Summary
A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.
Abstract
O Regulamento genético desempenha um papel importante em todas as células. Os passos transcricional, pós-transcricional (ou processamento de RNA), translacionais e pós-translacionais são usados para regular genes específicos. As proteínas de ligação de ácidos nucleicos específicos de sequência destinam-se a sequências específicas para controlar a expressão genética espacial ou temporal. Os sítios de ligação em ácidos nucleicos são tipicamente caracterizados pela análise mutacional. Entretanto, as proteínas numerosas do interesse não têm nenhum local obrigatório conhecido para tal caracterização. Aqui nós descrevemos uma aproximação para identificar locais previamente desconhecidos da ligação para proteínas RNA-obrigatórias. Envolve a seleção iterativa e a amplificação das seqüências que começam com uma associação aleatorizada da seqüência. Após várias rodadas destes passos-transcrição, ligação e amplificação-as sequências enriquecidas são sequenciadas para identificar um local de ligação preferencial (s). O sucesso dessa abordagem é monitorado por meio de ensaios de ligação in vitro. Posteriormente, ensaios funcionais in vitro e in vivo podem ser utilizados para avaliar a relevância biológica das sequências selecionadas. Esta aproximação permite a identificação e a caracterização de um local (s) obrigatório previamente desconhecido para toda a proteína RNA-obrigatória para que um ensaio para separar RNAs proteína-ligadas e não acoplado existe.
Introduction
Na biologia celular, a regulação gênica desempenha um papel central. Em uma ou várias etapas ao longo da via de expressão gênica, os genes têm o potencial para ser regulado. Estas etapas incluem a transcrição (iniciação, alongamento, e terminação) assim como a emenda, a poliadenilação ou a formação final de 3 ', a exportação do RNA, a tradução do mRNA, e a deterioração/localização de transcritos preliminares. Nestas etapas, as proteínas de ligação ácida nucleico modulam a regulação genética. A identificação de sítios de ligação para essas proteínas é um aspecto importante do estudo do controle genético. A análise mutacional e a comparação da sequência filogenética têm sido usadas para descobrir sequências regulatórias ou sítios de ligação protéica em ácidos nucleicos, como promotores, sítios de emenda, elementos de poliadenilação e sinais translacionais1, 2. º , 3. º , a 4.
A emenda do pre-mRNA é uma etapa integral durante a expressão e a regulação do gene. A maioria dos genes mamíferos, incluindo aqueles em seres humanos, têm introns. Uma grande fração destas transcrições é alternativamente emunida, produzindo o mRNA múltiplo e as isoformas da proteína do mesmo gene ou transcrição preliminar. Essas isoformas têm funções específicas de células e de desenvolvimento na biologia celular. O 5 ' Splice site, o ramo-ponto, e o polypyrimidine-Tract/3 ' Splice site são críticos de emenda de sinais que estão sujeitos a regulamentação. No Regulamento negativo, um local de outra maneira forte da tala é reprimido, visto que no Regulamento positivo um local de outra maneira fraco da tala é ativado. Uma combinação desses eventos produz uma infinidade de isoformas funcionalmente distintas. As proteínas de ligação ao RNA desempenham papéis-chave nestes eventos alternativos de splicing.
As proteínas numerosas são conhecidas cujos os alvos do local (s) ou do RNA da ligação permanecem ser identificados5,6. Ligar as proteínas reguladoras aos seus alvos biológicos a jusante ou sequências é frequentemente um processo complexo. Para essas proteínas, a identificação de seu RNA alvo ou local de ligação é um passo importante na definição de suas funções biológicas. Uma vez que um local obrigatório é identificado, pode ser caracterizado mais mais usando análises moleculars e bioquímicas padrão.
