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Genetics

विनियामक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ्स्स्स के लिए बाइंडिंग साइट्स की पहचान करने के लिए अनुक्रम स्थान की खोज

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59635
Automatic Translation
1
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

Summary

अनुक्रम विशिष्टता जीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है. नियामक प्रोटीन है कि विशिष्ट दृश्यों को पहचान जीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. ऐसे प्रोटीन के लिए कार्यात्मक बाध्यकारी साइटों को परिभाषित करना एक चुनौतीपूर्ण जैविक समस्या है। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के लिए बाइंडिंग साइट की पहचान के लिए एक पुनरावर्ती दृष्टिकोण का वर्णन यहाँ किया गया है और यह सभी आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीनों पर लागू होता है।

Abstract

जीन विनियमन सभी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. ट्रांसक्रिप्शनल, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल (या आरएनए प्रोसेसिंग), ट्रांसलेशनल, और पोस्ट-ट्रांसलेशनल स्टेप्स का उपयोग विशिष्ट जीनों को विनियमित करने के लिए किया जाता है। अनुक्रम-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन स्थानिक या अस्थायी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए विशिष्ट दृश्यों को लक्षित करते हैं। न्यूक्लिक एसिड में बाध्यकारी साइटों आम तौर पर उत्परिवर्तन विश्लेषण की विशेषता है. हालांकि, ब्याज की कई प्रोटीन ऐसी विशेषता के लिए कोई ज्ञात बाध्यकारी साइट है. यहाँ हम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन. यह पुनरावर्ती चयन और एक यादृच्छिक अनुक्रम पूल के साथ शुरू दृश्यों के प्रवर्धन शामिल है. इन चरणों-ट्रांसक्रिप्शन, बाइंडिंग, और प्रवर्धन के कई दौरों के बाद समृद्ध अनुक्रम एक पसंदीदा बाइंडिंग साइट (ओं) की पहचान करने के लिए अनुक्रम हैं। इस दृष्टिकोण की सफलता इन विट्रो बाइंडिंग परख का उपयोग कर नजर रखी है. बाद में, इन विट्रो और विवो कार्यात्मक परख में चयनित दृश्यों की जैविक प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की पहचान और किसी भी आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइट (ओं) की विशेषता की अनुमति देता है जिसके लिए एक परख प्रोटीन बाध्य और असीमित RNAs अलग मौजूद है.

Introduction

कोशिका जीव विज्ञान में, जीन विनियमन एक केंद्रीय भूमिका निभाता है. जीन अभिव्यक्ति मार्ग के साथ एक या कई चरणों में, जीन को विनियमित करने की क्षमता है. इन चरणों में प्रतिलेखन (प्रारंभ, दीर्घीकरण, और समाप्ति) के साथ-साथ स्पेलिंग, पॉलीएडेनिएशन या 3' अंत गठन, आरएनए निर्यात, एमआरएनए अनुवाद, और प्राथमिक प्रतिलिपि के क्षय/स्थानीकरण शामिल हैं। इन चरणों में, न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन जीन विनियमन modulate. ऐसे प्रोटीन के लिए बाध्यकारी स्थलों की पहचान जीन नियंत्रण के अध्ययन का एक महत्वपूर्ण पहलू है। उत्परिवर्तनी विश्लेषण और जातिवृत् तीय अनुक्रम तुलना का उपयोग न्यूक्लिक अम्लों में नियामक अनुक्रमों या प्रोटीन-बाइंडिंग स्थलों की खोज करने के लिए किया गया है, जैसे प्रमोटर, जोड़ साइटें, पॉलीडेनिएनेशन तत्व, और अनुवादात्मक संकेत1, २ , 3 , 4.

पूर्व MRNA splicing जीन अभिव्यक्ति और विनियमन के दौरान एक अभिन्न कदम है. स्तनधारी जीनों के अधिकांश जीन, जिनमें मनुष्य भी शामिल हैं, में अंतर्ओं है। इन प्रतिलिपियों का एक बड़ा अंश वैकल्पिक रूप से spliced है, एक ही जीन या प्राथमिक प्रतिलिपि से कई MRNA और प्रोटीन isoforms का उत्पादन. इन आइसोफॉर्म्स में सेल जीव विज्ञान में कोशिका-विशिष्ट और विकासात्मक भूमिकाएं होती हैं। 5' जोड़ साइट, शाखा बिंदु, और polypyrimidine-tract/3' जोड़ साइट महत्वपूर्ण splicing संकेत है कि विनियमन के अधीन हैं. नकारात्मक विनियमन में, एक अन्यथा मजबूत जोड़ साइट दमित है, जबकि सकारात्मक विनियमन में एक अन्यथा कमजोर जोड़ साइट सक्रिय है. इन घटनाओं का एक संयोजन कार्यात्मक अलग आइसोफॉर्म्स की एक बहुतायत पैदा करता है। आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन इन वैकल्पिक splicing घटनाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं.

अनेक प्रोटीन ज्ञात होते हैं जिनके बंधनस्थल या आरएनए लक्ष्य ों की पहचान5,6होती है . नियामक प्रोटीन को उनके डाउनस्ट्रीम जैविक लक्ष्यों या दृश्यों से जोड़ना अक्सर एक जटिल प्रक्रिया है। ऐसे प्रोटीन के लिए, उनके लक्ष्य आरएनए या बाध्यकारी स्थल की पहचान उनके जैविक कार्यों को परिभाषित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। एक बार एक बाध्यकारी साइट की पहचान की है, यह आगे मानक आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग कर विशेषता जा सकता है.

