Summary
Специфика последовательности имеет решающее значение для регуляции генов. Регуляторные белки, распознающие определенные последовательности, важны для регуляции генов. Определение функциональных связывающих участков для таких белков является сложной биологической проблемой. Итеративный подход к идентификации связывающего участка для РНК-связывающего белка описан здесь и применим ко всем БЕЛКАм-связывающим РНК.
Abstract
Регуляция генов играет важную роль во всех клетках. Транскрипционные, посттранскрипционные (или РНК обработки), переводные и пост-трансляционные шаги используются для регулирования конкретных генов. Последовательность конкретных нуклеиновых кислот-связывающих белков целевой конкретных последовательностей для контроля пространственной или временной экспрессии генов. Места связывания нуклеиновых кислот, как правило, характеризуются мутационным анализом. Тем не менее, многочисленные белки, представляющие интерес не имеют известного места связывания для такой характеристики. Здесь мы описываем подход к выявлению ранее неизвестных мест связывания РНК-связывающих белков. Она включает в себя итеративный отбор и усиление последовательностей, начиная с рандомизированного пула последовательности. После нескольких раундов этих шагов-транскрипции, связывания и усиления-обогащенных последовательностей секвенируются для определения предпочтительного места связывания (ы). Успех этого подхода контролируется с помощью анализов привязки in vitro. Впоследствии, in vitro и in vivo функциональные анализы могут быть использованы для оценки биологической значимости выбранных последовательностей. Этот подход позволяет идентифицировать и характеристики ранее неизвестного места связывания (ы) для любого РНК-связывающего белка, для которого существует анализ на отделение белковых и несвязанных РНК.
Introduction
В клеточной биологии центральную роль играет регуляция генов. На одном или нескольких шагах вдоль пути экспрессии генов гены могут регулироваться. Эти шаги включают транскрипцию (инициация, удлинение и прекращение), а также сплайсинг, полиаденилацию или 3' конечную формацию, экспорт РНК, перевод мРНК и распад/локализацию первичных транскриптов. На этих этапах нуклеиновые кислотно-связывающие белки модулируют регуляцию генов. Определение связывающих участков для таких белков является важным аспектом изучения генного контроля. Мутационный анализ и сравнение филогенетической последовательности были использованы для обнаружения регулятивных последовательностей или белково-связывающих сайтов в нуклеиновых кислот, таких как промоутеры, сращивания сайтов, полиаденелизационных элементов, и трансляционные сигналы1, 2 , 3 , 4.
Предварительное сращивание является неотъемлемым шагом при экспрессии и регуляции генов. Большинство генов млекопитающих, в том числе у людей, имеют интроны. Большая часть этих транскриптов альтернативно сращиваются, производя несколько мРНК и белковых изоформ из одного и того же гена или первичного транскрипта. Эти изоформы имеют клеточную и развитую роль в клеточной биологии. 5' сращивания сайта, ветвь-точка, и полипиримидин тракта / 3 ' сращивания сайт критических сигналов сращивания, которые подлежат регулированию. В отрицательном регулировании, в противном случае сильное место сращивания репрессировано, тогда как в положительном регулировании в противном случае слабое место сращивания активировано. Сочетание этих событий производит множество функционально различных изоформ. РНК-связывающие белки играют ключевую роль в этих альтернативных событиях сращивания.
Многочисленные белки известны, чьи цели связывания (ы)или РНК-мишени остаются идентифицированными 5,6. Связывание регулятивных белков с их биологическими целями или последовательностями вниз по течению часто является сложным процессом. Для таких белков определение их целевой РНК или места связывания является важным шагом в определении их биологических функций. Как только место связывания идентифицировано, его можно дополнительно охарактеризовать с помощью стандартных молекулярных и биохимических анализов.