A abordagem descrita aqui tem duas vantagens. Primeiramente, pode identificar um local previamente desconhecido da ligação para uma proteína do interesse. Em segundo lugar, uma vantagem adicional desta aproximação é que permite simultaneamente a mutagenese da saturação, que de outra maneira seria labor intensivo para obter a informação comparável sobre exigências da seqüência dentro do local obrigatório. Assim, oferece uma ferramenta mais rápida, mais fácil, e menos cara para identificar locais da ligação da proteína no RNA. Originalmente, essa abordagem (SELEX ou evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial) foi utilizada para caracterizar o local de ligação para o bacteriófago T4 DNA polymerase (Gene 43 protein), que se sobrepõe ao local de ligação Ribossome em seu próprio mRNA. O site de vinculação contém uma sequência de loop de 8-base, representando 65.536 variantes aleatórias para análise7. Em segundo lugar, a abordagem também foi usada de forma independente para mostrar que locais de ligação específicos ou aptâmeros para diferentes corantes podem ser selecionados a partir de um pool de aproximadamente 1013 sequências8. Na verdade, essa abordagem tem sido amplamente utilizada em muitos contextos diferentes para identificar aptâmeros (seqüências de RNA ou DNA) para ligar numerosos ligantes, tais como proteínas, pequenas moléculas e células, e para catálise9. Como exemplo, um aptâmeros pode discriminar entre dois derivados de xantina, cafeína e Teofilina, que diferem pela presença de um grupo metilo na cafeína10. Nós usamos extensivamente esta aproximação (Selex ou seleção-amplificação iterativo) para estudar como as proteínas RNA-obrigatórias funcionam na emenda ou na regulação de emenda11, que será a base para a discussão abaixo.
A biblioteca aleatória: nós usamos uma biblioteca aleatória de 31 nucleotides. A consideração de comprimento para a biblioteca aleatória foi vagamente baseada na idéia de que o fator de emenda geral U2AF65 vincula a uma seqüência entre a seqüência de ponto de ramificação e o site de Splice 3 '. Em média, o espaçamento entre esses sinais de splicing em metazoanos está na faixa de 20 a 40 nucleotídeos. Uma outra proteína sexo-letal era sabido para ligar a uma seqüência regulamentar mal caracterizada perto do 3 ' local da tala de seu alvo pre-mRNA, transformador. Assim, optou-se por uma região aleatória de 31 nucleotídeos, ladeada por sítios de encadernação com sítios enzimáticos de restrição para permitir a amplificação de PCR e a fixação do promotor de RNA polimerase T7 para transcrição in vitro. O tamanho ou complexidade teórico da biblioteca foi de 431 ou aproximadamente 1018. Utilizamos uma pequena fração desta biblioteca para preparar nosso pool de RNA aleatório (~ 1012-1015) para os experimentos descritos abaixo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: a Figura 1 fornece um resumo das etapas principais no processo iterativo de seleção-amplificação (Selex).
1. geração de um modelo de biblioteca aleatório
- Sintetizar o primer Forward 5 '- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ' e o primer reverso 5 '-GcgacGgatccaagcttCA-3 ' por síntese química em um sintetizador de DNA.
Nota: os primers e a biblioteca aleatória podem ser sintetizados comercialmente. - Sintetizar um modelo de oligonucleotide de biblioteca aleatória 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' por síntese química. Use uma mistura equimolar de quatro fosfatos durante a síntese para as 31 posições aleatórias mostradas acima como N.
Nota: a sequência do modelo de biblioteca contém 31 nucleotídeos aleatórios (N1 a N31) e sequências de flanqueamento para a ligação dos primers Forward e Reverse. A cartilha de avanço inclui a seqüência de promotor de RNA polimerase T7 (sublinhada) para a transcrição in vitro e um local de restrição Bcl1 (itálico) para a clonagem. A cartilha reversa contém sítios enzimáticos de restrição BamH1 e HindIII (ITALICIZED) para facilitar a clonagem.