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण दो फायदे हैं. सबसे पहले, यह ब्याज की एक प्रोटीन के लिए एक पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइट की पहचान कर सकते हैं. दूसरा, इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह एक साथ संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है, जो अन्यथा श्रम गहन बाध्यकारी साइट के भीतर अनुक्रम आवश्यकताओं के बारे में तुलनीय जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जाएगा. इस प्रकार, यह आरएनए में प्रोटीन बाइंडिंग साइटों की पहचान करने के लिए एक तेज, आसान और कम महंगा उपकरण प्रदान करता है। मूल रूप से, इस दृष्टिकोण (सेलेक्स या EXponential संवर्धन द्वारा Ligands के व्यवस्थित विकास) बैक्टीरियोफेज T4 डीएनए पॉलिमरेज (जीन 43 प्रोटीन) के लिए बाध्यकारी साइट की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो अपने MRNA में ribosome बाध्यकारी साइट के साथ ओवरलैप. बाइंडिंग साइट विश्लेषण7के लिए 65,536 यादृच्छिक वेरिएंट का प्रतिनिधित्व करने वाले एक 8-आधार लूप अनुक्रम है। दूसरा, दृष्टिकोण भी स्वतंत्र रूप से दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि विशिष्ट बाइंडिंग साइटों या विभिन्न रंगों के लिए aptamers लगभग 1013 दृश्यों8के एक पूल से चुना जा सकता है. वास्तव में, इस दृष्टिकोण का व्यापक रूप से कई अलग-अलग संदर्भों में उपयोग किया गया है ताकि कई लिगन्डों, जैसे प्रोटीन, छोटे अणुओं, और कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए aptamers (RNA या DNA अनुक्रमों) की पहचान की जा सके, और उत्प्रेरक9के लिए। एक उदाहरण के रूप में, एक aptamer दो जिंक डेरिवेटिव, कैफीन और theophylline के बीच भेदभाव कर सकते हैं, जो कैफीन में एक मिथाइल समूह की उपस्थिति से अलग10. हम बड़े पैमाने पर इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है (SELEX या पुनरावृत्तचयन-प्रवर्धन) अध्ययन करने के लिए कैसे आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन splicing या splicing विनियमन11में कार्य करते हैं, जो नीचे चर्चा के लिए आधार होगा.

यादृच्छिक पुस्तकालय: हम 31 न्यूक्लियोटाइड्स की एक यादृच्छिक पुस्तकालय का इस्तेमाल किया. यादृच्छिक पुस्तकालय के लिए लंबाई विचार ढीला विचार है कि सामान्य splicing कारक U2AF65 शाखा बिंदु अनुक्रम और 3' splice साइट के बीच एक अनुक्रम के लिए बाइंड कर देता है पर आधारित था. औसत पर, मेटाज़ोअन में इन स्पेलिंग संकेतों के बीच रिक्ति 20 से 40 न्यूक्लिओटाइड की श्रेणी में है। एक और प्रोटीन सेक्स-घातक अपने लक्ष्य पूर्व mRNA, ट्रांसफार्मरके 3' splice साइट के पास एक खराब विशेषता नियामक अनुक्रम के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता था। इस प्रकार, हम 31 न्यूक्लिओटाइड के एक यादृच्छिक क्षेत्र चुना, प्रतिबंध एंजाइम साइटों के साथ प्राइमर बाध्यकारी साइटों द्वारा flanked पीसीआर प्रवर्धन और T7 आरएनए बहुलक प्रवर्तक के लगाव के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए अनुमति देते हैं. सैद्धांतिक पुस्तकालय का आकार या जटिलता 431 या लगभग 1018थी . हमने नीचे वर्णित प्रयोगों के लिए अपने यादृच्छिक आरएनए पूल ($1012-1015)को तैयार करने के लिए इस पुस्तकालय के एक छोटे से अंश का उपयोग किया।

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Protocol

नोट: चित्र 1 पुनरावर्ती चयन-प्रवर्धन (SELEX) प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों का सारांश प्रदान करता है।

1. एक यादृच्छिक पुस्तकालय टेम्पलेट का उत्पादन

  1. आगे प्राइमर 5'- GTAATACGACTATATGGGTGATCAGATTCTGATCA-3' और रिवर्स प्राइमर 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' एक डीएनए सिंथेसाइज़र पर रासायनिक संश्लेषण द्वारा संश्लेषित करें।
    नोट: प्राइमर और यादृच्छिक पुस्तकालय व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है.
  2. एक यादृच्छिक पुस्तकालय ओलिगोन्यूक्लिओटाइड टेम्पलेट 5'- GGTGATCAGATCTGATGATCCA (एन1... एन31)TGAAGCTTGGATCCCGCGCC-3' रासायनिक संश्लेषण द्वारा। संश्लेषण के दौरान ऊपर दिए गए 31 यादृच्छिक स्थितियों के लिए संश्लेषण के दौरान चार फॉस्फोरामिटाइट्स के समतुल्य मिश्रण का उपयोग की जाइए।
    नोट: पुस्तकालय टेम्पलेट के अनुक्रम 31 यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड (N1 N31 के लिए) और आगे और रिवर्स प्राइमर की बाध्यकारी के लिए flanking अनुक्रम शामिल हैं। आगे प्राइमर में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए टी 7 आरएनए पॉलिमरेज प्रमोटर अनुक्रम (अंडरलाइन्ड) और क्लोनिंग के लिए एक प्रतिबंध साइट Bcl1 (इटैलिक) शामिल है। रिवर्स प्राइमर में क्लोनिंग की सुविधा के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइटें BamH1 और HindIII (इलेलाइजाइज़्ड) शामिल हैं।

