Summary
خصوصية التسلسل أمر بالغ الأهمية لتنظيم الجينات. البروتينات التنظيمية التي تعترف تسلسل معين مهمة لتنظيم الجينات. إن تحديد مواقع الربط الوظيفي لهذه البروتينات يمثل مشكلة بيولوجية صعبة. ويرد هنا وصف لنهج تكراري لتحديد موقع ملزم لبروتين ملزم بالحمض النووي الريبي، وهو ينطبق على جميع البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي.
Abstract
يلعب تنظيم الجينات دورًا هامًا في جميع الخلايا. يتم استخدام خطوات النسخ، وما بعد النسخ (أو معالجة الحمض النووي الريبي)، والترجمة، وخطوات ما بعد الترجمة لتنظيم جينات محددة. تستهدف البروتينات الملزمة بالحمض النووي الخاصة بالتسلسل تسلسلات محددة للتحكم في التعبير الجيني المكاني أو الزمني. تتميز مواقع الربط في الأحماض النووية عادة بتحليل الطفرة. ومع ذلك، فإن العديد من البروتينات ذات الأهمية ليس لها موقع ملزم معروف لمثل هذا الوصف. هنا نقوم بوصف نهج لتحديد مواقع الربط غير معروف سابقا للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي. وهو ينطوي على اختيار تكراري وتضخيم تسلسل بدءا من تجمع تسلسل معشاة. بعد عدة جولات من هذه الخطوات النسخ، ملزمة، وتضخيم-تسلسل المخصب يتم تسلسل لتحديد موقع (مواقع) ملزمة المفضلة. يتم رصد نجاح هذا النهج باستخدام الاختبارات الملزمة في المختبر. وفي وقت لاحق، يمكن استخدام الاختبارات الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم الأهمية البيولوجية للتسلسلات المختارة. ويسمح هذا النهج بتحديد وتوصيف موقع (مواقع) ملزمة لم تكن معروفة من قبل لأي بروتين ملزم بالحمض النووي الريبي الذي يوجد له أي وصف لفصل RNAs المرتبط بالبروتين وغير المنضم.
Introduction
في بيولوجيا الخلايا، تنظيم الجينات يلعب دورا مركزيا. في خطوة واحدة أو خطوات متعددة على طول مسار التعبير الجيني، الجينات لديها القدرة على تنظيمها. وتشمل هذه الخطوات النسخ (بدء، استطالة، وإنهاء) فضلا عن الربط، polyadenylation أو 3 'تشكيل نهاية، تصدير الحمض النووي الريبي، وترجمة mRNA، والاضمحلال / توطين النصوص الأولية. في هذه الخطوات، البروتينات الملزمة بالحمض النووي تعدل تنظيم الجينات. تحديد المواقع الملزمة لهذه البروتينات هو جانب مهم من دراسة السيطرة على الجينات. وقد استخدمت تحليل الطفرات ومقارنة التسلسل الجيني لاكتشاف التسلسل التنظيمي أو مواقع ربط البروتين في الأحماض النووية، مثل المروجين، ومواقع لصق، وعناصر تعدد الإنكار، وإشارات الترجمة1، 2 , 3 , 4.
الربط قبل mRNA هو خطوة لا تتجزأ خلال التعبير الجيني والتنظيم. غالبية جينات الثدييات، بما في ذلك تلك الموجودة في البشر، لديها الإنترونات. جزء كبير من هذه النصوص هو بدلا من ذلك لصقها، مما أدى إلى عدة الحمض النووي الريبي والبروتين isoforms من نفس الجينات أو النص الأولي. هذه الإيزوفورمات لها أدوار محددة الخلية والتنموية في بيولوجيا الخلايا. موقع الربط 5'، ونقطة الفرع، وموقع الربط polypyrimidine-tract/3' هي إشارات الربط الحرجة التي تخضع للتنظيم. في تنظيم سلبيّة, خلاف ذلك قوّيّة لصق موقعة قمعت, بينما في نظام تعديل إيجابيّة ضعيفة لصق موقعة يكون تنشيطت. مزيج من هذه الأحداث تنتج مجموعة كبيرة من isoforms متميزة وظيفيا. تلعب البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي أدوارًا رئيسية في أحداث الربط البديلة هذه.
ومن المعروف العديد من البروتينات التي لا يزال من المقرر تحديد مواقعها الملزمة أو أهداف الحمض النووي الريبي5و6. وكثيرا ً ما يكون ربط البروتينات التنظيمية بأهدافها أو تسلسلاتها البيولوجية في المراحل النهائية عملية معقدة. وبالنسبة لهذه البروتينات، فإن تحديد الحمض النووي الريبي المستهدف أو موقع الربط هو خطوة هامة في تحديد وظائفها البيولوجية. وبمجرد تحديد موقع ملزم، يمكن زيادة وصفه باستخدام التحليلات الجزيئية والكيميائية الحيوية القياسية.