Описанный здесь подход имеет два преимущества. Во-первых, он может определить ранее неизвестный сайт связывания для белка, представляющих интерес. Во-вторых, дополнительным преимуществом этого подхода является то, что он одновременно позволяет мутагенеза насыщения, который в противном случае был бы трудоемким для получения сопоставимой информации о требованиях последовательности в пределах связывающего сайта. Таким образом, он предлагает более быстрый, простой и менее дорогостоящий инструмент для определения мест связывания белка в РНК. Первоначально этот подход (SELEX или систематическая эволюция лигандов eXponential обогащения) был использован для характеристики связывающего места для бактериофага T4 ДНК полимераза (ген 43 белка), который перекрывается с рибосомой связывания сайта в своей собственной мРНК. Обязательный сайт содержит 8-базовую последовательность цикла, представляющую 65 536 рандомизированных вариантов для анализа7. Во-вторых, этот подход также независимо использовался для того, чтобы показать, что из пула примерно 1013 последовательностейможновыбрать определенные места связывания или аптамеров для различных красителей. В самом деле, этот подход был широко используется во многих различных контекстах для выявления aptamers (РНК или последовательности ДНК) для связывания многочисленных лигандов, таких как белки, маленькие молекулы и клетки, и для катализа9. Например, аптамер может различать два производных ксантина, кофеин и теофиллин, которые отличаются наличием одной метиловой группы в кофеине10. Мы широко использовали этот подход (SELEX или итеративный отбор-усиление) для изучения того, как РНК-связывающие белки функционируют в сращивании или сращивании регулирования11, который будет основой для обсуждения ниже.
Случайная библиотека: Мы использовали случайную библиотеку из 31 нуклеотидов. Рассмотрение длины случайной библиотеки было слабо основано на идее, что общий коэффициент сращивания U2AF65 связывается с последовательностью между последовательностью ветвя- точек и 3' сращивания сайта. В среднем расстояние между этими сплайсинг-сигналами у метазоанов составляет от 20 до 40 нуклеотидов. Другой белок Секс-смертельный, как известно, связываются с плохо характеризуется нормативной последовательности вблизи 3' сращивания сайте своей цели до мРНК, трансформатор. Таким образом, мы выбрали случайную область из 31 нуклеотидов, в окружении грунтовых связывающих участков с местами ограничения фермента, чтобы обеспечить усиление ПЦР и крепление промоторизатора T7 РНК-полимераза для транскрипции in vitro. Теоретический размер или сложность библиотеки составили 431 или приблизительно 1018. Мы использовали небольшую часть этой библиотеки, чтобы подготовить наш случайный пул РНК (1012-1015) для экспериментов, описанных ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено резюме ключевых шагов в процессе итеративного отбора (SELEX).
1. Генерация случайного шаблона библиотеки
- Синтезировать переднюю грунтовку 5'- GTAATACGACTACTACTATAGGGTGATCAGATTCA GATTCTGATCTGATCA-3' и обратный грунт 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' путем химического синтеза на синтезаторе ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: праймеры и случайная библиотека могут быть синтезированы на коммерческой уровне. - Синтезировать случайные библиотеки олигонуклеотид шаблон 5'- GGTGATCAGATCtGATCTGATCCA (N1... N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGCCC-3' по химическому синтезу. Используйте эквимолярную смесь из четырех фосфорамититов во время синтеза для 31 рандомизированных позиций, показанных выше как N.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность шаблона библиотеки содержит 31 случайный нуклеотидов (N1 к N31) и фланговые последовательности для связывания передних и обратных грунтовок. Передняя грунтовка включает в себя T7 РНК полимераза промоутер последовательности (подчеркнуто) для транскрипции в пробирке и ограничение сайта Bcl1 (курсив) для клонирования. Обратный грунт содержит места ограничения фермента BamH1 и HindIII (курсивом) для облегчения клонирования.
2. Поколение случайного пула библиотеки ДНК
- Прикрепите промоутер Полимеразы T7 РНК к библиотеке путем полимеразной цепной реакции (PCR), содержащей 1 шаблон случайной библиотеки ДНК, 1 мкм каждой грунтовки, 20 мМ Трис (pH 8.0), 1,5 мМ MgCl2, 50 мм KCl, 0,1 мкг/мл acetylated бычья сывороточная альбомие (кв. м. полимераза) и 200 мКМ каждый из dNTPs (деоксигуанозин, дезоксиаденозин, дезоксицитидин и дезокситимин трифосфат).
- Используйте пять циклов денатурации, аннулирования и расширения шагов (94 кв. м в течение 1 мин, 53 кв. c в течение 1 мин, и 72 КК в течение 1 мин) ПЦР с последующим одним циклом расширения (72 кв. м в течение 10 мин).