2. डीएनए यादृच्छिक पुस्तकालय पूल का उत्पादन

  1. T7 RNA polymerase प्रमोटर को पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा पुस्तकालय में संलग्न करें जिसमें 1 $M डीएनए यादृच्छिक पुस्तकालय टेम्पलेट, प्रत्येक प्राइमर का 1 $M, 20 एम एम ट्राइस (पीएच 8.0), 1.5 एमएम एमजीसीएल2, 50 एमएम केसीएल, 0.1 ग्राम/ /c1] पॉलिमरेज, और 200 डिग्री एम प्रत्येक dNTPs (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deoxycytidine, और deoxythymidine triphosphate).
  2. पीसीआर के विकृतीकरण, अनीलन, और विस्तार चरणों (94 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 53 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करें और इसके बाद विस्तार का एक चक्र (72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए)।

3. पूल 0 आरएनए का संश्लेषण

  1. 100 डिग्री सेल्सियस प्रतिलेखन प्रतिक्रिया12की स्थापना करें. मिक्स T7 प्रतिलेखन बफर, 1 $M यादृच्छिक पुस्तकालय पूल डीएनए, 5 एमएम dithiothreitol (DTT), 2 m guanosine ट्राइफॉस्फेट (GTP), 1 एम एम प्रत्येक एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट (सीटीपी), और यूरिन ट्राइफॉस्फेट (यूटीपी), और 2 इकाइयों /
    नोट: आरएनए T7 या SP6 आरएनए पॉलिमरेज के एक विकल्प के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर इन विट्रो में लिखा जा सकता है।
  2. उपरोक्त अभिक्रिया मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इनक्यूबेट करें।
  3. जेल शुद्ध आरएनए एक 10% denaturing polyacrylamide जेल में.
  4. ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में रेडियोधर्मिता (0.5 डिग्री सेल्सियस या उससे कम $32पी यूटीपी) के निशान सहित इसे मेथिलीन ब्लू या ऑटोरेडियोग्राफी के साथ दाग द्वारा जेल पर प्रतिलिपि के स्थान की पहचान करें।
    1. एक centrifuge ट्यूब में जेल टुकड़ा प्लेस और छोटे टुकड़ों में तोड़, उदाहरण के लिए, एक homogenizer टिप के साथ. जेल के टुकड़ों को विसर्जित करने के लिए प्रोटीने के (पीके) बफर (100 एमएम ट्राइस, पीएच 7.5, 150 एमएम नैकल, 12.5 एमएम एड्टा, 1% सोडियम डोडिसिल सल्फेट) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 ज से रात भर के लिए एक nutator पर ट्यूब छोड़ दें.
  5. जेल मलबे को हटाने और बफर समाधान को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक उच्च गति microcentrifuge (14,000 आरपीएम या 16,873 x ग्राम) में स्पिन।
  6. एक समान मात्रा के साथ फिनोल-क्लोरोफॉर्म और क्लोरोफॉर्म के साथ एक बार नमूने को दो बार भंवर।
  7. ऊपर से जलीय चरण को सोडियम एसीटेट (3.0 एम, पीएच 5-2), tRNA के 10 डिग्री ग्राम या ग्लाइकोजन का 20 डिग्री ग्राम, और इथेनॉल (2-3 वॉल्यूम, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के साथ मिलाएं। 1 ज के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब छोड़ दें।
  8. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज (14,000 आरपीएम या 16,873 ग ह) में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए विलयन युक्त ट्यूबों को स्पिन करें। सुपरनेंट को सावधानी से छोड़ दें। 70% इथेनॉल के साथ आरएनए गोली कुल्ला और 2-5 मिनट के लिए स्पिन. Aspirate इथेनॉल ध्यान से. वायु आरएनए गोली सूखी.
  9. डाइएथिल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के साथ उपचारित 50 डिग्री सेल्सियस जल में आरएनए गोली को सोलुबिलाइज़ करें। भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना छोड़ दें।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पिन कॉलम का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें, जो वर्तमान में अधिक सामान्यतः unincorporated रेडियोधर्मिता को दूर करने और आरएनए शोधन के लिए एक त्वरित और अधिक सुविधाजनक विकल्प के रूप में सेवा करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    चेतावनी: रेडियोधर्मिता से बचाने के लिए एक एक्रिलिक ग्लास शील्ड, दस्ताने, और अन्य सावधानियों का उपयोग करें।

