一种冷冻-解冻方法，用于制备奇托桑-波里（乙烯基酒精）水凝胶，无交联剂和二分释放研究

Summary

冷冻解冻法用于生产无交联剂的甲苯-聚（乙烯醇）水凝胶。对于此方法，必须考虑冻结条件（温度、周期数）和聚合物比，这可能会影响获得的水凝胶的性能和应用。

Abstract

赤酸多聚（乙烯醇）水凝胶可以通过冷冻解冻方法生产，而无需使用有毒交联剂。这些系统的应用受到其特性（例如孔隙度、灵活性、膨胀能力、药物装载和药物释放能力）的限制，这些特性取决于冻结条件以及聚合物的种类和比例。该协议描述了如何在聚合物成分的50/50 w/w%下制备来自甲酸和聚物（乙烯基醇）的水凝胶，并改变冷冻温度（-4°C，-20°C，-80°C）和冷冻解冻周期（4，5，6冷冻周期）。获得了FT-IR光谱、SEM显微图和水凝胶孔隙学数据。此外，还评估了二丁二药的膨胀能力和药物负荷和释放。SEM显微图和孔隙学的结果表明，孔隙尺寸减小，而孔隙度在较低温度下增加。在轻微的冰冻温度下，肿胀百分比较高。研究了水凝胶中二氧化二的释放。所有网络保持药物释放30小时，并已观察到，一个简单的扩散机制调节二次释放根据Korsmeyer-Peppas和Higuchi模型。

Introduction

近年来，水凝胶在生物医学领域引起了极大的兴趣，因为它们是三维网络，含水量高，柔软灵活^{，因此很容易}模仿天然组织。此外，它们不会在生理温度和pH下溶解在水介质中，但存在大肿胀^2。水凝胶可以作为组织工程支架、卫生用品、隐形眼镜和伤口敷料;因为它们可以捕获和释放活性化合物和药物，它们被用作药物输送系统^3。根据其应用，水凝胶可以由天然或合成聚合物制成，或两者兼而有之，以获得最佳特性^4。

水凝胶的特性是许多物理和化学因素的结果。在物理层面上，它们的结构和形态取决于它们的孔隙度、孔径和孔隙分布^5。在化学和分子水平上，聚合物类型、聚合物链中的亲水组含量、交联点类型和交联密度是决定膨胀能力和机械性能^{的因素6、7。}

根据形成网络的交联剂的类型，水凝胶被归类为化学水凝胶或物理水凝胶。化学水凝胶由其链之间的共价相互作用连接，通过紫外线和伽马辐照或使用交联剂^7，8形成。化学水凝胶通常具有强和耐受性，但一般来说，交联剂对细胞有毒，其去除难度大，因此应用有限。另一方面，物理水凝胶通过非共价相互作用与聚合物链的连接形成，避免使用交联剂^4、9。网络中的主要非共价相互作用是疏水性相互作用、静电力、互补和氢边界^7。

聚（乙烯醇）（PVA，图1a）是一种合成和水溶性聚合物，具有优异的机械性能和生物相容性，可以通过无冻融剂水凝胶通过冷冻解冻方法^10、11。这种聚合物在冻结¹²时，能够在其链的-OH组（晶体区）之间形成氢键的集中区。这些晶体区作为网络中的交联点，由两个事件促进：当晶体水膨胀时聚合物链的接近和PVA在冻结¹³期间从等位化到合成性PVA的变化。由于冷冻干燥，水晶体被升华，留下空隙，即水凝胶¹⁴的孔隙。为了获得性能更好的水凝胶，PVA 可以很容易地与其他聚合物结合使用。

从这个意义上说，甲氧基是一种选择，因为它是天然来源中唯一具有正电荷的生物聚合物。它通过甲壳素的脱氧乙酰化获得，它由β-1，4链接D-葡萄糖胺（脱乙酰化单位）和N-乙酰D-葡萄糖胺（乙酰化单位）^的随机组合组成（图1b）。基托桑是可生物降解的人类酶，它是生物相容性。此外，由于其阳离子性质，它可以与细胞表面的负电荷相互作用，并且这个特性已经与其抗菌活性¹⁷相关。这种聚合物易于加工;然而，它们的机械性能是不够的，一些材料被添加成具有更好特性的复合物。