وللنهج الموصوف هنا ميزتان. أولا، فإنه يمكن تحديد موقع ربط غير معروف سابقا لبروتين من الفائدة. ثانياً، هناك ميزة إضافية لهذا النهج هي أنه يسمح في الوقت نفسه بتحول التشبع، الذي لولا ذلك لكان كثيف العمالة للحصول على معلومات قابلة للمقارنة حول متطلبات التسلسل داخل موقع الربط. وبالتالي، فإنه يوفر أداة أسرع وأسهل وأقل تكلفة لتحديد مواقع ربط البروتين في RNA. في الأصل، تم استخدام هذا النهج (SELEX أو التطور المنهجي للأربطة من قبل إثراء EXponential) لوصف موقع ملزم للبكتيريا T4 DNA polymerase (الجينات 43 البروتين)، الذي يتداخل مع موقع ربط ريبوسوم في mRNA الخاصة به. يحتوي موقع الربط على تسلسل حلقة 8-قاعدة، يمثل 65,536 متغير معشاة للتحليل7. ثانياً، استُخدم هذا النهج أيضاً بشكل مستقل لإظهار أنه يمكن اختيار مواقع ربط محددة أو aptamers لأصباغ مختلفة من مجموعة من حوالي 1013 تسلسل8. في الواقع، وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع في العديد من السياقات المختلفة لتحديد aptamers (RNA أو تسلسل الحمض النووي) لربط العديد من ligands، مثل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والخلايا، وللحفز9. على سبيل المثال، يمكن أن تميز aptamer بين اثنين من مشتقات الزانثين، الكافيين والثيوفيلين، والتي تختلف من خلال وجود مجموعة الميثيل واحدة في الكافيين10. لقد استخدمنا هذا النهج على نطاق واسع (SELEX أو التكراري اختيار التضخيم) لدراسة كيفية عمل البروتينات الملزمة RNA في الربط أو الربط اللائحة11، والتي ستكون الأساس للمناقشة أدناه.
المكتبة العشوائية: استخدمنا مكتبة عشوائية من 31 نيوكليوتيدات. واستند النظر في طول المكتبة العشوائية بشكل فضفاض على فكرة أن عامل الربط العام U2AF65 يرتبط بتسلسل بين تسلسل نقطة الفرع وموقع الربط 3. في المتوسط، والتباعد بين هذه الإشارات الربط في الميتازوانات هو في نطاق 20 إلى 40 النيوكليوتيدات. ومن المعروف بروتين آخر الجنس القاتلة لربط تسلسل التنظيمية سيئة تتميز بالقرب من موقع لصق 3 'من الهدف قبل mRNA، محول. وهكذا، اخترنا منطقة عشوائية من 31 النيوكليوتيدات، وتحيط بها مواقع الربط التمهيدي مع مواقع إنزيم تقييد للسماح لتضخيم PCR والتعلق من T7 RNA بوليميراز المروج للنسخ في المختبر. كان حجم المكتبة النظرية أو تعقيد431 أو ما يقرب من 1018. استخدمنا جزء صغير من هذه المكتبة لإعداد تجمع الحمضالنووي الريبي العشوائي لدينا (~ 10 12-1015)للتجارب الموضحة أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يوفر الشكل 1 ملخصاً للخطوات الرئيسية في عملية التحديد التكراري والتضخيم (SELEX).
1. إنشاء قالب مكتبة عشوائية
- توليف التمهيدي إلى الأمام 5 '- GTAATACCTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' والتمهيدي العكسي 5 '- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' عن طريق التوليف الكيميائي على المزج الحمض النووي.
ملاحظة: يمكن توليف التمهيديات والمكتبة العشوائية تجارياً. - توليف مكتبة عشوائية قالب oligonucleotide 5 '- GGTGATCAGATTATATCCA (N1... N31)TGAAGCGTGTATCCGC-3' عن طريق التركيب الكيميائي. استخدام خليط متساوي الأضلاع من أربعة فوسفوريميدات أثناء التوليف للمواقع المعشاة 31 المبينة أعلاه كما N.
ملاحظة: يحتوي تسلسل قالب المكتبة على 31 نيوكليوتيدات عشوائية (N1 إلى N31) وتسلسلات محيطية لربط التمهيديات الأمامية والعكسية. ويشمل التمهيدي إلى الأمام T7 RNA البلمرة تسلسل المروج (وأكد) للنسخ في المختبر وموقع تقييد Bcl1 (مائل) للاستنساخ. يحتوي التمهيدي العكسي على مواقع إنزيمية تقييدية BamH1 وHindIII (مائلة) لتسهيل الاستنساخ.