3. Синтез пула 0 РНК
- Настройка 100 реакции транскрипции12. Смешайте буфер транскрипции T7, 1 ММ случайный библиотечный пул ДНК, 5 мМ дитиотрийтол (DTT), 2 мМ гуанозин трифосфат (GTP), 1 мМ каждый из аденозинтрифосфата (АТФ), цитидин трифосфат (CTP), и уридин трифосфат (UTP), и 2 единицы/
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может быть транскрибирована в пробирке с использованием коммерчески доступных комплектов с опцией T7 или SP6 РНК-полимераза. - Инкубировать вышеупомянутую реакционную смесь в микроцентрифуговой трубке в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
- Гель очищает РНК в 10% денатурируя полиакриламидгель.
- Определите расположение транскриптов на геле, окрашивая его метиленовым синим или ауторадиографией, включив в транскрипционную реакцию следы радиоактивности (0,5 л или менее q-32P UTP).
- Поместите ломтик геля в центрифугу трубки и разбить на более мелкие кусочки, например, с гомогенизатором кончиком. Добавьте буфер протеиназа K (PK) (100 мм Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 12,5 мМ EDTA, 1% сульфат натрия додецил), чтобы погрузить кусочки геля. Оставьте трубку на nutator от 2 ч до ночи при комнатной температуре.
- Спин в высокоскоростной микроцентрифуге (14 000 об/мин или 16 873 х г) в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы удалить гель мусора и восстановить буферный раствор.
- Vortex образца два раза с равным объемом фенол-хлороформ и один раз с хлороформом.
- Смешайте аквистную фазу сверху с одной десятой объемом ацетата натрия (3,0 М, рН 5,2), 10 мкг трна кв. или 20 мкг гликогена и этанола (2-3 тома, хранящегося при -20 градусах Цельсия). Оставьте трубки при -80 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Спин трубки, содержащие раствор в течение 5-10 мин при 4 c в микроцентрифуге (14000 об/мин или 16 873 х г). Откажитесь от супернатанта осторожно. Промыть РНК гранулы с 70% этанола и спина в течение 2-5 мин. Аспир этанол тщательно. Воздух высушивает гранулы РНК.
- Растворить гранулы РНК в 50 л воды, обработанной диэтил-пирокарбонатом (DEPC). Оставьте образец на уровне -20 градусов для хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка РНК с помощью коммерчески доступных спиновых столбцов, которые в настоящее время чаще используются для удаления неинкорпорированной радиоактивности и служат быстрой и более удобной альтернативой для очистки РНК.
ВНИМАНИЕ: Используйте акриловый стеклянный щит, перчатки и другие меры предосторожности для защиты от радиоактивности.
4. Белковая связывающая реакция и разделение связанной РНК
- Провести связывание белка и РНК в 10 мм Tris-HCl, рН 7,5 в объеме 100 л, добавив следующие ингредиенты к этим конечным концентрациям: 50 мМ ККЛ, 1 мМ ДТТ, 0,09 мкг/л бычьей сыворотки альбумина, 0,5 единиц/Л. , 1 мМ EDTA, и 30 л соответствующей рекомбинантного белка (ПТБ) концентрации. Добавьте РНК из соответствующего пула.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фактор сплайсинга U2AF65 обычно связывается с полипиримидином тракта/3' сращивания сайтов моделей интронов с связывающей близостью (равновесная диссоциация константа или Kd) примерно 1-10 нм. Таким образом, в первых двух раундах связывания использовалась концентрация белка в 10 раз выше Kd для U2AF65; для белков SXL и PTB, начальная концентрация в этом диапазоне была только нашей лучшей догадкой. Это обеспечило что пожеланные виды RNA которые смогли связать, хотя более низкие последовательности сродства также потенциально связаны. В раундах 3 и 4 (транскрипция, связывание и усиление) концентрация белка была снижена в три раза (шаг 4.1). Это было сделано для последовательного устранения низкого сродства РНК видов. - Поместите трубки, содержащие связывающие реакции в течение примерно 30 мин при температурном блоке (или на льду).
- Фракция связанной РНК из несвязанной РНК в течение первых 4 раундов отбора-усиления с помощью следующих шагов.