考虑到甲酸和PVA的具体特性，通过冷冻解冻方法^2、18成功地制造了水凝胶，避免了有毒交联剂的使用。在甲酸-PVA水凝胶中，也形成PVA的结晶区，并相互渗透，与PVA中的_-NH2组和-OH组形成简单的氢键。最终甲酸-PVA水凝胶机械稳定，高膨胀率和低毒性，具有抗菌效果^18。但是，根据制备中使用的冻结条件（温度、时间和周期数），最终特征可能会发生变化。一些研究报告说，增加冷冻周期的数量减少肿胀程度，增加拉伸强度^19，20。为了加强网络，其他制剂，如伽马和紫外线辐射和化学交联剂已额外使用冷冻解冻制剂21，22，23。具有较高甲酸比例的氢凝胶具有较多的孔网络和高膨胀能力，但强度和热稳定性较低。在这方面，必须考虑制备条件，以获得适合其目标应用的水凝胶。

这项工作的目的是详细介绍冻结条件（冻结温度和周期数）如何影响CS-PVA水凝胶的最终特性。评估了FT-IR光谱、形态和孔隙特性和膨胀能力，以及药物装载和释放能力。在释放研究中，由于其大小适合水凝胶结构，因此用作模型药物（图1c）。

Protocol

1. 甲酸-PVA水凝胶的制备

1. 准备 2% （w/w） 千叶和 10% （w/w） PVA 解决方案。在室温下将0.2克甲釜醇溶解在10mL的0.1M CH₃COOH溶液（以前过滤）中，并在一夜之间保持连续的机械搅拌。将1克PVA溶解在10 mL蒸馏水中，在80°C搅拌1小时。
2. 使用磁性搅拌器将两种溶液1：1混合，直到在室温下均匀，并将混合物倒在培养皿上。将样品在大气压力下离开2小时，以脱气。
3. 将水凝胶冷冻至-4°C、-20°C或-80°C，进行20小时和4个周期（样品分别为CP4-4、CP4-20和CP4-80）。使用 5 或 6 个冷冻周期（样品 CP5-80 和 CP6-80）在 -80°C 冷冻另一种水凝胶 20 小时。第三个冷冻周期后，用去离子水清洗水凝胶。最后，在-46°C下冷冻干燥水凝胶48小时，并储存进一步表征（方法从²中改编）。

2. 英尺-红外特性

1. 在 ATR 模式下，在 FT-IR 光谱仪中放入一小块（1 毫米 x 2 毫米）水凝胶。以 FT-IR 光谱为 4000 至 600 cm^-1（分辨率为 2 厘米^-1且平均扫描 32 次）为例。

3. 膨胀测定

1. 从水凝胶中切出圆盘（直径 13 mm，高 10 毫米），然后称重。在50 mL的去离子水中孵育光盘，在25°C下摇动。重复三次。
2. 每 30 分钟从介质中取出样品，除迹器以消除过量的水，并称重。使用方程 1 计算膨胀程度，并使用方程 2 在24 小时计算肿胀的平衡状态。
   )
   干水凝胶的重量和湿水凝胶的重量在哪里。
   

4. 电子显微镜

1. 用薄金层（30 s 和 10 mA）在溅射涂层中覆盖一小块水凝胶。
2. 将样品放入扫描电子显微镜 （SEM） 中。在 20 kV 的真空下分析样品，并拍摄 500 倍和 1500 倍放大倍率的图像。

5. 孔隙测量

1. 将直径约 0.26 g 的直径 15 mm 的圆盘放入测粒仪（固体测粒仪，体积为 0.3660 mL 和 5.7831 mL 的茎体积）。通过汞入侵孔隙仪 （MIP） 分析孔隙度和孔隙大小。
2. 在滞后模式（侵入挤出）进行实验。测量总入侵体积 （mL/g）、总孔径 （m²/g）、孔径 （μm）、孔隙度 （%）、渗透性 （mDarcy） 和侵权度。重复两次。