2. geração do pool aleatório da biblioteca do ADN
- Anexar o promotor de RNA polimerase T7 à biblioteca por reacção em cadeia da polimerase (PCR) contendo 1 μM de ADN modelo de biblioteca aleatória, 1 μM de cada primer, 20 mM TRIS (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mm kcl, 0,1 μg/μL de albumina sérica de bovinos acetilados, 2 unidades de Taq < /C1 > polymerase, e 200 μm cada um de dNTPs (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deoxycytidine, e triphosphate de deoxitimidina).
- Use cinco ciclos de desnaturação, recozimento e etapas de extensão (94 ° c por 1 min, 53 ° c por 1 min e 72 ° c por 1 min) de PCR seguidos por um ciclo de extensão (72 ° c por 10 min).
3. síntese da piscina 0 RNA
- Configurar uma reacção de transcrição de 100 μL12. Mix T7 buffer de transcrição, 1 μm biblioteca aleatória piscina DNA, 5 mm ditiotreitol (DTT), 2 mm guanosina trifosfato (GTP), 1 mm cada um de adenosina trifosfato (ATP), citidina trifosfato (CTP), e uridina trifosfato (UTP), e 2 unidades/μl T7 RNA polimerase.
Nota: o RNA pode ser transcrito in vitro utilizando kits comercialmente disponíveis com uma opção do RNA polimerase T7 ou SP6. - Incubar a mistura de reacção acima num tubo de microcentrífuga durante 2 h a 37 ° c.
- O gel purificar o RNA em um gel desnaturação de 10% do poliacrilamida.
- Identifique a localização das transcrições sobre o gel, manchando-a com azul de metileno ou autoradiografia, incluindo traços de radioatividade (0,5 μL ou menos de α-32P UTP) na reação de transcrição.
- Coloque a fatia de gel em um tubo de centrífuga e quebre em pedaços menores, por exemplo, com uma ponta de homogeneizador. Adicionar proteases K (PK) tampão (100 mm Tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, 12,5 mm EDTA, 1% Dodecil sulfato de sódio) para mergulhar as peças de gel. Deixe o tubo em um pulverizador de 2 h a durante a noite na temperatura ambiente.
- Gire em um microcentrifugador de alta velocidade (14.000 rpm ou 16.873 x g) por 5 minutos na temperatura ambiente para remover os restos do gel e para recuperar a solução do amortecedor.
- Vortex a amostra duas vezes com um volume igual de fenol-clorofórmio e uma vez com clorofórmio.
- Misture a fase aquosa de cima com um décimo volume de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2), 10 μg de tRNA ou 20 μg de glicogênio, e etanol (2 – 3 volumes, armazenados a-20 ° c). Deixar os tubos a-80 ° c por 1 h.
- Gire os tubos contendo a solução por 5 – 10 min a 4 ° c em uma microcentrífuga (14.000 rpm ou 16.873 x g). Descarte o sobrenadante com cuidado. Enxague a pelota do RNA com 70% de etanol e gire por 2 – 5 min. aspirar etanol com cuidado. O ar seca a pelota do RNA.
- Solubilize a pelota do RNA em 50 μL da água tratada com do pirocarbonato do dietílico (DEPC). Deixe a amostra em-20 ° c para o armazenamento.
Nota: purify o RNA usando as colunas comercialmente disponíveis da rotação, que são usadas atualmente mais geralmente para remover a radioactividade não incorporada e para serir como uma alternativa rápida e mais conveniente para a purificação do RNA.
PRECAUÇÃO: Utilize um escudo de vidro acrílico, luvas e outras precauções para proteger da radioactividade.
4. reação de ligação à proteína e separação do RNA ligado
- Realize a ligação da proteína e do RNA em Tris-HCl de 10 milímetros, pH 7,5 em um volume de 100 μL adicionando os seguintes ingredientes a estas concentrações finais: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0, 9 μg/μL de albumina sérica bovina, 0,5 unidades/μL de Rnasina, 0,15 μg/μL de tRNA , EDTA de 1 mM e 30 μL de concentração de proteína recombinante adequada (PTB). Adicione o RNA do pool apropriado.