- Фильтр образец (100 л) при комнатной температуре через фильтр нитроцеллюлозы, прикрепленный к вакуумному многообразию.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-белковый комплекс, но не несвязанная РНК, остается на фильтре. - Нарезать фильтр с сохраненной РНК на фрагменты стерильным лезвием бритвы; вставьте их в центрифугу трубки. Восстановление РНК, акробатика трубки мягко в течение как минимум 3 ч (или на ночь) с фильтром штук погружен в proteinase K (PK) буфера.
- Депротеинизация образца РНК путем вихря его в присутствии равного объема фенол-хлороформ (1:1), а затем хлороформа. Восстановление водной фазы каждый раз, центрифугировании образца на высокой скорости в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Смешайте его с ацетатом натрия (0,1 тома 3,0 М, рН 5,2) и этанолом (2-3 тома абсолютного этанола, 200 доказательств). Оставьте трубку в морозильной камере -80 градусов в течение 30 минут, центрифуги его на высокой скорости в течение 10 минут, и, после стирки и сушки шаги (шаг 3.8), улавливать РНК в воде, обработанной DEPC. Эти шаги изложены выше (шаги от 3,6 до 3,9).
- Фильтр образец (100 л) при комнатной температуре через фильтр нитроцеллюлозы, прикрепленный к вакуумному многообразию.
- Отделите белковые фракции РНК от несвязанных фракций за последние 2 раунда (раунды 5 и 6; транскрипция, связывание и усиление) следующим образом. Уменьшите концентрацию белка в связывающей реакции (шаг 4.1) еще в три раза для дополнительного давления отбора, чтобы обогатить высокосродность связывающих последовательностей и преференциально удалить с низким содержанием последовательности.
- Предварительно отливайте родной полиакриламидный гель (5% с коэффициентом 60:1 акриламида:bis-acrylamide) в 0,5-x буфере TBE (Tris-Borate-EDTA) до создания вышеуказанной реакции РНК:белково-связывающей (шаг 4.1). Электрофоризирующий этот гель в холодной комнате (4 градуса По Цельсию), применяя 250 В в течение 15 мин.
- Pipette выше RNA: реакции связывания протеина (шаг 4.1) в по-разному наилучшим образом этого геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок хранится при -80 градусах Цельсия и разбавляется перед использованием в 20 мМ 4-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-1-этанесульфоновая кислота (HEPES), pH 8.0, 20% глицерола, 0,2 мм этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), 0,05% НП-40 и 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ). Добавление 0,5-1,0 мм ингибитор протеазы фенилметана сульфонил фтора (PMSF) является необязательным. В связывающей реакции, этот буфер способствует около 6% глицерола, что позволяет прямой загрузки образцов в скважины без необходимости смешивания их с отдельным буфером гель-загрузки. - Фракция связанной РНК от несвязанной РНК с помощью геля электрофореза в холодной комнате (4 КК) при 250 В для 1 до 2 ч. Этот процесс также известен как гель мобильности сдвиг асссе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность электрофореза варьируется в зависимости от особенностей РНК и белка, используемого для связывания. - Выставить гель на рентгеновскую пленку и определить местоположение связанной РНК с помощью авториграфии. Вырежьте ломтик геля с связанной РНК и вставьте его в трубку.
- Инкубировать измельченный ломтик геля в буфере PK, используемом для elution в течение 3 ч или на ночь.
- Повторите шаги от 3,5 до 3,9, изложенные выше. Короче говоря, вихрь eluted РНК образца энергично сначала с фенол-хлороформ, а затем с хлороформом.
- Смешайте ацетат натрия и этанол с водной фазой после извлечения хлороформа. После инкубации в морозильной камере -80 градусов, вращайтесь при 4 градусах по Цельсию в течение 5-10 мин, чтобы собрать гранулы РНК. Вымойте РНК гранулы с этанолом и просушить воздух, оставив крышку трубки открытой. Растворите РНК в воде, обработанной DEPC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на анализ смещения подвижности геля для фракционирования позволяет ликвидировать нежелательные виды РНК, которые могли бы быть обогащены для связывания, например, с фильтром нитроцеллюлозы здесь (или любой матрицы), используемой в первоначальных раундах для фракционирования.
5. Обратная транскрипция и усиление ПЦР
- Синтезировать кДНК из растворенного РНК с помощью обратной транскриптазы и обратной грунтовки путем инкубации 20 qL реакции (2 зл 10x RT Buffer, 2 Зл амВ обратной транскриптазы, 1 ММ обратной грунтовки, 10 зЛ РНК, ингибитор RNase факультативно) при 42 градусах по Цельсию за 60 минут.
