Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro ELISA Test for å evaluere Rabies vaksine styrke

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunocapture for å bestemme immungen glykoprotein innholdet i rabies vaksiner. Denne testen bruker et nøytraliserende monoklonalt antistoff (mAb-D1) som gjenkjenner glykoproteintrimmere. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for å følge konsistensen av vaksinepotens under produksjonen.

Abstract

Den økende globale bekymringen for dyrevelferden oppmuntrer produsenter og National Control Laboratories (OMCLs) til å følge 3Rs-strategien for erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtestingen. Utviklingen av in vitro tilnærminger anbefales på WHO og europeiske nivåer som alternativer til NIH-testen for evaluering av rabies vaksine styrke. Ved overflaten av rabiesviruset (RABV) partikkel utgjør trimmere av glykoprotein det store immunogen for å indusere Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). En ELISA-test, hvor nøytraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) gjenkjenner den trimeric formen av glykoproteinet, er utviklet for å bestemme innholdet i det innfødte trimericglykoproteinet sammen med produksjonen av vaksinebatchene. Denne in vitro potenstesten viste en god konkordans med NIH-testen og har blitt funnet egnet i samarbeidsstudier av RABV-vaksineprodusenter og OMCLer. Unngåelse av dyrebruk er et oppnåelig mål i nær fremtid.

Metoden som presenteres er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av mAb-D1 som gjenkjenner de antigene stedene III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein, det vil si det genene immun RABV antigen. mAb-D1 brukes til både belegg og påvisning av glykoproteintrimmer ei vaksinebatch. Siden epitopen gjenkjennes på grunn av konformasjonsegenskapene, kan det potensielt denaturert glykoprotein (mindre immunogent) ikke fanges opp og oppdages av mAb-D1. Vaksinen som skal testes inkuberes i en plate sensibilisert med mAb-D1. Bundet trimeric RABV glykoproteiner identifiseres ved å legge til mAb-D1 igjen, merket med peroksidase og deretter avslørt i nærvær av substrat og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet.

Introduction

Siden mer enn 50 år brukes NIH-testen1 som en gullstandardmetode for å evaluere rabiesvaksinens styrke før batchutgivelsen. Denne testen består av en intraperitoneal immunisering av grupper av mus med vaksinen som skal testes etterfulgt av en intra-cerebral (IC) utfordring 14 dager senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme av rabies virus (RABV). Styrken evalueres fra andelen mus som overlever IC-utfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 fortsatt krever NIH-testen for å vurdere vaksinens styrke, lider denne testen flere hindringer: resultatene er svært variable4; smittsomme RABV brukes under utfordringen, og dette krever både tekniske ferdigheter og strenge biosikkerhetstiltak; et stort antall dyr brukes, og alvorlighetsgraden av utfordringen reiser alvorlige etiske bekymringer5. En mindre alvorlig variant av denne testen er utviklet: to uker etter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke utfordret av IC, men blødde og testet for tilstedeværelse av spesifikke RABV nøytraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjelp av en in vitro nøytralisering test. Denne testen krever imidlertid fortsatt å ofre et stort antall laboratoriemus, selv om den allerede er i bruk for veterinærvaksinene6,7 og har blitt vurdert for humane vaksiner8.

Per nå oppfordrer både International9 og European10 anbefalinger produsenter og nasjonale kontrolllaboratorier (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) til å implementere erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtesting, referert til 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (gjelder siden 2013/01/01) knyttet til beskyttelse og velferd for dyr har også forsterket begrensningene for vaksineprodusenter og laboratorier som er involvert i kvalitetskontroll av rabiesvaksiner samt i rabiesforskning11. Som et resultat har utvikling, validering og bruk av alternative in vitro tilnærminger nå blitt en prioritet. Dette er ikke bare etisk forsvarlig, men kan også redusere batch testing kostnader og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uker3.

På overflaten av RABV partikkel, glykoprotein vedtar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaksine utgjør denne innfødte trimeric formen den store immunogen indusere VNAbs17 mens monomeriske, oppløselige eller denaturertglykoproteiner er dårlig immungene18,19. Dermed er bevaring av trimmere av glykoproteinet langs vaksineproduksjonsprosessen en god indikator for bevaring av et optimalt immungenpotensial. Flere immunkjemiske metoder, som antistoffbindende test20,21, den enkle radiale immundiffusjonen (SRD) test22 og ELISA-testen23,24,25,26,27 anbefales av WHO Technical Report Series2 og den europeiske monografien3 for å kvantifisere antigeninnholdet i rabiesvaksiner. Disse brukes av produsenter til å overvåke konsistensen av vaksineproduksjon og av OMCL for å vurdere den konsekvente formuleringen av grupper av humane vaksiner28, selv om NIH-testen fortsatt vurderes for styrken.