Nota: o fator de emenda U2AF65 liga tipicamente aos locais da tala de polypyrimidine-Tract/3 ' de íntrons modelo com uma afinidade obrigatória (constante da dissociação do equilíbrio ou Kd) de aproximadamente 1 – 10 nanômetro. Portanto, as duas primeiras rodadas de ligação utilizada concentração proteica 10 vezes acima do Kd para U2AF65; para as proteínas de SXL e de PTB, a concentração começando nesta escala era somente nossa melhor suposição. Isto assegurou que as espécies desejadas do RNA que poderiam se ligar, embora umas mais baixas seqüências da afinidade igualmente acopladas potencialmente. Nas rodadas 3 e 4 (transcrição, encadernação e amplificação), a concentração proteica foi reduzida em três vezes (etapa 4,1). Isso foi feito para eliminar sucessivamente as espécies de RNA de baixa afinidade. - Coloque os tubos contendo as reacções de ligação durante cerca de 30 min a 25 ° c num bloco de temperatura (ou no gelo).
- Fractionate o RNA acoplado do RNA não acoplado para os primeiros 4 círculos da seleção-amplificação usando as seguintes etapas.
- Filtre a amostra (100 μL) à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose anexado a um colector de vácuo.
Nota: o complexo RNA-proteína, mas não o RNA não acoplado, permanece no filtro. - Pique o filtro com o RNA retido em fragmentos com uma lâmina de barbear estéril; inseri-los em um tubo de centrífuga. Recupere o RNA por caindo o tubo delicadamente por um mínimo de 3 h (ou durante a noite) com as partes do filtro imersas no amortecedor do proteinase K (PK).
- Deproteinize a amostra do RNA vortexing a na presença de um volume igual de phenol-clorofórmio (1:1) e então do clorofórmio. Recupere a fase aquosa cada vez centrifugar a amostra na alta velocidade por 5 minutos na temperatura ambiente.
- Misture com acetato de sódio (0,1 volume de 3,0 M, pH 5,2) e etanol (2 – 3 volumes de etanol absoluto, 200 prova). Deixe o tubo em um congelador de-80 ° c por 30 minutos, centrifugue-o na alta velocidade por 10 minutos, e, seguindo as etapas de lavagem e de secagem (etapa 3,8), solubilizar o RNA na água tratada com o DEPC. Estas etapas são descritas acima (etapas 3,6 a 3,9).
- Filtre a amostra (100 μL) à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose anexado a um colector de vácuo.
- Separe as frações de RNA ligadas à proteína das frações não acopladas para as últimas 2 rodadas (rodadas 5 e 6; transcrição, encadernação e amplificação) da seguinte maneira. Reduza a concentração de proteínas na reação de ligação (etapa 4,1) por mais três vezes para a pressão de seleção adicional para enriquecer sequências de ligação de alta afinidade e remover preferencialmente sequências de baixa afinidade.
- Pre-Cast um gel nativo do poliacrilamida (5% com 60:1 acrylamide: relação do BIS-acrylamide) no amortecedor de 0.5 x TBE (Tris-borato-EDTA) antes de configurar o RNA acima: reação da proteína-ligação (etapa 4,1). Electrophorese este gel em uma sala fria (4 ° c) aplicando 250 V por 15 min.
- Pipeta o RNA acima: reações de ligação da proteína (etapa 4,1) em poços diferentes deste gel.