- Усиль кДНК с помощью 20-25 циклов ПЦР, как описано в шаге 2.1.
6. Транскрипция и связывание белка
- Повторите процесс синтеза РНК, связывания белка, разделения белкового связанного и несвязанной фракции, как описано в разделе 3-5 выше.
7. Анализ взаимодействий РНК-белка
- Используйте ассс используйте асссид переноса подвижности геля (шаг 4.4) или переплет фильтра (шаг 4.3), чтобы определить связывающую близость и специфичность для выбранных пулов или отдельных последовательностей в каждом пуле (см. шаг 8.3).
- Используйте авторадиографию или фосфорный образщик для обнаружения и количественной оценки полос в связанной фракции и несвязанной фракции.
8. Клонирование и секвенирование
- Дайджест конечного продукта ПЦР ДНК с ограничения ферментов Bcl1 и HindIII для 1-2 ч, ligate с надлежащим образом переваренных pGEM3 или других плазмидов проведения места ограничения от 2 ч до ночи, превратить перевязочный продукт в бактериальных клеток тепловым шоком или электропорированием с использованием стандартных процедур молекулярной биологии13.
- Выращивайте бактерии на ночь, нанося трансформированные клетки на агар-пластинах со средним и ампициллином (50 мкг/мл) при 37 градусах Цельсия. Выберите колонии, чтобы привить культуры труб, содержащих LB жидкой среде с ампициллин и расти при 37 градусов по Цельсию в трясущейся инкубатора в одночасье. Очистите плазмидные ДНК, содержащие днк-вставки с помощью стандартного протокола плазмидной изоляции13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие комплекты доступны для плазмидной очистки. - Последовательность плазмиды с ДНК вставки с использованием протокола секвенирования цепи дидезации, следуя инструкциям производителя для секвенирования14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование может быть выполнено в доме или сделано на коммерческой уровне.
9. Выравнивание последовательности
- Выравнивание последовательностей и получение консенсусного обязательного сайта (ы) с использованием доступных инструментов выравнивания в Интернете
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следующие наблюдения демонстрируют успешное селекционное усиление (SELEX). Во-первых, мы проанализировали пул 0 и выбранные последовательности для привязки к белку, используемому для итеративного подхода к отбору-усилификации. На рисунке 2 показано, что связывающий белок полипримидина (ПТБ) показывает едва обнаруживаемый связывание с последовательностью пула 0, но высокое сродство к выбранной пулу последовательности. Был едва обнаруживаемый привязка к пулу 0, когда мы использовали около 300-кратной более высокой концентрации белка для связывания, чем используется для выбранного пула. Таким образом, разница в связывающем сходства белка между случайным или стартовым пулом и выбранным пулом была по крайней мере в несколько сторазной разницы в сходстве белков. Это наблюдение экспериментально подтверждает, что описанный здесь протокол отбора-усиления является успешным.
Во-вторых, мы секвенировали выбранный пул и определили сайт, имеющий обязательную силу. Последовательность консенсуса, полученная в соответствии с большинством выбранных последовательностей из пула, выбранного ПТБ млекопитающих, была: GCCUG (Y/G)UGCYYYCYYYYG(Y/G)CCC. Это показывает, что мы выбрали уникальные пиримидин богатых последовательностей, которые связывают PTB11. Когда мы выполнили итеративный отбор-усиление для РНК-связывающей области Drosophila PTB, мы обогатили CU-богатые последовательности прерывается гуанозинов. Среди высокой последовательности сродства, что Drosophila PTB выбран был 84% пиримидин богатых последовательности: GCUUUCCUCUGUCGCUUCUUCCUCC. В самом деле, эта последовательность похожа на пиримидина богатых последовательности, присутствующих в альфа-тропомиозина интрон, который связывает с высоким сродством и регулируется млекопитающих PTB15. Мы успешно использовали этот подход неоднократно для изучения РНК-связывающих свойств и функций сращивания регуляторов и фактор сращивания11,15,16. В таблице 1 показаны успешные примеры РНК-связывающих белков, для которых SELEX использовался для определения предпочтительного или консенсусного места связывания (ы).