2. توليد مجمع مكتبة عشوائية الحمض النووي
- قم بإرفاق مروج بوليميراز T7 RNA بالمكتبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يحتوي على قالب مكتبة عشوائي للحمض النووي 1 ميكرومتر،1 ميكرومتر من كل التمهيدي، 20 مليون متر مربع (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1.5 مليون متر من الـ MgCl 2، 50 مل كيلو كل، 0.1 ميكروغرام/ميكروز أسيتيلات مصل البقر الزلال، وحدتان من التقوى /c1> بوليميراز، و 200 ميكرومتر كل من dNTPs (ديوكسيغوانوسين، ديوكسيأدينوزين، ديوكسيسيتيدين، وديوكسيثيميدين ثلاثي الفوسفات).
- استخدم خمس دورات من إزالة النُقّة، والصلب، وخطوات التمديد (94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و53 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) من PCR متبوعة بدورة واحدة من التمديد (72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
3. توليف تجمع 0 RNA
- إعداد 100 درجة مئوية رد فعل النسخ12. مزيج T7 النسخ العازلة، 1 μM مكتبة عشوائية تجمع الحمض النووي، 5 mM ثنائي ثيوثريتول (DTT)، 2 mM guanosine ثلاثي الفوسفات (GTP)، 1 mM كل من أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، سيتيدين ثلاثي الفوسفات (CTP)، وأوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP)، و 2 وحدات / ميكرولتر T7 RNA بولميراز.
ملاحظة: يمكن نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر باستخدام مجموعات متاحة تجاريا مع خيار من بوليميراز T7 أو SP6 RNA. - احتضان خليط التفاعل أعلاه في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- جل تنقية الحمض النووي الريبي في 10٪ ديناتوريينغ بولياكريلاميد هلام.
- تحديد موقع النصوص على الجل عن طريق تلطيخه بالميثيلين الأزرق أو التصوير الشعاعي التلقائي عن طريق إدراج آثار النشاط الإشعاعي (0.5 ميكرولتر أو أقل من α-32P UTP) في رد فعل النسخ.
- ضع شريحة الجل في أنبوب الطرد المركزي واستراحة إلى قطع أصغر، على سبيل المثال، مع طرف المجانسة. إضافة proteinase K (PK) العازلة (100 M تريس، والحموضة 7.5، 150 مل كلوريد الصوديوم، 12.5 mM EDTA، 1٪ كبريتات دوسيديل الصوديوم) لتزج قطع هلام. ترك الأنبوب على الجوز من 2 ساعة إلى ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تدور في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عالية السرعة (14,000 دورة في الدقيقة أو 16,873 × ز) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام هلام واستعادة الحل العازلة.
- دوامة العينة مرتين مع حجم متساو من الفينول الكلوروفورم ومرة واحدة مع الكلوروفورم.
- اخلط المرحلة المائية من الأعلى مع مقدار عشر خلات الصوديوم (3.0 م، درجة الحموضة 5.2)، 10 ميكروغرام من الرنا أو 20 ميكروغرام من الجليكوجين، والإيثانول (2-3 مجلدات، مخزنة عند -20 درجة مئوية). ترك الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تدور الأنابيب التي تحتوي على الحل لمدة 5-10 دقيقة عند 4 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي صغير (14000 دورة في الدقيقة أو 16,873 × ز). تجاهل supernatant بعناية. شطف بيليه RNA مع الإيثانول 70٪ وتدور لمدة 2-5 دقيقة. الهواء يجف بيليه الحمض النووي الريبي.
- Solubilize بيليه RNA في 50 درجة مئوية من المياه المعالجة مع من البيروكربونات ثنائي إيثيل (DEPC). اترك العينة عند -20 درجة مئوية للتخزين.
ملاحظة: تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة تدور المتاحة تجاريا، والتي تستخدم حاليا أكثر شيوعا لإزالة النشاط الإشعاعي غير المدمجة وتكون بمثابة بديل سريع وأكثر ملاءمة لتنقية الحمض النووي الريبي.
تحذير: استخدم درع زجاجي أكريليكي وقفازات واحتياطات أخرى للحماية من النشاط الإشعاعي.
4. البروتين ملزمة رد فعل وفصل الحمض النووي الريبي ملزمة
- تنفيذ ربط البروتين والحمض النووي الريبي في 10 m Tris-HCl, درجة الحموضة 7.5 في حجم 100 درجة مئوية عن طريق إضافة المكونات التالية إلى هذه التركيزات النهائية: 50 مل كيلو كل, 1 mM DTT, 0.09 ميكروغرام /ميكروL ألبوم المصل البقري, 0.5 وحدة /ميكرولتر RNasin, 0.15 ميكروغرام /ميكرولتر tRNA ، 1 MM EDTA، و 30 ميكرولتر من البروتين المؤتلف المناسب (PTB) التركيز. إضافة RNA من التجمع المناسب.