Nota: a proteína é armazenada a-80 ° c e diluída antes do uso em 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-etanoesulfonic Acid (HEPES), pH 8,0, 20% glicerol, 0,2 mm ácido etilenodiaminotraacético (EDTA), 0, 5% NP-40 e 1 mm ditiotreitol (DTT). A adição de 0,5 – 1,0 mM de inibidor de protease fenilmetano sulfonilo fluoreto (PMSF) é opcional. Na reação de ligação, este tampão contribui sobre o glicerol de 6%, que permite o carregamento direto das amostras nos poços sem a necessidade para misturá-los com um amortecedor separado do gel-carregamento. - Fractionate o RNA acoplado do RNA não acoplado usando a electroforese do gel em uma sala fria (4 ° c) em 250 V para 1 a 2 h. Este processo é sabido igualmente como o ensaio da mudança da mobilidade do gel.
Nota: a duração da eletroforese varia dependendo das características do RNA e da proteína usada para a ligação. - Expor o gel a uma película de raio X e identificar a posição do RNA acoplado usando o autoradiography. Corte a fatia do gel com o RNA encadernado e insira-o em um tubo.
- Incubar a fatia esmagada do gel no amortecedor do PK usado para a eluição para 3 h ou durante a noite.
- Repita as etapas 3,5 a 3,9 descritas acima. Momentaneamente, vortex a amostra eluída do RNA vigorosamente primeiramente com phenol-clorofórmio e então com clorofórmio.
- Misture o acetato de sódio e etanol com a fase aquosa após a extração de clorofórmio. Após a incubação no congelador de-80 ° c, gire em 4 ° c por 5 – 10 minutos para recolher a pelota do RNA. Lave a pelota de RNA com etanol e seque-a com ar deixando a tampa do tubo aberta. Dissolver o RNA em água tratada com DEPC.
Nota: mudar para o ensaio de deslocamento de mobilidade de gel para fraccionamento permite a eliminação de espécies de RNA indesejáveis que podem ter sido enriquecidas para ligação, por exemplo, ao filtro de nitrocelulose aqui (ou qualquer matriz) utilizado nas rodadas iniciais para fraccionamento.
5. transcrição reversa e amplificação de PCR
- Sintetizar cDNA do RNA dissolvido utilizando transcriptase reversa e a cartilha reversa ao incuar a reação de 20 μL (2 μL de tampão 10x RT, 2 μL de transcriptase reversa de AMV, primer reverso de 1 μM, 10 μL de RNA, inibidor de RNase opcional) a 42 ° c por 60 min.
- Amplificar o cDNA usando 20 – 25 ciclos de PCR conforme descrito na etapa 2,1.
6. transcrição e ligação de proteínas
- Repita o processo de síntese de RNA, ligação de proteínas, separação de proteínas ligadas e fração não acoplada, conforme descrito na seção 3 – 5 acima.
7. análise das interações RNA-proteína
- Use o ensaio de deslocamento de mobilidade de gel (etapa 4,4) ou o ensaio de ligação do filtro (etapa 4,3) para determinar a afinidade e a especificidade vinculativas para pools selecionados ou sequências individuais dentro de cada pool (consulte a etapa 8,3).
- Use autoradiografia ou um Imager de fósforo para detectar e quantificar bandas na fração acoplada e fração não acoplada.
8. clonagem e sequenciamento
- Digerir o produto final do ADN do PCR com enzimas Bcl1 e HindIII da limitação para 1 – 2 h, ligadura com o pGEM3 apropriadamente digerido ou outros plasmídeos que carreg os locais da limitação de 2 h à noite, transformam o produto da ligadura em pilhas bacterianas competentes por choque térmico ou Electroporation usando procedimentos padrão da biologia molecular13.
- Cresça as bactérias durante a noite, galvanizando as células transformadas em placas de agar com Luria-Bertani (LB) médio e ampicilina (50 μg/mL) a 37 ° c. Escolha colônias para inocular tubos de cultura contendo meio líquido LB com ampicilina e cresça a 37 ° c em uma incubadora de agitação durante a noite. Purify DNAs plasmídeo contendo inserções de DNA usando um protocolo de isolamento plasmídeo padrão13.