4. प्रोटीन बाइंडिंग प्रतिक्रिया और बाध्य आरएनए की जुदाई

  1. प्रोटीन और आरएनए की बाइंडिंग को 10 एमएम ट्रास-एचसीएल में ले जाना, इन अंतिम सांद्रता में निम्नलिखित अवयवों को जोड़कर 100 डिग्री सेल्सियस की मात्रा में पीएच 7.5: 50 एम एम केसीएल, 1 एम एम डी टी टी, 0.09 ग्राम ,जी 0.जी.जी., 0.5 यूनिट/ , 1 एमएम EDTA, और उपयुक्त रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के 30 डिग्री एल (PTB) एकाग्रता. उपयुक्त पूल से आरएनए जोड़ें।
    नोट: splicing कारक U2AF65 आम तौर पर polypyrimidine-tract/3' एक बाध्यकारी समानता के साथ मॉडल introns के जोड़ साइटों के लिए बांधता है (समानता वियोजन स्थिरांक या Kd) लगभग 1-10 nM की. इसलिए, बाइंडिंग के पहले दो दौर में प्रोटीन सांद्रता का उपयोग किया गया 10 गुना U2AF65के लिए Kघ से ऊपर; SXL और PTB प्रोटीन के लिए, इस रेंज में शुरू एकाग्रता केवल हमारा सबसे अच्छा अनुमान था. यह सुनिश्चित किया है कि वांछित आरएनए प्रजातियों कि बाँध सकता है, हालांकि कम आत्मीयता दृश्यों भी संभावित बाध्य. राउंड में 3 और 4 (ट्रांसक्रिप्शन, बाइंडिंग, और प्रवर्धन), प्रोटीन एकाग्रता तीन गुना कम किया गया था (चरण 4.1). यह लगातार कम आत्मीयता आरएनए प्रजातियों को खत्म करने के लिए किया गया था।
  2. एक तापमान ब्लॉक (या बर्फ पर) में 25 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट के लिए बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं युक्त ट्यूब रखें।
  3. निम्नलिखित चरणों का उपयोग करते हुए चयन-प्रवर्धन के पहले 4 दौर के लिए अनबाउंड आरएनए से बाउंड आरएनए को अलग करें।
    1. एक निर्वात कई गुना से जुड़ी एक नाइट्रोसेलुलोस फिल्टर के माध्यम से कमरे के तापमान पर नमूना (100 डिग्री सेल्सियस) फ़िल्टर करें।
      नोट: आरएनए प्रोटीन परिसर है, लेकिन नहीं असीमित आरएनए, फिल्टर पर रहता है.
    2. एक बाँझ उस्तरा ब्लेड के साथ टुकड़े में बनाए रखा आरएनए के साथ फिल्टर काट; इन्हें अपकेंद्रित्र नली में डालें। प्रोटीने के (पीके) बफर में डूबे फिल्टर टुकड़ों के साथ कम से कम 3 ज (या रात भर) के लिए धीरे से ट्यूब को टटोलकर आरएनए को पुनर्प्राप्त करें।
    3. इसे फीनॉल-क्लोरोफॉर्म (1:1) और फिर क्लोरोफॉर्म के बराबर मात्रा की उपस्थिति में भंवर बनाकर आरएनए नमूने को विप्रोटीनीकृत करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए उच्च गति पर नमूने centrifuging द्वारा हर बार जलीय चरण पुनर्प्राप्त करें।
    4. इसे सोडियम एसीटेट (0.1 आयतन 3ण्0 एम, पीएच 5.2) और इथेनॉल (2-3 वॉल्यूम ्सक्ट ऑफ निरपेक्ष इथेनॉल, 200 प्रूफ) के साथ मिलाएं। 30 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब छोड़ दो, यह 10 मिनट के लिए उच्च गति से centrifuge, और, धोने और सुखाने कदम (कदम 3.8) के बाद, DEPC के साथ इलाज पानी में आरएनए solubilize. इन चरणों के ऊपर उल्लिखित हैं (चरण 3.6 से 3.9)।
  4. प्रोटीन-बाउंड आरएनए को पिछले 2 राउंड (गोलों 5 और 6; प्रतिलेखन, बाइंडिंग, और प्रवर्धन) के लिए असीमित भिन्नों से अलग करें। बाध्यकारी प्रतिक्रिया में प्रोटीन एकाग्रता को कम (चरण 4.1) उच्च-एफ़िनिटी बाइंडिंग दृश्यों को समृद्ध करने के लिए अतिरिक्त चयन दबाव के लिए आगे तीन गुना द्वारा और अधिमानी रूप से कम-एफ़िनिटी दृश्यों को हटा दें।
    1. पूर्व कास्ट एक देशी polyacrylamide जेल (5% के साथ 60:1 acrylamide:bis-acrylamide अनुपात) 0.5x TBE बफर में (Tris-Borate-EDTA) ऊपर आरएनए की स्थापना से पहले: प्रोटीन बाध्यकारी (चरण 4.1) प्रतिक्रिया. इलेक्ट्रोफोरीज़ इस जेल को ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में 15 मिनट के लिए 250 वी लागू करके।
    2. पिपेट उपआरए:प्रोटीन बाइंडिंग प्रतिक्रियाओं (चरण 4.1) इस जेल के विभिन्न कुओं में.
      नोट: प्रोटीन -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है और 20 एम एम 4-(2-हाइड्रोक्सीएथिल) पिपराज़ीन-1-एथेनेसल्फोनिक एसिड (HEPES), पीएच 8.0, 20% ग्लिसरोल, 0.2 एम एम एथिलीनमाइनेट्राएस्टिक एसिड (EDTA), 0.05%-एनपीआईटी(, और 1 एमडीइट (डीइट) में उपयोग करने से पहले पतला किया जाता है। 0.5-1.0 एमएम प्रोटीज अवरोधक फेनिलमेथेन सल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) के अलावा वैकल्पिक है। बाध्यकारी प्रतिक्रिया में, इस बफर के बारे में योगदान देता है 6% ग्लिसरोल, जो उन्हें एक अलग जेल लोड बफर के साथ मिश्रण के लिए आवश्यकता के बिना कुओं में नमूनों की सीधी लोडिंग की अनुमति देता है.
    3. एक ठंडे कमरे में जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग करके असीम आरएनए से बाउंड आरएनए को 1 से 2 ज के लिए 250 ट पर 250 ट पर अलग करें। इस प्रक्रिया को जेल गतिशीलता पारी परख के रूप में भी जाना जाता है।
      नोट: इलेक्ट्रोफोरोसिस की अवधि आरएनए और बाध्यकारी के लिए इस्तेमाल प्रोटीन की सुविधाओं के आधार पर भिन्न होता है।
    4. एक एक्स-रे फिल्म के लिए जेल का पर्दाफाश और autoradiography का उपयोग कर बाध्य आरएनए के स्थान की पहचान। बाध्य आरएनए के साथ जेल टुकड़ा बाहर कट और यह एक ट्यूब में डालें.
    5. पीके बफर में कुचल जेल टुकड़ा इनक्यूबेट 3 एच या रात भर के लिए elution के लिए इस्तेमाल किया।
    6. ऊपर दिए गए 3.5 से 3.9 चरणों को दोहराएँ. संक्षेप में, एल्यूटेड आरएनए नमूना जोरदार पहले फीनॉल-क्लोरोफॉर्म के साथ और फिर क्लोरोफॉर्म के साथ भंवर।
    7. क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बाद जलीय चरण के साथ सोडियम एसीटेट और इथेनॉल मिलाएं। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऊष्मायन के बाद, आरएनए गोली इकट्ठा करने के लिए 5-10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन। एथेनॉल के साथ आरएनए गोली धो लें और ट्यूब के ढक्कन खुला छोड़ कर इसे सूखी। डीईपीसी के साथ उपचारित पानी में आरएनए को भंग करें।
      नोट: भिन्नीकरण के लिए जेल गतिशीलता बदलाव परख के लिए स्विचन अवांछित आरएनए प्रजातियों है कि बाध्यकारी के लिए समृद्ध किया गया है हो सकता है के उन्मूलन की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, यहाँ नाइट्रोसेलुलोस फिल्टर करने के लिए (या किसी भी मैट्रिक्स) भिन्नीकरण के लिए प्रारंभिक दौर में इस्तेमाल किया.

5. रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर प्रवर्धन

  1. भंग आरएनए से cDNA को रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग करके और रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया (2 10x आरटी बफर का एल, एएमवी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का 2 डिग्री एल, 1 डिग्री एम रिवर्स प्राइमर, आरएनए के 10 डिग्री एल, आरनेस अवरोधक वैकल्पिक) 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए।
  2. चरण 2.1 में वर्णित के रूप में 20-25 PCR चक्र का उपयोग कर cDNA बढ़ाना.

6. ट्रांसक्रिप्शन और प्रोटीन बाइंडिंग

  1. आरएनए संश्लेषण की प्रक्रिया को दोहराएँ, प्रोटीन बंधन, प्रोटीन बाध्य और असीम अंश की जुदाई, जैसा कि ऊपर खंड 3-5 में वर्णित है।

7. आरएनए प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण

  1. जेल गतिशीलता पारी परख का उपयोग करें (चरण 4.4) या फिल्टर बाइंडिंग परख (चरण 4.3) प्रत्येक पूल के भीतर चयनित पूल या अलग-अलग दृश्यों के लिए बाध्यकारी समानता और विशिष्टता निर्धारित करने के लिए (चरण 8.3 देखें)।
  2. आबद्ध अंश और असीमित अंश में बैंड का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए ऑटोरेडियोग्राफी या फॉस्फोर इमेजर का उपयोग करें।

8. क्लोनिंग और अनुक्रमण

  1. 1-2 एच के लिए प्रतिबंध एंजाइमों Bcl1 और HindIII के साथ अंतिम पीसीआर डीएनए उत्पाद डाइजेस्ट, उचित रूप से पचा pGEM3 या अन्य प्लाज्मिड के साथ ligate 2 एच से रात भर के लिए प्रतिबंध साइटों ले जाने, सक्षम जीवाणु कोशिकाओं में लिगेशन उत्पाद को बदलने द्वारा गर्मी सदमे या विद्युत poration मानक आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं का उपयोग कर13.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर लूरिया-Bertani (एलबी) मध्यम और एम्पसिलिन (50 डिग्री जी/एमएल) के साथ आगर प्लेटों पर परिवर्तित कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा रात भर बैक्टीरिया बढ़ो। एम्पिसिलिन के साथ एलबी तरल माध्यम युक्त संस्कृति ट्यूबों को टीका करने के लिए कालोनियों को चुनें और रात भर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित होते हैं। शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए जिसमें डीएनए सम्मिलित होता है, एक मानक प्लाज़्मिड आइसोलेशन प्रोटोकॉल13का उपयोग करता है .
    नोट: वाणिज्यिक किट प्लाज्मिड शोधन के लिए उपलब्ध हैं.
  3. 14 अनुक्रमण के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, डिजोक्सी श्रृंखलासमाप्ति अनुक्रमण प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए आवेषण के साथ प्लाज्मिड अनुक्रम।
    नोट: अनुक्रमण घर में किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से किया.