ملاحظة: عادة ً ما يرتبط عامل الربط U2AF65 بمواقع الربط متعددة المسالك/3 للإنترونات النموذجية ذات التقارب الملزم (ثابت تفكك التوازن أو Kd)بحوالي 1-10 نم. ولذلك، استخدمت الجولتين الأوليين من الربط تركيز البروتين 10 أضعاف فوق Kd لU2AF65; بالنسبة لبروتينات SXL وPTB، كان التركيز الأولي في هذا النطاق هو أفضل تخمين لدينا فقط. هذا ضمن أنّ ب رغب [رنا] نوع أنّ استطاع ربطت, رغم أنّ [لوور] تقارب تسلسل أيضا يحتمل ضمّ. في الجولتين 3 و4 (النسخ، والتجليد، والتضخيم)، تم تخفيض تركيز البروتين ثلاثة أضعاف (الخطوة 4.1). وقد تم ذلك للقضاء على التوالي الأنواع RNA تقارب منخفضة. - ضع الأنابيب التي تحتوي على ردود الفعل الملزمة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في كتلة درجة الحرارة (أو على الجليد).
- تجزئة RNA منضم من RNA غير منضم لأول 4 جولات من التضخيم الاختيار باستخدام الخطوات التالية.
- تصفية العينة (100 درجة مئوية) في درجة حرارة الغرفة من خلال مرشح nitrocellulose تعلق على مشعب فراغ.
ملاحظة: مجمع البروتين الحمض النووي الريبي، ولكن ليس الحمض النووي الريبي غير المنضم، لا يزال على عامل التصفية. - ختم مرشح مع الحمض النووي الريبي الاحتفاظ بها إلى شظايا مع شفرة الحلاقة المعقمة. إدراج هذه في أنبوب الطرد المركزي. استعادة الحمض النووي الريبي عن طريق تراجع الأنبوب بلطف لمدة لا تقل عن 3 ساعة (أو بين عشية وضحاها) مع قطع فلتر مغمورة في المخزن المؤقت Proteinase K (PK).
- إزالة البروتين من عينة الحمض النووي الريبي عن طريق دوامة في وجود حجم متساو من الفينول الكلوروفورم (1: 1) ومن ثم الكلوروفورم. استعادة المرحلة المائية في كل مرة عن طريق الطرد المركزي العينة بسرعة عالية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- مزجه مع خلات الصوديوم (0.1 حجم 3.0 M، الحموضة 5.2) والإيثانول (2-3 مجلدات من الإيثانول المطلق، 200 دليل). ترك الأنبوب في -80 درجة مئوية الفريزر لمدة 30 دقيقة، والطرد المركزي في سرعة عالية لمدة 10 دقيقة، وبعد خطوات الغسيل والتجفيف (الخطوة 3.8)، solubilize الحمض النووي الريبي في المياه المعالجة مع DEPC. ويرد أعلاه موجز لهذه الخطوات (الخطوات 3-6 إلى 3-9).
- تصفية العينة (100 درجة مئوية) في درجة حرارة الغرفة من خلال مرشح nitrocellulose تعلق على مشعب فراغ.
- افصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين عن الكسور غير المنضمة للجولتين الأخيرتين (الجولتين 5 و6؛ النسخ، التجليد، والتضخيم) على النحو التالي. تقليل تركيز البروتين في رد الفعل الملزم (الخطوة 4.1) بثلاثة أضعاف إضافية لضغط اختيار إضافي لإثراء تسلسلات ربط عالية التقارب وإزالة التسلسلات المنخفضة التقارب بشكل تفضيلي.
- قبل يلقي هلام بوليأكريلاميد الأصلي (5٪ مع 60:1 أكريلاميد: بيس-أكريلاميد نسبة) في 0.5x TBE العازلة (Tris-Borate-EDTA) قبل إعداد رد الفعل أعلاه RNA: البروتين ملزمة (الخطوة 4.1). الكهربائي هذا الجل في غرفة باردة (4 درجة مئوية) عن طريق تطبيق 250 V لمدة 15 دقيقة.
- ماصة الحمض النووي الريبي أعلاه: ردود الفعل البروتين ملزمة (الخطوة 4.1) في آبار مختلفة من هذا الجل.