В-третьих, анализ сращивания сращивания in vitro, который основан на выборе альтернативного сайта сращивания 3', показывает функциональную релевантность различных, но перекрывающихся РНК-связывающих особенностей полипиримидин-тракта связывающих белков. В то время как вверх по течению 3' сращивания сайт используется по умолчанию, добавление рекомбинантных ПТБ приводит к активации альтернативного или вниз по течению 3' сращивания сайта (Рисунок 3). В отличие от этого, добавление рекомбинантных hnRNP C17 приводит к репрессиям обоих 3' сращивания сайтов. Добавление рекомбинантного общего фактора сращивания U2AF65 меняет hnRNP C1-опосредованный 3' сращивания сайта репрессии(рисунок 3), а также PTB-опосредованного эффекта на вниз по течению 3' сращивания активации сайта (данные не показаны). Простое объяснение этих эффектов является прямой конкуренции между связыванием общего фактора сращивания U2AF65 и PTB (также называемого hnRNP I), который преимущественно связывает и подавляет определенные 3' сращивания сайтов, или между U2AF65 и hnRNP C, который связывает и подавляет оба 3' сращивания сайтов.
Рисунок 1: Резюме ключевых шагов в процессе итеративного отбора-усиления (SELEX). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обогащение ПТБ-связывающих РНК. Повышение концентрации (заполненных треугольников) рекомбинантного ПТБ использовалось либо с радиомаркированным пулом 0 РНК, либо с выбранным пулом, полученным после шести раундов отбора и усиления. Указаны позиции несвязанной РНК и РНК:белкового комплекса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ переключения сайта Splice подтверждает различные связывающие особенности пиримидин-связывающих белков. (A-Top) Схема сращивания субстрата. Сращивание субстрат содержит 5' сращивания сайта и два альтернативных 3 ' сращивания сайтов фланговых интрон. Прямоугольники (открытые, с горизонтальными линиями и твердыми) являются экзонами, а линия является интроном. (A-Нижняя) hnRNP C1 подавляет вверх 3' сращивания сайта (без активации вниз по течению 3' сращивания сайта), в то время как ПТБ приводит к активации вниз по течению 3 ' сращивания сайта. Сплайсинг субстрат был инкубирован в heLa ячейки ядерного экстракта. Продукты сращивания (показано на сторонах) были проанализированы с помощью анализа расширения грунтовки18 с сращивания-соединения грунтовки (стрелки), которые признают сращивание общего 5' splice сайт либо вверх по течению или вниз по течению 3' сращивания сайта. (B) Рекомбинантный U2AF65 (rU2AF65) меняет репрессивный эффект hnRNP C1. Добавление рекомбинантных hnRNP C1, PTB, или rU2AF65 белков к реакции сращивания указывается символами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Белка | Предпочтительная последовательность (ы) |
| U2AF65 | U-богатые содержащие Cs |
| Sxl | U-богатые содержащие 2-4 Gs |
| Ptb | UCUUC богатых с некоторыми Gs |
| hnRNP C1 | U-богатые (5-6 длиной) |
| CstF64 | ГУ-богатые |
| hnRNP E1/E2 и K | C-богатые |
| U2AF65/U2AF35 неогородный | UUUYYYYUNUAGGU |
Таблица 1: Предпочтительные места связывания для некоторых РНК-связывающих белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нуклеиновые кислотно-связывающие белки являются важными регуляторами развития животных и растений. Ключевым требованием для процедуры SELEX является разработка анализа, который может быть использован для разделения белковых и несвязанных рнковых фракций. В принципе, это анализ может быть in vitro связывания ассе, таких как фильтр-связывающий анализ, гель мобильности сдвиг анализа, или матричной связывания анализ19 для рекомбинантных белков, очищенных белков или белковых комплексов. Асссхема также может быть ферментативным расследованием, когда прекурсоры и продукты (или промежуточные) могут быть разделены в зависимости от размера или некоторых других средств20.
В то время как мутагенез широко используется для характеристики связывающих участков для белков, он трудоемкий, и трудоемкий и более длинные последовательности не так легко поддаются мутамагенезу насыщения. Значение описанного здесь итеративного подхода привязки и усиления заключается в том, что он не только преодолевает некоторые из вышеуказанных ограничений, но и может, самое главное, определить ранее неизвестные сайты связывания и предоставить важную информацию о нуклеотидные требования в каждой позиции в то же время.