9. अनुक्रम संरेखण

  1. दृश्यों को संरेखित करें और उपलब्ध ऑनलाइन संरेखण उपकरणों का उपयोग करके एक आम सहमति बाइंडिंग साइट (साइट(s) प्राप्त करें
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)।

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Representative Results

निम्न अवलोकन सफल चयन-प्रवर्धन (SELEX) प्रदर्शित करता है। सबसे पहले, हम पूल 0 और पुनरावृत्तीय चयन-प्रवर्धन दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन के लिए बाध्यकारी के लिए चयनित दृश्यों का विश्लेषण किया. चित्रा 2 से पता चलता है कि स्तनधारी polypyrimidine-ट्रैक्ट बाइंडिंग प्रोटीन (PTB) मुश्किल से पूल 0 अनुक्रम लेकिन चयनित अनुक्रम पूल के लिए उच्च संबंध के लिए बाध्यकारी का पता लगाने योग्य से पता चलता है. वहाँ मुश्किल से पता लगाने योग्य बाध्यकारी था 0 पूल जब हम के बारे में इस्तेमाल किया 300 गुना चयनित पूल के लिए इस्तेमाल की तुलना में बाध्यकारी के लिए उच्च प्रोटीन एकाग्रता. इस प्रकार, वहाँ यादृच्छिक या शुरू पूल और चयनित पूल के बीच प्रोटीन बाध्यकारी सजातीयता में कम से कम एक कई सौ गुना अंतर था. यह अवलोकन प्रायोगिक रूप से पुष्टि करता है कि यहाँ वर्णित चयन-प्रवर्धन प्रोटोकॉल सफल होता है।

दूसरा, हम चयनित पूल अनुक्रम और एक आम सहमति बाध्यकारी साइट निर्धारित किया. स्तनधारी PTB-चयनित पूल से चयनित दृश्यों के बहुमत के संरेखण से प्राप्त आम सहमति अनुक्रम था: GCCUG (Y/G)UGCYYYYYYYYYYYYYYYG(Y/G)CCC. इससे पता चलता है कि हमने अद्वितीय पाइरिमिडीन समृद्ध दृश्यों का चयन किया है जो पीटीबी11को बांधते हैं। जब हमने ड्रोसोफिला पीटीबी के आरएनए-बाइंडिंग डोमेन के लिए पुनरावृत् ति चयन-प्रवर्धन किया, तो हमने गुआनासिन द्वारा बाधित सीयू-रिच दृश्यों को समृद्ध किया। उच्च आत्मीयता दृश्यों में है कि Drosophila PTB चुना एक 84% पाइरीमिडीन समृद्ध अनुक्रम था: GCUUUCUCUCUCUCUCUCCUG. वास्तव में, यह अनुक्रम अल्फा-ट्रोपोमायोसिन इनट्रॉन में मौजूद पाइरिमिडीन समृद्ध अनुक्रम के समान है जो स्तनपायी पीटीबी15के लिए उच्च आत्मीयता के साथ बांधता है और नियंत्रित होता है। हमने आरएनए-बाध्यकारी गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए बार - बार इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग किया है और एक स्पेलिकिंग कारक11,15,16. तालिका 1 आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीनों के सफल उदाहरण दिखाता है जिसके लिए SELEX का उपयोग उनकी पसंदीदा या सर्वसम्मति बाइंडिंग साइट (ओं) की पहचान करने के लिए किया गया था।

तीसरा, एक इन विट्रो splicing परख, जो वैकल्पिक 3' जोड़ साइट पसंद पर आधारित है, अलग लेकिन ओवरलैपिंग आरएनए बाध्यकारी polypyrimidine-tract बाध्यकारी प्रोटीन की विशिष्टताओं के कार्यात्मक प्रासंगिकता से पता चलता है. जबकि एक अपस्ट्रीम 3' जोड़ साइट डिफ़ॉल्ट रूप से उपयोग किया जाता है, रिकॉमबिनेंट PTB के अलावा वैकल्पिक या डाउनस्ट्रीम 3' जोड़ साइट के सक्रियण के लिए सुराग (चित्र 3) . इसके विपरीत, रिकॉमबिनेंट hnRNP सी17 के अलावा दोनों 3' जोड़ साइटों के दमन की ओर जाता है. रिकॉमबिनेंट सामान्य splicing कारक U2AF65 के अलावा hnRNP C1-मध्यस्थ 3' जोड़ साइट दमन रिवर्स (चित्र 3) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नीचे की ओर 3' जोड़ साइट सक्रियण पर PTB-मध्यस्थ प्रभाव (डेटा नहीं दिखाया). इन प्रभावों के लिए एक सरल विवरण सामान्य जोड़ कारक U2AF65 और PTB (भी hnRNP मैं कहा जाता है) की बंधन के बीच एक सीधी प्रतियोगिता है, जो वरीयता से बांधता है और कुछ 3 ' splices साइटों को दबा, या U2AF65 के बीच और hnRNP सी, जो करने के लिए बांधता है और दोनों 3' जोड़ साइटों को दबा.