6. 药物装载和释放

1. 在装货前，准备4L的15毫克/升二分法溶液，搅拌过夜。通过 UV-Vis 光谱（初始浓度）确认溶液的浓度。事实上，在6mL蒸馏水中膨胀400毫克的冻干水凝胶样品24小时。
2. 对于装载，用50 mL的二分法溶液填充烧瓶，并保持在25°C，不断搅拌。将每个膨胀的水凝胶浸入烧瓶中。
   1. 以不同时间剩余二分法溶液（2 mL）的等分，确定曲线的高原区域，例如：3、6、24、27、30 和 48 小时。24 小时后，将溶液更换为新溶液。
3. 测量每个等分252nm处的吸光度，并使用二分法的校准曲线确定溶液中二维尼的浓度。计算水凝胶中24和48小时所保留的二核酸量，作为初始和最终浓度的差异，同时考虑到总体积（56 mL）。
   1. 使用公式 3 确定封装效率 （EE）。
      
   2. 将加载的水凝胶冷冻至-80°C，在-50°C下将其冻干。
4. 对于药物释放，在25°C下将300毫克冻干二分荷载水凝胶浸入50mL的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。保持恒定搅拌。在不同时间提取 2 mL 的等分，用新鲜的介质替换以保持恒定的体积。
   1. 根据校准曲线，在 252 nm 处以分光度测定确定二分法释放的分光光。
5. 推导水凝胶中的主要药物释放机制，将第一个60%对应的药物释放数据调整到Korsmeyer-Peppas模型（方程4），以获得动力学（k）和扩散（n）常数。n值表示药物释放的机制^24，25。然后，接近 0.5 的n值与 Fickian 扩散相关，同时异常传输的值为 0.5-1.0，其中涉及扩散和松弛链，最后，1.0 值与案例 II 传输相关。
   
   1. 要确认结果，请使用 Higuchi、First 阶和零阶数学模型（公式 5 到 7），然后选择更好的拟合。
   2. 
      
      
      其中t表示释放时间、在给定时间交付的药物数量和在流程结束时交付的药物的 M₌总数量。

Representative Results

水凝胶制备
在-4°C、-20°C和-80°C下获得基托桑-PVA水凝胶，4个冷冻周期，在-80°C，通过先前报告的冷冻解冻方法^2，在-80°C下获得5和6个冷冻周期。所有水凝胶均质、半透明、灵活且耐操作。

FT-IR 特性
FT-IR光谱如图2所示。检测到七种基托桑和PVA聚合物的特征信号：在3286cm-1的PVA羟基组（-OH）的拉伸振动模式和2918cm-1拉伸振动模式-CH组26，27。以甲组结构为代表的阿米德组信号，在1652cm-1至C+O（酰胺I）的拉伸振动模式，在1560cm-1到N-H（酰胺II）的回转振动模式和1325cm-1到阿米德III28、29、30的振动。其他信号，在1418厘米^-1到C-H的回流振动模式和1086厘米^-1到C-O组的拉伸振动模式，均被检测到PVA，27，31，32。

电子显微镜
所有CS-PVA水凝胶均表现出高多孔表面（图3，从左到右），并根据制备条件观察到显著变化。在-4°C（CP4-4）制备的水凝胶比在-80°C（CP4-80）制备的水凝胶大。此外，后者似乎有一个更加多孔的网络。这种影响可能是由于在较低的温度下，水晶体的形成速度更快，许多小晶体出现并在冷冻干燥过程中被升华，留下空隙^14，33。同时，冻结周期数的影响似乎促进水凝胶CP6-80中定义和圆形孔隙（图3，从上到下）。

孔隙学
样品CP4-4、CP4-80和CP6-80呈现了更为明显的变化;为了补充形态学信息，MIP（表1）对它们进行了分析。水凝胶CP4-4和CP4-80（图3a）的比较表明，在较低的冰冻温度下，水凝胶形成了一个多孔网络，具有较高的总入侵量和较高的毛孔面积。然而，水凝胶CP6-80的渗透性比CP4-80（图3b）要小，这可能是由于它们的高抗性，这也反映在较低的总入侵量上。图3显示了这些水凝胶的不同孔径。区分了两个孔径，一个在0.3-5.0 μm之间，另一个在5.0-30μm之间。在水凝胶CP4-80和CP6-80中，与CP4-4水凝胶相比，多孔网络具有比大孔隙更多的小孔隙。这些结果与SEM显微图所观察到的结果相似，表明在较低温度下，PVA链之间的相互作用受到青睐，并形成了更多的晶体区。这样，在低温下刺激了PVA链形成晶体区。