Nota: os kits comerciais estão disponíveis para purificação de plasmídeo. - Sequencia os plasmíos com inserções de DNA usando o protocolo de sequenciamento de terminação de cadeia método, seguindo as instruções do fabricante para sequenciamento14.
Nota: o sequenciamento pode ser realizado em casa ou feito comercialmente.
9. alinhamento da sequência
- Alinhar sequências e obter um site (s) de ligação de consenso usando ferramentas de alinhamento on-line disponíveis
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As seguintes observações demonstram a seleção-amplificação bem sucedida (SELEX). Em primeiro lugar, analisamos o pool 0 e as sequências selecionadas para ligação à proteína utilizada para a abordagem iterativa de amplificação de seleção. A Figura 2 mostra que a proteína de ligação de polipirimidina-trato de mamíferos (PTB) mostra ligação mal detectável à seqüência de 0 de pool, mas alta afinidade para o pool de sequências selecionado. Não havia ligação quase detectável para a piscina 0 quando usamos cerca de 300 vezes maior concentração de proteínas para ligação do que o utilizado para o pool selecionado. Assim, houve pelo menos uma diferença de várias centenas de vezes nas afinidades de ligação de proteínas entre o pool aleatório ou inicial e o pool selecionado. Esta observação confirma experimentalmente que o protocolo de seleção-amplificação descrito aqui é bem sucedido.
Em segundo lugar, nós sequenciamos o pool selecionado e determinou um site de ligação de consenso. A sequência de consenso obtida a partir do alinhamento da maioria das sequências selecionadas do pool selecionado com PTB de mamíferos foi: GCCUBG (Y/G) UGCYYYYCYYYG (Y/G) CCC. Isso mostra que selecionamos sequências exclusivas ricas em pirimidina que ligam o PTB11. Quando realizamos a seleção iterativa-amplificação para o domínio de ligação de RNA da Drosophila PTB, enriqueceu-se sequências ricas em UC interrompidas por guanosinas. Entre as sequências de alta afinidade que a Drosophila PTB selecionou foi uma sequência rica em pirimidina a 84%: GCUBUUCCUBCUBGUCGCCCCCCUBG. Na verdade, esta seqüência é semelhante à seqüência rica em pirimidina presente no intron alfa-tropomiosina que se liga com alta afinidade e é regulada pelo PTB de mamíferos15. Nós usamos com sucesso esta aproximação repetidamente para estudar RNA-ligando Propriedades e funções reguladores de emenda e um fator de emenda11,15,16. A tabela 1 mostra exemplos bem-sucedidos de proteínas de ligação de RNA para as quais o Selex foi usado para identificar seus sites de ligação preferencial ou de consenso.
Em terceiro lugar, um ensaio de emenda in vitro, que é baseado na alternativa 3 ' escolha do local da tala, mostra a relevância funcional de especificidades de RNA-ligação distintas mas de sobreposição de proteínas de ligação do polypyrimidine-intervalo. Considerando que um site de Splice de 3 ' a montante é usado por padrão, a adição do PTB recombinante leva à ativação do site de Splice alternativo ou downstream 3 ' (Figura 3). Ao contrário, a adição de hnRNP recombinante C17 conduz à repressão de ambos os 3 ' locais da tala. A adição do fator de emenda geral de recombinação U2AF65 inverte a repressão do local da tala de 3 ' de hnRNP C1-negociada (Figura 3) assim como o efeito PTB-negociado na ativação do local da tala do downstream 3 ' (dados não mostrados). Uma explicação simples para esses efeitos é uma competição direta entre a ligação do fator de emenda geral U2AF65 e PTB (também chamado de hnRNP I), que preferencialmente vincula e reprisa certos 3 ' emendas locais, ou entre U2AF65 e hnRNP C, que liga e reprisa ambos os 3 ' Splice sites.