Важным фактором успеха итеративного отбора-усиления является обязательное сродство и специфичность. Как правило, используется от 12 до 15 раундов отбора-усиления и пространство последовательности от 1012 до 1015 молекул можно регулярно отобранных. Прогресс и окончательный успех протокола усиления отбора можно контролировать с помощью обязательного ассеификатора или прямого последовательности, который отслеживает сродство или обогащение конкретных последовательностей в промежуточных пулах, соответственно. В то время как обязательный анализ традиционно использовался, появление последовательности следующего поколения позволяет анализировать обогащение последовательности способами, невозможными с помощью ручного секвенирования Sanger14.
Важным шагом в успехе SELEX является разное обогащение желаемых молекул на каждом шагу. Количество циклов, необходимых для SELEX, варьируется и зависит от нескольких факторов. Например, если в каждом раунде достаточно количество раундов, достаточно меньше раундов. Однако, если ассс позволяет высокую долю нежелательных последовательностей в связанном пуле, дополнительные раунды станут необходимыми для обогащения желаемых последовательностей РНК. Ограничение техники или непреднамеренное следствие необходимости дополнительных циклов отбора-усиления, которые необходимо иметь в виду, является возможность того, что он может ввести артефакты или обогатить последовательности, которые имеют несвязанные свойства, такие как их способность усиливать. Наконец, в то время как некоторые приложения извлекают выгоду из самых высоких связующих связующих веществ, для других целей, баланс должен быть достигнут в процессе отбора-усиления между связывающей близостью и функцией, потому что жесткие связывающие последовательности не обязательно могут быть наиболее функциональные последовательности в биологических контекстах (например, если последовательность распознается несколько раз различными белками во время сплайсинга).
Среди изменений и устранения неполадок для улучшения процедуры, отрицательный выбор или встречный выбор могут быть использованы для повышения специфичности. Аналогичным образом, использование различных протоколов раздела, таких как анализ связывания фильтра, за которым следует анализ смещения подвижности геля, может устранить обогащение нежелательных последовательностей, которые связывают, например, с фильтром нитроцеллюлозы или матрицей столбца21. Учитывая, что взаимодействия белков-нуклеиновых кислот имеют как специфические, так и неспецифические компоненты, буферные условия, такие как соль и рН, оказывают влияние на взаимодействия РНК-белка. Кроме того, использование соответствующей концентрации белка может иметь прямое влияние на удержание сильных, слабых и неспецифических связующих веществ. Давление отбора может быть увеличено в последовательных раундах, например, путем включения конкурента РНК, снижение концентрации белка, или сокращение времени инкубации. Таким образом, тщательные рассмотрения и оптимизация этих параметров могут повлиять на результат протокола SELEX.
В последнее время было разработано множество вариаций или модификаций оригинального протокола SELEX, которые преодолели некоторые из упомянутых выше ограничений. К ним относятся высокая пропускная способность-SELEX (HT-SELEX), которая сочетает в себе SELEX и массово параллельное секвенирование6, RNAcompete, которая включает в себя инкубацию с избытком неслучайной РНК, выдвижной связанной РНК, флуоресцентной маркировки РНК, и анализ на microarrays5, RNA Bind-n-Seq, которая сочетает в себе анализ сродства РНК в количественной и высокой пропускной способностью моды22, и RAPID-SELEX, который сокращает процесс и включает в себя не-усиление шаг23.
Химически модифицированные основания были использованы для расширения репертуара молекул РНК для конкретных приложений24. Диагностика, терапия, а также молекулы с каталитической деятельностью являются одними из многих применений (в том числе в медицине) выбранных молекул25. Aptamers дополняют антитела на основе протоколов и обеспечить отличные инструменты, потенциал которых, например, в диагностике, терапии и других приложений, остается в полной мере использовать26,27,28. В будущем, например, клинические преимущества являются одними из многочисленных желаемых приложений, за то, что первый FDA утвержденных aptamer (Pegaptanib натрия) может доставить для возрастной макулярной дегенерации. Масштабируемая протеомная технология для измерений белка предлагает шаг к пониманию здоровья и болезней24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет, что у него нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Автор благодарит Национальные институты здравоохранения за прошедшее финансирование.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