膨胀测定
CS-PVA水凝胶的膨胀行为见图4。他们很快吸收了大量的水;在前5小时，他们保持10倍的体重，20小时后，他们保留高达15倍的重量（平衡点）。然而，在相同数量的冷冻周期下制备的水凝胶，水凝胶CP4-80在前5小时内由于用于制备其温度（-80°C）而表现出较少的膨胀能力。在不同冻结周期（CP4-80、CP5-80和CP6-80）制备的水凝胶中，在任何时候均无差异。可能，在-80°C下制备的水凝胶中观察到的肿胀能力下降是由于水凝胶网络的小孔径造成的。

药物装载和释放
为了评估CS-PVA水凝胶作为药物输送系统的能力，将抗炎药物二氯杀二药加载到网络中，随后释放。所有这些系统中的封装效率（EE）约为70%;然而，CP4-80水凝胶在73%时呈现了更轻微的EE（表2）。同时，CS-PVA水凝胶中二维尼沙的释放动力学在所有情况下都保持了约30小时。CP4-80 水凝胶释放的二氧化氢量最高（图5）。这可能是因为与其他两种水凝胶相比，这种水凝胶具有更多孔的结构。这一特性使药物的小分子很容易进入水凝胶网络，然后被释放。在CP4-80和CP6-80水凝胶之间，在释放期间没有观察到差异（图6）。任何CS-PVA水凝胶都未观察到爆裂效应，这在制药应用中是大有希望的。利用数学模型确定CS-PVA水凝胶的主要释放机制。结果被调整到不同的数学模型（表3），根据n值，发现菲克扩散主导了药物释放过程。

图 1：PVA 的化学结构 （a）、甲酸 （b） 和二维利萨尔 （c） 的化学结构请点击此处查看此图的较大版本。

图 2：FT-IR光谱的纯甲酸和PVA，以及基托桑-PVA水凝胶在不同冷冻条件下制备。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3：以1500倍放大倍率的甲酸-PVA水凝胶的SEM显微图。甲酸-PVA水凝胶的孔径分布：a）水凝胶，制备4个周期的冷冻和-4°C和-80°C。b）在-80°C和4和6个周期下制备水凝胶。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4：甲酸-PVA水凝胶的膨胀动力学：a）水凝胶，具有4个冷冻周期，b）水凝胶在-80°C下制备。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5：水凝胶CP4-4和CP4-80的二氧化氢释放配置文件（以mg （a） 和 Mt / （b） 表示.请点击此处查看此图的较大版本。

图 6：水凝胶CP4-80和CP6-80的二氧化氢释放配置文件（以mg （a） 和 Mt / （b） 表示.请点击此处查看此图的较大版本。

水 凝 胶	总入侵量（mL/g）	毛孔总面积（m2/g）	孔隙度（%）	渗透性（达西）	托托西
CP4-4	5.16	10.19	67.13	132.43	10.46
CP4-80	7.36	15.14	85.95	151.16	5.83
CP6-80	6.69	12.86	84.82	129.28	12.2

表 1：甲基-PVA水凝胶多孔结构的孔径测量参数。

样品	Diflunisal 加载		迪夫伦萨尔发布
	毫克/克水凝胶	封装效率 （%）	释放的对已加载的尊重百分比
CP4-4	3.05× 0.09	71	79 × 3.33
CP4-80	3.22 ± 0.47	73	86 × 0.4
CP6-80	3.19 ± 0.05	68	80 × 3.9