Figura 1: Resumo das etapas-chave no processo iterativo de seleção-amplificação (SELEX). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: enriquecimento de RNAs de ligação de PTB. A concentração crescente (triângulos cheios) do PTB de recombinação foi usada com o RNA radiolabeled da Associação 0 ou a associação selecionada obtida depois de seis círculos da seleção e da amplificação. As posições do RNA não acoplado e do complexo do RNA: protein são indicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: o ensaio de comutação do local da tala valida especificidades de ligação distintas de proteínas de ligação à pirimidina. (A-Top) Esquemas do substrato de emenda. O substrato de emenda contém um 5 ' Splice site e dois alternativos 3 ' Splice sites flanqueando o intron. Retângulos (aberto, com linhas horizontais e sólidas) são exons e a linha é um intron. (A-Bottom) hnRNP C1 reprisa o upstream 3 ' Splice site (sem ativação do downstream 3 ' Splice site), enquanto PTB leva à ativação do downstream 3 ' Splice site. A carcaça de emenda foi incubada em um extrato nuclear da pilha de HeLa. Os produtos de emenda (mostrados nos lados) foram analisados usando um ensaio da extensão da primeira demão18 com os primers da tala-junção (setas), que reconhecem a emenda do local comum da tala 5 ' ao local de tala ascendente ou a jusante 3 '. (B) RECOMBINANTE U2AF65 (rU2AF65) inverte o efeito repressivo da hnRNP C1. A adição das proteínas recombinantes de hnRNP C1, PTB ou rU2AF65 à reação de emenda é indicada pelos símbolos +. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Proteína | Seqüência preferida (s) |
| U2AF65 | U-Rich contendo cs |
| Sxl | U-Rich contendo 2-4 GS |
| Ptb | UCUBUC-rico com alguns GS |
| hnRNP C1 | U-Rich (5-6 de comprimento) |
| CstF64 | GU-Rich |
| hnRNP E1/E2 e K | C-Rich |
| U2AF65/U2AF35 heterodímero | UUUYYYYUNUAGGU |
Tabela 1: sítios de ligação preferidos para algumas proteínas de ligação de RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As proteínas de ligação de ácidos nucleicos são importantes reguladores do desenvolvimento animal e vegetal. Um requisito fundamental para o procedimento SELEX é o desenvolvimento de um ensaio que pode ser usado para separar frações de RNA ligadas à proteína e não acopladas. Em princípio, este ensaio pode ser um ensaio de ligação in vitro, como o ensaio de ligação de filtro, o ensaio de deslocamento de mobilidade em gel ou um ensaio de ligação matricial19 para proteínas recombinantes, proteínas purificadas ou complexos proteicos. O ensaio também pode ser um ensaio enzimático onde os precursores e produtos (ou intermediários) podem ser separados com base no tamanho ou em alguns outros meios20.
Enquanto a mutagenese tem sido amplamente utilizada para caracterizar locais de ligação para proteínas, é trabalhoso, e as sequências demoradas e mais longas não são tão facilmente amativas para a mutagenese de saturação. O significado da ligação iterativa e da abordagem de amplificação descrita aqui é que não só supera algumas das limitações acima, ele pode mais importante identificar locais de ligação anteriormente desconhecidos e fornecer informações importantes sobre requisitos de nucleotídeo em cada posição ao mesmo tempo.
Uma consideração importante para o sucesso da seleção iterativa-amplificação é afinidade e especificidade vinculativas. Normalmente, 12 a 15 rodadas de seleção-amplificação são empregadas e um espaço de seqüência de 1012 para 1015 moléculas podem ser amostrados rotineiramente. O progresso e o eventual sucesso do protocolo de amplificação de seleção podem ser monitorados usando um ensaio vinculativo ou seqüenciamento direto, que monitora a afinidade ou o enriquecimento de sequências específicas em pools intermediários, respectivamente. Quando o ensaio obrigatório foi usado tradicional, o advento do seqüenciamento da próxima geração permite a análise do enriquecimento da seqüência nas maneiras não possíveis pelo sequenciamento manual14de Sanger.