ملاحظة: يتم تخزين البروتين في -80 درجة مئوية والمخففة قبل استخدامها في 20 مل 4-(2-هيدروكسي إيثيل) piperazine-1-حمض الإيثانسولفونيك (HEPES)، درجة الحموضة 8.0، 20٪ الجلسرين، 0.2 مإيثيلينديامينيتراسيتيك حمض (EDTA)، 0.05٪ NP-40، و 1 مليون ديثيوثريتول (DTT). إضافة 0.5-1.0 mمثبط البروتياز فينيل ميثان سلفونيل فلوريد (PMSF) هو اختياري. في رد الفعل ملزمة، وهذا المخزن المؤقت يساهم حوالي 6٪ الجلسرين، والذي يسمح التحميل المباشر للعينات في الآبار دون الحاجة إلى خلطها مع المخزن المؤقت تحميل هلام منفصلة. - كسر الحمض النووي الريبي منضم من RNA غير منضم باستخدام الكهربائي هلام في غرفة باردة (4 درجة مئوية) في 250 V لمدة 1 إلى 2 ساعة. وتعرف هذه العملية أيضا باسم هلام التنقل التحول التناقل.
ملاحظة: تختلف مدة الكهربائي اعتماداً على ميزات الحمض النووي الريبي والبروتين المستخدم للربط. - قم بتعريض الجل لفيلم الأشعة السينية وتحديد موقع الحمض النووي الريبي المرتبط باستخدام التصوير الشعاعي التلقائي. قطع شريحة هلام مع RNA ملزمة وإدراجه في أنبوب.
- قم بحضانة شريحة الجل المسحوق في المخزن المؤقت PK المستخدم للإلتزاز لمدة 3 ساعات أو بين عشية وضحاها.
- كرر الخطوات من 3.5 إلى 3.9 الموضحة أعلاه. لفترة وجيزة، دوامة عينة RNA eluted بقوة أولا مع الفينول الكلوروفورم ومن ثم مع الكلوروفورم.
- مزيج خلات الصوديوم والإيثانول مع المرحلة المائية بعد استخراج الكلوروفورم. بعد الحضانة في -80 درجة مئوية الفريزر، تدور في 4 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة لجمع بيليه RNA. غسل بيليه RNA مع الإيثانول والهواء الجاف عن طريق ترك غطاء الأنبوب مفتوحا. حل الحمض النووي الريبي في المياه المعالجة مع DEPC.
ملاحظة: يسمح التحول إلى اختبار التحول التنقل هلام لتجزئة القضاء على الأنواع RNA غير المرغوب فيها التي قد تكون غنية لربط، على سبيل المثال، إلى مرشح nitrocellulose هنا (أو أي مصفوفة) المستخدمة في الجولات الأولية للتجزئة.
5. النسخ العكسي وتضخيم PCR
- توليف cDNA من الحمض النووي الريبي المذاب باستخدام النسخ العكسي والتمهيدي العكسي عن طريق احتضان رد فعل 20 ميكرولتر (2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 2 ميكرولتر من AMV عكس النسخ، 1 μM التمهيدي العكسي، 10 ميكرول من الحمض النووي الريبي، مثبط RNase اختياري) في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- تضخيم cDNA باستخدام 20-25 دورات PCR كما هو موضح في الخطوة 2.1.
6. النسخ والبروتين ملزمة
- كرر عملية تخليق الحمض النووي الريبي، ربط البروتين، فصل البروتين المرتبط ة والكسر غير المنضم، كما هو موضح في القسم 3-5 أعلاه.
7. تحليل تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين
- استخدم تسرب إزاحة التنقل الهلامي (الخطوة 4.4) أو التجليد في عامل التصفية (الخطوة 4.3) لتحديد التقارب والخصوصية الملزمة لتجمعات محددة أو تسلسلات فردية داخل كل تجمع (انظر الخطوة 8.3).
- استخدم التصوير الشعاعي التلقائي أو صورة الفوسفور للكشف عن النطاقات وتحديدها كمياً في الكسر المنضم والكسر غير المنضم.
8 - الاستنساخ والتسلسل
- هضم المنتج النهائي للحمض النووي الريبي مع إنزيمات تقييد Bcl1 وHindIII لمدة 1-2 ساعة، ligate مع pGEM3 المهضوم بشكل مناسب أو غيرها من البلازميدات التي تحمل مواقع تقييد من 2 ساعة إلى بين عشية وضحاها، وتحويل المنتج الربط إلى الخلايا البكتيرية المختصة بواسطة صدمة الحرارة أو الكهربائي باستخدام إجراءات البيولوجيا الجزيئية القياسية13.
- تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها عن طريق طلاء الخلايا المحولة على لوحات أجار مع لوريا بيرتاني (LB) المتوسطة وampicillin (50 ميكروغرام / مل) في 37 درجة مئوية. اختيار المستعمرات لتلقيح أنابيب الثقافة التي تحتوي على وسط السائل LB مع أمبيسيلين وتنمو في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها. تنقية البلازميد DNAs التي تحتوي على إدراج الحمض النووي باستخدام بروتوكول عزل بلازميد القياسية13.
ملاحظة: تتوفر مجموعات تجارية لتنقية بلازميد. - تسلسل بلازميدات مع إدراج الحمض النووي باستخدام بروتوكول تسلسل إنهاء سلسلة dideoxy، باتباع تعليمات الشركة المصنعة لتسلسل14.
ملاحظة: يمكن إجراء التسلسل في المنزل أو القيام به تجارياً.
9. محاذاة التسلسل
- محاذاة التسلسلات والحصول على موقع (مواقع) ربط توافق الآراء باستخدام أدوات المحاذاة المتاحة عبر الإنترنت
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين الملاحظات التالية نجاح عملية التضخيم والتحديد (SELEX). أولاً، قمنا بتحليل التجمع 0 والتسلسلات المحددة لربط البروتين المستخدم لنهج التضخيم التكراري. ويبين الشكل 2 أن البروتين الملزم للبوليبيريميدين الثدييات (PTB) يظهر بالكاد الربط القابل للكشف لتسلسل التجمع 0 ولكن تقارب عالية لتجمع التسلسل المحدد. كان هناك بالكاد ملزمة للكشف عن تجمع 0 عندما استخدمنا حوالي 300 أضعاف تركيز البروتين أعلى لربط من المستخدمة لتجمع المحدد. وهكذا، كان هناك على الأقل عدة مئات من الفرق أضعاف في الروابط البروتين ملزمة بين تجمع عشوائي أو بدء تجمع وبركة مختارة. وتؤكد هذه الملاحظة تجريبياً أن بروتوكول التضخيم والاختيار الوارد وصفه هنا ناجح.
ثانياً، قمنا بتسلسل المجموعة المختارة وتحديد موقع ملزم بتوافق الآراء. وكان التسلسل التوافقي الذي تم الحصول عليه من محاذاة غالبية التسلسلات المختارة من المجموعة التي اختارتها الثدييات PTB: GCCUG(Y/G)UGCYYYYYYYYG(Y/G)CCC. وهذا يدل على أننا قد اخترنا تسلسل فريدة من نوعها البيريميدين الغنية التي تربط PTB11. عندما قمنا بإجراء التحديد التكراري - تضخيم للمجال الملزم لRNA من DROsophila PTB، قمنا بإثراء تسلسلات الغنية بالنحاس التي قاطعتها guanosines. من بين تسلسل تقارب عالية أن PTB Drosophila اختيار كان تسلسل 84٪ بيريميدين الغنية: GCUUUUCCUCUGUCGCCCUCUUCUCCUCUCUG. في الواقع، هذا التسلسل يشبه تسلسل البيريميدين الغنية الموجودة في الإنترون ألفا تروبوموسين الذي يربط مع تقارب عالية إلى وينظم من قبل PTB الثدييات15. لقد استخدمنا بنجاح هذا النهج مرارا وتكرارا لدراسة خصائص الحمض النووي الريبي ملزمة وظائف الربط المنظمين وعامل الربط11،15،16. ويبين الجدول 1 أمثلة ناجحة للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التي استُخدمت SELEX من أجلها لتحديد موقعها (مواقعها) الملزمة المفضلة أو التي توافق الآراء.
ثالثاً، يظهر اختبار الربط في المختبر، الذي يستند إلى اختيار موقع الربط البديل 3، أهمية وظيفية لخصائص مميزة ولكن متداخلة لروابط الحمض النووي الريبي للبروتينات الملزمة للمادة البوليبيريميدين. في حين يتم استخدام موقع لصق المنبع 3 'بشكل افتراضي، إضافة PTB المؤتلف يؤدي إلىتنشيط موقع لصق البديل أو المصب 3 ' (الشكل 3). وعلى النقيض من ذلك، فإن إضافة HNRNP C17 المؤتلف يؤدي إلى قمع كل من مواقع الربط 3' . إضافة عامل الربط العام المؤتلف U2AF65 يعكس قمع موقع لصق hnRNP C1-بوساطة 3 ' (الشكل3)وكذلك تأثير PTB بوساطة على تنشيط موقع لصق المصب 3 '(البيانات غير مبينة). تفسير بسيط لهذه الآثار هو المنافسة المباشرة بين ربط عامل لصق العام U2AF65 وPTB (وتسمى أيضا hnRNP I)، والتي تربط بشكل تفضيلي وقمع بعض المواقع 3 'لصقات، أو بين U2AF65 و hnRNP C، الذي يربط وقمع كل من 3 'لصق المواقع.
