX המקורי פותחו אשר להתגבר על חלק מהמגבלות שהוזכרו לעיל. אלה כוללים תפוקה גבוהה-SELEX (HT-SELEX), אשר משלבת SELEX ורצף מקבילי בנפט6, r, מעורב, אשר כרוך דגירה עם העודף rna שאינו אקראי, משיכה-מטה של RNA מאוגד, תיוג פלורסנט של rna, וניתוח על מיקרומערכים5, rna Bind-n-Seq, המשלב ניתוח של זיקה rna באופן כמותי ותפוקה גבוהה22, ו selex מהירה, אשר מקצרת את התהליך וכולל צעד שאינו הגברה23.
בסיסים כימית שונה שימשו כדי להרחיב את הרפרטואר של מולקולות RNA עבור יישומים ספציפיים24. דיאגנוסטיקה, therapeutics, כמו גם מולקולות עם פעילויות קטליטיים הן בין היישומים הרבים (כולל רפואה) של המולקולות הנבחרות25. Aptamers משלימים פרוטוקולים מבוססי נוגדנים ולספק כלים מצוינים אשר פוטנציאל, למשל, באבחון, therapeutics, ויישומים אחרים, נשאר להיות מנוצלת לחלוטין26,27,28. בעתיד, למשל, היתרונות הקליניים הם בין היישומים המבוקשים הרבים, מעבר למה הראשון של ה-FDA aptamer אושר (הנתרן) יכול לספק עבור ניוון מקולרי הקשורים לגיל. הטכנולוגיה הפרוטאומית המדרגית למדידות חלבונים מציעה צעד לקראת הבנה בריאות ומחלות24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מצהיר שאין לו אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחבר מודה למוסדות הבריאות הלאומיים למימון העבר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