Figure 1
चित्र 1: पुनरावर्ती चयन-प्रवर्धन प्रक्रिया (SELEX) में महत्वपूर्ण चरणों का सारांश। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: PTB-बाध्यकारी RNAs का संवर्धन। बढ़ती एकाग्रता (पूर्ण त्रिकोण) पुनः संयोजक PTB के या तो radiolabeled पूल 0 आरएनए या चयन और प्रवर्धन के छह दौर के बाद प्राप्त चयनित पूल के साथ इस्तेमाल किया गया था. असीम आरएनए और आरएनए:प्रोटीन परिसर की स्थिति संकेत दिए गए हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: splice साइट स्विचन परख pyrimidine बाध्यकारी प्रोटीन की अलग बाध्यकारी विशिष्टताओं को मान्य करता है. (एक-शीर्ष) splicing सब्सट्रेट के Schematics. splicing सब्सट्रेट एक 5' जोड़ साइट और दो वैकल्पिक 3' जोड़ साइटों intron flanking शामिल हैं. आयत (खुले, क्षैतिज लाइनों के साथ, और ठोस) exons हैं और लाइन एक intron है. (ए-बॉटम) hnRNP C1 अपस्ट्रीम 3' जोड़ साइट (डाउनस्ट्रीम 3' जोड़ साइट के सक्रियण के बिना) को दबा देता है, जबकि PTB डाउनस्ट्रीम 3' splice साइट के सक्रियण की ओर जाता है। splicing सब्सट्रेट एक HeLa सेल परमाणु निकालने में incubated किया गया था. splicing उत्पादों (पक्षों पर दिखाया गया) एक प्राइमर विस्तार परख का उपयोग कर विश्लेषण किया गया18 जोड़-जंक्शन प्राइमर (तीर) के साथ, जो या तो ऊपर या बहाव 3' जोड़ साइट के लिए आम 5' splice साइट के splicing पहचान. (ख) संयोजक U2AF65 (rU2AF65) hnRNP C1 के दमनकारी प्रभाव को उलट देता है. पुनः संयोजक hnRNP C1, PTB, या rU2AF65 प्रोटीन के अलावा splicing प्रतिक्रिया करने के लिए + प्रतीकों द्वारा संकेत दिया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटीन पसंदीदा अनुक्रम(ओं)
U2AF65 यू-रिच युक्त सीएस
एसएक्सएल यू-रिच युक्त 2-4 जी एस
Ptb UCUUC-कुछ जी एस के साथ समृद्ध
एच.एन.आर.एन.पी. सी 1 यू-रिच (5-6 लंबा)
CstF64 गुजरात समृद्ध
hnRNP E1/E2 और कश्मीर सी समृद्ध
U2AF65/U2AF35 heterodimer उहाँयुआउँदै

तालिका 1: कुछ आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए पसंदीदा बाध्यकारी साइटों.

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Discussion

न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन पशु और संयंत्र के विकास के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं. SELEX प्रक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता एक परख है कि प्रोटीन बाध्य और असीम आरएनए भिन्नों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास है. सिद्धांत रूप में, इस परख एक इन विट्रो बाध्यकारी परख जैसे फिल्टर बाध्यकारी परख हो सकता है, जेल गतिशीलता पारी परख, या एक मैट्रिक्स बाध्यकारी परख19 रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के लिए, शुद्ध प्रोटीन, या प्रोटीन परिसरों. परख भी एक एंजाइमी परख जहां अग्रदूतों और उत्पादों (या मध्यवर्ती) आकार या किसी अन्य साधन20के आधार पर अलग किया जा सकता है हो सकता है.

जबकि mutagenesis व्यापक रूप से प्रोटीन के लिए बाध्यकारी साइटों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह कठिन है, और समय लेने और लंबे समय तक दृश्यों के रूप में आसानी से संतृप्ति mutagenesis के लिए अनुकूल नहीं हैं. पुनरावर्ती बाध्यकारी और प्रवर्धन दृष्टिकोण का महत्व यहाँ वर्णित है कि न केवल यह ऊपर सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने करता है, यह सबसे महत्वपूर्ण पहले अज्ञात बाध्यकारी साइटों की पहचान कर सकते हैं और के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान एक ही समय में प्रत्येक स्थिति पर न्यूक्लिओटाइड आवश्यकताओं.

पुनरावर्ती चयन-प्रवर्धन की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण विचार बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता है. आमतौर पर, चयन-प्रवर्धन के 12 से 15 दौर कार्यरत हैं और 1012 से 1015 अणुओं के अनुक्रम स्थान का नियमित रूप से नमूना लिया जा सकता है। चयन-प्रवर्धन प्रोटोकॉल की प्रगति और अंतिम सफलता को एक बाइंडिंग परख या प्रत्यक्ष अनुक्रमण का उपयोग करके मॉनीटर किया जा सकता है, जो क्रमशः मध्यवर्ती पूल में विशिष्ट दृश्यों के लिए समानता या संवर्धन की निगरानी करता है। जबकि बाध्यकारी परख पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया गया था, अगली पीढ़ी अनुक्रमण के आगमन मैनुअल Sanger अनुक्रमण14द्वारा संभव नहीं तरीके में अनुक्रम संवर्धन के विश्लेषण की अनुमति देता है.