الشكل 1: موجز الخطوات الرئيسية في عملية التضخيم والاختيار التكراري (SELEX). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إثراء الاتفاقات RNSملزمة بـ PTB. وقد استُخدم تركيز متزايد (مثلثات مملوءة) من PTB المؤتلف إما مع تجمع مُصنّف لاسلكياً 0 RNA أو مع البركة المختارة التي تم الحصول عليها بعد ست جولات من الاختيار والتضخيم. يشار إلى مواقف من [رنا] غيرمنضم وال [رنا]: بروتين مركبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يؤكد اختبار تبديل موقع لصق الخصائص الملزمة المتميزة للبروتينات الملزمة ببيريميدين. (A-أعلى) مخططات الركيزة الربط. يحتوي الركيزة الربط على موقع لصق 5 'واثنين من المواقع البديلة 3 'لصق المحيطة intron. المستطيلات (مفتوحة، مع خطوط أفقية، وصلبة) هي exons والخط هو intron. (A-أسفل) hnRNP C1 يقمع موقع لصق المنبع 3 '(دون تنشيط موقع لصق المصب 3')، في حين أن PTB يؤدي إلى تفعيل موقع لصق المصب 3'. تم احتضان الركيزة الربط في استخراج خلية هيلا النووية. تم تحليل منتجات الربط (كما هو موضح على الجانبين) باستخدام اختبار تمديد التمهيدي18 مع التمهيديات تقاطع لصق (الأسهم)، والتي تعترف ربط موقع الربط 5 'المشتركة إلى إما في المنبع أو موقع لصق 3 'المصب. (ب) المؤتلف U2AF65 (rU2AF65)عكس الأثر القمعي للHNRNP C1. إضافة البروتينات hnRNP C1 المؤتلف، PTB، أو rU2AF65 إلى رد الفعل الربط يشار إليها من قبل + الرموز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البروتين | التسلسل (التسلسلات) المفضلة |
| U2AF65 | U-الغنية التي تحتوي على Cs |
| SXL | U-الغنية التي تحتوي على 2-4 Gs |
| Ptb | UCUUC الغنية مع بعض ع |
| hnRNP C1 | [أو-ريش] (5-6 طويلة) |
| في هذا الـ45 | GU-الغنية |
| hnRNP E1/E2 و K | C-الغنية |
| U2AF65/U2AF35 heterodimer | UUUYYYUNUAGGU |
الجدول 1: مواقع الربط المفضلة لبعض البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتينات الملزمة بالأحماض النووية هي جهات تنظيمية هامة لتنمية الحيوانات والنباتات. أحد المتطلبات الرئيسية لإجراء SELEX هو تطوير الفحص الذي يمكن استخدامه لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين وغير المنضمة. من حيث المبدأ، يمكن أن يكون هذا الفحص في المختبر فحص ملزمة مثل الفحص ملزمة مرشح، وهلام نقل التحول الفحص، أو مصفوفة ملزمة الفحص19 للبروتينات المؤتلفة، والبروتينات النقية، أو مجمعات البروتين. ويمكن أن يكون الفحص أيضا ً فحصاً أنزيافياً حيث يمكن فصل السلائف والمنتجات (أو الوسيطة) على أساس الحجم أو بعض الوسائل الأخرى20.
في حين تم استخدام الطفرات على نطاق واسع لوصف مواقع ملزمة للبروتينات، فإنه شاقة، وتستغرق وقتا طويلا وتسلسل أطول ليست سهلة يمكن أن يكون لها التشبع. إن أهمية نهج الربط التكراري والتضخيم الموصوف هنا هي أنه لا يتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه فحسب، بل يمكن أن يحدد أهم المواقع الملزمة غير المعروفة من قبل ويوفر معلومات هامة عن متطلبات النيوكليوتيد في كل موقف في نفس الوقت.
ومن الاعتبارات الهامة لنجاح التحديد التكراري - التضخيم التقارب والتحديد الملزمين. عادة، يتم استخدام 12 إلى 15 جولات من اختيار التضخيم والفضاء تسلسل من 1012 إلى 1015 جزيئات يمكن أخذ عينات روتينية. ويمكن رصد التقدم المحرز والنجاح النهائي لبروتوكول الاختيار والتضخيم باستخدام اختبار ملزم أو تسلسل مباشر، يرصد التقارب بين تسلسلات محددة أو إثراءها في المجمعات المتوسطة، على التوالي. في حين أن الاختبار الملزم كان يستخدم تقليديا، وظهور تسلسل الجيل القادم يسمح بتحليل إثراء التسلسل بطرق غير ممكنة من خلال تسلسل Sanger اليدوي14.