Um passo crítico no sucesso do SELEX é o enriquecimento das moléculas desejadas em cada etapa. O número de ciclos necessários para SELEX varia e depende de vários fatores. Por exemplo, se o enriquecimento de dobras de sequências desejadas ou específicas for maior em cada rodada, menos rodadas será suficiente. No entanto, se um ensaio permite uma alta proporção de seqüências indesejadas no pool acoplado, rodadas adicionais se tornará necessário para enriquecer seqüências de RNA desejado. Uma limitação da técnica ou uma consequência não intencional da necessidade de ciclos adicionais de seleção-amplificação que deve ser mantido em mente é a possibilidade de que pode introduzir artefactos ou enriquecer sequências que têm propriedades não relacionadas, tais como a sua capacidade de amplificar. Finalmente, enquanto alguns aplicativos se beneficiam dos mais altos ligantes de afinidade, para outros usos, um saldo deve ser atingido durante o processo de amplificação de seleção entre afinidade de ligação e função, porque sequências de ligação mais apertadas podem não ser necessariamente as sequências mais funcionais em contextos biológicos (por exemplo, se uma sequência é reconhecida várias vezes por diferentes proteínas durante a emenda).
Entre as modificações e o Troubleshooting para melhorar o procedimento, a seleção negativa ou a seleção contrária podem ser empregadas para aumentar a especificidade. Da mesma forma, o uso de diferentes protocolos de particionamento, como o ensaio de ligação do filtro seguido pelo ensaio de mudança de mobilidade do gel, pode eliminar o enriquecimento de sequências indesejadas que ligam, por exemplo, ao filtro de nitrocelulose ou a uma matriz de coluna21. Dado que as interações proteínas-ácidos nucleicos têm componentes específicos e não específicos, as condições de tampão como o sal e o pH têm efeitos sobre as interações RNA-proteína. Além disso, o uso de concentração proteica adequada pode ter um efeito direto na retenção de ligantes fortes, fracos e não específicos. A pressão de seleção pode ser aumentada em rodadas sucessivas, por exemplo, incluindo um RNA concorrente, reduzindo a concentração proteica, ou reduzindo o tempo de incubação. Assim, considerações cuidadosas e otimizando esses parâmetros podem impactar o resultado do protocolo SELEX.
Recentemente, foram desenvolvidas muitas variações ou modificações do protocolo original SELEX que superaram algumas das limitações mencionadas acima. Estes incluem a alta taxa de transferência-SELEX (HT-SELEX), que combina SELEX e sequenciamento massivamente paralelo6, rnacompete, que envolve a incubação com o excesso de RNA não aleatório, puxar para baixo do RNA ligado, rotulagem fluorescente de RNA, e análise em Microarrays5, RNA bind-n-Seq, que combina a análise de afinidade de RNA em uma forma quantitativa e de alta taxa de transferência22, e Rapid-Selex, que encurta o processo e inclui uma etapa de não-amplificação23.
Bases quimicamente modificadas têm sido utilizadas para ampliar o repertório das moléculas de RNA para aplicações específicas24. Diagnósticos, terapêuticas, bem como moléculas com atividades catalíticas estão entre as muitas aplicações (inclusive na medicina) das moléculas selecionadas25. Os aptamers complementam protocolos baseados em anticorpos e fornecem excelentes ferramentas cujo potencial, por exemplo, em diagnósticos, terapêuticas e outras aplicações, continua a ser plenamente explorado26,27,28. No futuro, por exemplo, os benefícios clínicos estão entre as inúmeras aplicações desejadas, além do que o primeiro aptâmeros aprovado pela FDA (pegaptanib sodium) poderia entregar para a degeneração macular relacionada à idade. A tecnologia proteômica escalável para medições de proteínas oferece um passo em direção à compreensão da saúde e doenças24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O autor agradece aos institutos nacionais de saúde pelo financiamento passado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