SELEX की सफलता में एक महत्वपूर्ण कदम हर कदम पर वांछित अणुओं की गुना संवर्धन है. SELEX के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या भिन्न होती है और कई कारकों पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, यदि प्रत्येक दौर में वांछित या विशिष्ट दृश्यों की गुना-समृद्धि अधिक है, तो कम राउंड पर्याप्त होंगे। हालांकि, अगर एक परख बाध्य पूल में अवांछित दृश्यों के एक उच्च अनुपात की अनुमति देता है, अतिरिक्त दौर वांछित आरएनए दृश्यों को समृद्ध करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. तकनीक की एक सीमा या चयन-प्रवर्धन के अतिरिक्त चक्र के लिए आवश्यकता का एक अनपेक्षित परिणाम है कि मन में रखा जाना चाहिए संभावना है कि यह कलाकृतियों परिचय या इस तरह के रूप में असंबंधित गुण है कि दृश्यों को समृद्ध हो सकता है उनके बढ़ाना करने की क्षमता. अंत में, जबकि कुछ अनुप्रयोगों उच्चतम संबंध बाँधने से लाभ, अन्य उपयोगों के लिए, एक संतुलन बाध्यकारी समानता और समारोह के बीच चयन-प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान मारा जाना चाहिए क्योंकि तंग बाध्यकारी दृश्यों जरूरी नहीं हो सकता है जैविक संदर्भों में सबसे कार्यात्मक दृश्यों (जैसे, अगर एक अनुक्रम splicing के दौरान विभिन्न प्रोटीन द्वारा कई बार मान्यता प्राप्त है).

संशोधन और प्रक्रिया में सुधार करने के लिए समस्या निवारण के अलावा, नकारात्मक चयन या काउंटर चयन विशिष्टता बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसी तरह, विभिन्न विभाजन प्रोटोकॉल का उपयोग, इस तरह के फिल्टर बाध्यकारी परख के रूप में जेल गतिशीलता पारी परख के बाद, अवांछित दृश्यों है कि बाँध के संवर्धन को खत्म कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, नाइट्रोसेलुलोस फिल्टर या एक स्तंभ मैट्रिक्स21के लिए. यह देखते हुए कि प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत दोनों विशिष्ट और गैर विशिष्ट घटक है, नमक और पीएच जैसे बफर शर्तों आरएनए प्रोटीन बातचीत पर प्रभाव पड़ता है. इसके अलावा, उचित प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग मजबूत, कमजोर और गैर विशिष्ट बांधने की मशीन की अवधारण पर सीधा प्रभाव हो सकता है. चयन दबाव लगातार दौर में बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक प्रतियोगी आरएनए सहित, प्रोटीन एकाग्रता को कम करने, या ऊष्मायन के समय को कम करने. इस प्रकार, सावधान विचार और इन मापदंडों के अनुकूलन SELEX प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं.

हाल ही में, कई रूपों या मूल SELEX प्रोटोकॉल के संशोधन विकसित किया गया है जो ऊपर उल्लेख किया सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने. इनमें उच्च थ्रूपुट-सेलेक्स (एचटी-सेलेक्स) शामिल हैं, जो सेलेक्स और बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण6, आरएनए कॉम्पलेक्स को जोड़ती है, जिसमें अतिरिक्त गैर-यादृच्छिक आरएनए के साथ ऊष्मायन शामिल है, बाध्य आरएनए का पुल-डाउन, आरएनए का फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और विश्लेषण पर microarrays5, आरएनए बिंद-एन-सेक, जो एक मात्रात्मक और उच्च थ्रूपुट फैशन22में आरएनए आत्मीयता विश्लेषण को जोड़ती है, और RAPID-SELEX, जो प्रक्रिया को छोटा करता है और एक गैर-प्रवर्धन चरण23भी शामिल है।

रासायनिक रूप से संशोधित आधारों का प्रयोग आरएनए अणुओं के प्रदर्शनों को विशिष्ट अनुप्रयोगों24के लिए बढ़ाने के लिए किया गया है . निदान, चिकित्सा, साथ ही उत्प्रेरक गतिविधियों के साथ अणुओं के कई अनुप्रयोगों मेंसे एक हैं (चिकित्सा में सहित) चयनित अणुओं 25 . Aptamers एंटीबॉडी आधारित प्रोटोकॉल के पूरक हैं और उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, उदाहरण के लिए, निदान, चिकित्सा, और अन्य अनुप्रयोगों में, पूरी तरह से 26 ,27,28का पूरी तरह से शोषण किया जा करने के लिए रहता है. भविष्य में, उदाहरण के लिए, नैदानिक लाभ कई वांछित अनुप्रयोगों के बीच में हैं, क्या पहले एफडीए को मंजूरी दे दी aptamer से परे (Pegaptanib सोडियम) उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन के लिए वितरित कर सकता है. प्रोटीन मापन के लिए स्केलेबल प्रोटीओमिक प्रौद्योगिकी स्वास्थ्य और रोगों को समझने की दिशा में एक कदम प्रदान करतीहै .

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Disclosures

लेखक घोषणा करता है कि वह कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों है.

Acknowledgments

लेखक पिछले धन के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
Glass Plates Standard Standard
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
polyacrylamide gel solutions Standard Standard
Proteinase K NEB P8107S
Recombinant PTB Laboratory Preparation Not applicable
Reverse Transcriptase NEB M0277S
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films Standard Standard

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References

  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
  3. Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
  4. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  5. Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
  6. Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  9. Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
  10. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  11. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  12. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
  16. Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
  17. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
  18. Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
  19. Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
  20. Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
  21. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  22. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  23. Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
  24. Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
  25. Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
  26. Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  27. Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
  28. Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).

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Singh, R. Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59635, doi:10.3791/59635 (2019).

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