خطوة حاسمة في نجاح SELEX هو إثراء أضعاف الجزيئات المطلوبة في كل خطوة. عدد الدورات المطلوبة لSELEX يختلف ويعتمد على عدة عوامل. على سبيل المثال، إذا كان الإثراء الطي للتسلسلات المطلوبة أو المحددة أعلى في كل جولة، سيكون عدد أقل من الجولات كافياً. ومع ذلك، إذا كان فحص يسمح نسبة عالية من التسلسلات غير المرغوب فيها في تجمع منضم، سوف تصبح جولات إضافية ضرورية لإثراء تسلسل RNA المطلوب. إن الحد من هذه التقنية أو النتيجة غير المقصودة للحاجة إلى دورات إضافية من التضخيم والاختيار التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار هو إمكانية أن تقدم القطع الأثرية أو تثري التسلسلات التي لها خصائص غير ذات صلة مثل خصائصها القدرة على تضخيم. وأخيراً، في حين أن بعض التطبيقات تستفيد من أعلى المجلدات التقارب، لاستخدامات أخرى، يجب تحقيق توازن أثناء عملية التضخيم الاختيار بين التقارب ملزم والدالة لأن تسلسلات الربط الأكثر إحكاماً قد لا يكون بالضرورة التسلسلات الأكثر وظيفية في السياقات البيولوجية (على سبيل المثال، إذا تم التعرف على تسلسل عدة مرات من قبل بروتينات مختلفة أثناء الربط).
من بين التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين الإجراء، يمكن استخدام التحديد السلبي أو اختيار العداد لزيادة الخصوصية. وبالمثل، يمكن استخدام بروتوكولات تقسيم مختلفة، مثل اختبار ربط الفلتر متبوعاً بالفحص التحول التنقلي للهلام، القضاء على إثراء التسلسلات غير المرغوب فيها التي تربط، على سبيل المثال، بمرشح النيتروسيلولوز أو مصفوفة الأعمدة21. وبالنظر إلى أن تفاعلات الأحماض البروتينات والنووية لها مكونات محددة وغير محددة على حد سواء، فإن الظروف العازلة مثل الملح ودرجة الحموضة لها آثار على تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتيني. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام تركيز البروتين المناسب يمكن أن يكون له تأثير مباشر على الاحتفاظ بالمجلدات القوية والضعيفة وغير المحددة. يمكن زيادة ضغط الاختيار في الجولات المتعاقبة، على سبيل المثال، عن طريق إدراج RNA منافس، والحد من تركيز البروتين، أو تقليل وقت الحضانة. وبالتالي، فإن الاعتبارات الدقيقة وتحسين هذه البارامترات يمكن أن يؤثرا على نتائج بروتوكول SELEX.
وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من الاختلافات أو التعديلات في بروتوكول SELEX الأصلي الذي تغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. وتشمل هذه عالية الإنتاجية-SELEX (HT-SELEX)، الذي يجمع بين SELEX وتسلسل موازية على نطاق واسع6، RNAcompete، والذي ينطوي على الحضانة مع الحمض النووي الريبي غير العشوائي الزائد، وسحب إلى أسفل من RNA ملزمة، ووضع العلامات الفلورسنت من RNA، والتحليل على microarrays5, RNA Bind-n-Seq, الذي يجمع بين تحليل تقارب الحمض النووي الريبي في الأزياء الكمية والإنتاجية العالية22, وRAPID-SELEX, الذي يقصر العملية ويشمل خطوة غير تضخيم23.
وقد استخدمت قواعد المعدلة كيميائيا لتوسيع ذخيرة جزيئات الحمض النووي الريبي لتطبيقات محددة24. التشخيص، والعلاج، فضلا عن الجزيئات مع الأنشطة الحفازة هي من بين العديد من التطبيقات (بما في ذلك في الطب) من الجزيئات المختارة25. Aptamers تكمل البروتوكولات القائمة على الأجسام المضادة وتوفير أدوات ممتازة التي إمكاناتها، على سبيل المثال، في التشخيص، والعلاج، وغيرها من التطبيقات، لا يزال يتعين استغلالها بالكامل26،27،28. في المستقبل، على سبيل المثال، الفوائد السريرية هي من بين العديد من التطبيقات المطلوبة، أبعد من ما يمكن أن تقدم أول aptamer وافقت إدارة الأغذية والعقاقير (الصوديوم Pegaptanib) للانحطاط البقعي المرتبط بالعمر. التكنولوجيا البروتوميك القابلة للتحجيم لقياسات البروتين تقدم خطوة نحو فهم الصحة والأمراض24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحب البلاغ أنه ليس له مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويشكر صاحب البلاغ المعاهد الوطنية للصحة على تمويلها السابق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