表 2：奇托桑-PVA水凝胶的封装和释放效率。

样品	科斯迈尔-佩奇			平口		第一订单		零订单
	kKP x 102	n	R2	kH x 102	R2	k1 x 102	R2	k0 x 102	R2
	（最小-n）			（最小-0.5）		（最小-1）		（最小-1）
CP4-4	4.3 ± 0.39	0.44 ± 0.02	0.99	3.1 × 0.1	0.98	0.29 × 0.03	0.803	0.18 ± 0.02	0.54
CP4-80	3.6 ± 0.33	0.50 ± 0.02	0.99	3.7 × 0.1	0.99	0.42 × 0.03	0.894	0.27 × 0.02	0.7
CP6-80	2.3 ± 0.24	0.54 ± 0.02	0.99	2.9 ± 0.1	0.99	0.27 × 0.02	0.925	0.17 ± 0.01	0.77
k= 动力学常数;n= 扩散常量。

表 3：甲酸-PVA水凝胶二维解的动力学参数。

Discussion

冷冻解冻方法是一种合适的工艺，用于制备生物相容性水凝胶，主要应用于生物医学、制药或化妆品应用34、35、36。与其他众所周知的制备水凝胶的方法相比，这种方法最重要的优点是避免使用交联剂，这可能导致炎症反应或对人体产生不良影响^34。这是一种通用的方法，因为它提供了从PVA或其混合物中制备水凝胶的可能性，用不同的聚合物^11，37，这样可以在新材料中获得其他聚合物的新特性（例如，吸收水的主要能力、抗菌或抗氧化特性^{2、18、35）。}然而，重要的是要考虑，加入其他聚合物可能会降低水凝胶^19，37的强度。

冷冻解冻方法要考虑的主要参数是冷冻温度、冻结周期的时间和次数，以及聚合物比（在聚合物混合物的情况下^{）2、19、20。}当冷冻条件得到控制时，这种方法可以获得广泛的膨胀、形态和机械特性。这些参数直接影响到甲-PVA水凝胶中的三维网络配置，因为冻结条件促进PVA链中的排列，这些链通过物理相互作用连接，称为晶体区^12，38。这些晶体区是氢键的集中区域，作为水凝胶中的交联点，维持并形成三维网络，当水凝胶处于膨胀状态^2、39、40时，它是一种缩回力。

在这项研究中，我们评估了新的冷冻温度范围（-4°C、-20°C和-80°C）与不同数量的冷冻周期（4、5和6）以及同一冻结时间（20小时）相结合的影响，制备1：1的甲酸-PVA水凝胶。在最低温度（-80 °C）观察到最低膨胀能力。事实上，在这个最低温度下的水凝胶获得了更小的孔隙和更多的多孔网络。基托桑-PVA水凝胶的这些差异对于不同的应用，如药物输送系统或支架非常有用。一般来说，由于基托桑亲水性组（-NH 2）41，42，甲酸-PVA水凝胶存在高肿胀率，由于PVA特性，它们柔软、灵活、易于处理和抵抗操纵。从这个意义上说，冷冻解冻法简便、廉价、快速，能生产出具有不同特性的甲酸 - PVA 水凝胶，避免了毒联。

冷冻解冻虽然是一种简单友好的方法，但存在一些缺点。在这种情况下，甲壳体和聚合物混合物的完全均质非常重要。水凝胶可以呈现更脆弱的区域和不规则的多孔结构。此外，在磁搅拌下，在70-80°C^42，43加热1小时，使水中PVA正确溶解。此 PVA 溶液的冷却速度必须缓慢，并不断搅拌，以防止形成稳定的 PVA 层。

对于细胞培养测定，这种方法的局限性是形成白色或半透明水凝胶。在这种情况下，甘油或DMSO（室温下有毒化合物）的应用可用于改善水凝胶^23，44的外观。制备CS-PVA水凝胶的冻融法的冻干步骤是一个关键步骤，因为水凝胶可能在中间区域出现收缩，使工作和表征复杂化。为了避免这种情况，在冻干之前，样品必须完全冷冻。关于药物加载和释放研究，确保水凝胶成分和要量化的药物的信号不受干扰是非常重要的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight	Sigma-Aldrich	448877	Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid)	Merck
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	1005706
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator	Telstar
Falcon tubes	Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy	Nicolet iS50	in ATR mode
Lyophilizator	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Scanning electron microscope	Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer	Agilent 8453