Alle disse immunkjemiske metodene er imidlertid ikke like. SRD-testen krever en forbehandling som kan endre membranforankret trimmere og resultere i en løselig eller denaturert form av glykoproteinet 22,29. Derfor er SRD ikke mye effektiv i diskriminering mellom immunogene og ikke-immungene glykoproteiner som resulterer i en ufullkommen vurdering av immunogenisiteten til en vaksinetomt. Derimot er ELISA-testen mer følsom22, bevarer den opprinnelige strukturen til glykoproteinet, og er mer hensiktsmessig å bestemme innholdet i de innfødte foldede trimmene av glykoprotein. ELISA-testen kan bruke enten kaninpolyklonale eller musmonoklonale antiglykoproteinantistoffer renset eller konsentrert med ammoniumsulfat. Studier har vist god konkordans mellom NIH-testen og antigeninnholdet evaluert av ELISA i vaksiner og konkludertmed at ELISA-metoder er egnet for in vitro potenstesten. Dette talsmenn som ELISA tester kan minst supplere eller erstatte NIH test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den europeiske pharmacopoeia bruk av validerte serologiske eller immunokjemiske analyser som alternativer til NIH-testen3. Fullstendig unngåelse av dyrebruk for vaksinestyrke har blitt et realistisk perspektiv.

Metoden nedenfor er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av en mus monoklonal antistoff klone (mAb-D1) som gjenkjenner antigene områder III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denne metoden ble utviklet i utgangspunktet ved Institut Pasteur26,30 deretter optimalisert og validert av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, det vil si den franske OMCL4,33. MAb-D1 brukes både til å sensibilisere platen og deretter for å oppdage det fangede antigenet. Dette gjør det mulig for spesifikk kvantifisering av glykoproteintrimmerne, det vil si det immunogene RABV-antigenet. MAb-D1 som brukes til deteksjon er merket med peroksidase, som avsløres i nærvær av substrat et og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet. Det er verdt å merke seg at samme type analyse kan brukes for forskjellige mAbs gjenkjenne ulike antigene steder av RABV glykoprotein35. Metoden for å skaffe og rense eller konsentrere seg med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonale kaninimmunoglobuliner G (IgG) eller monoklonale museglobuliner har blitt grundig beskrevet tidligere36 sammen med metoden for å konjugere antistoffer med peroxidase37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sikkerhetsforanstaltninger

MERK: Denne metoden gjelder for både levende RABV og inaktivert vaksine.

  1. Bruk gode prosedyrer for laboratoriepraksis og sikkerhet.
  2. Bruk tilstrekkelig personlig beskyttelsesutstyr (PVU), inkludert engangsfrakk, hansker, maske, briller osv.
  3. Når det levende viruset er titrerat, bruk et klasse II biologisk sikkerhetsskap.
    1. Vurder materiale i kontakt med prøvene (reagenser, vaskeløsninger osv.) som smittsomt materiale.
    2. Behandle forurenset materiale ved nedsenking i blekemiddeloppløsningen (2,5% av natriumhypokloritt) i 30 min for dekontaminering.
  4. Håndter kjemikalier i henhold til god laboratoriepraksis.

2. Forberedelse

  1. Bruk analytiske reagenser med analytisk karakter der det er mulig.
  2. Forbered ferske løsninger på beleggbufferen/karbonatbufferen, passivbufferen, fortynnings- og sitratbufferen (Tabell 1) filtrerer gjennom 0,45 eller 0,22 μm filtre og oppbevares ved 4 °C i én dag før bruk for å bevare sin analytiske renhet.
  3. La reagensene nå romtemperaturen (+18 °C til +25 °C) 30 min før bruk og homogeniseres ved forsiktig blanding før bruk.

3. Mikroplate sensibilisering

MERK: Bruk 96 brønnadsorpsjonsplater som er optimalisert for å binde store mengder immunglobuliner (f.eks. se Materialtabellen).

  1. Til hver brønn, tilsett 200 μL av monoklonalt antistoff (mAb-D1) fortynnet i karbonatbufferen.
    MERK: En optimal konsentrasjon på ca. 1 μg/ml er eksperimentelt bestemt og tilsvarer en omtrentlig 1/2000 fortynning av den rensede mAb-D1. Denne anbefalte konsentrasjonen er indisert for hver mAb-D1 batch og må verifiseres med jevne mellomrom med positiv kontroll.
  2. Dekk platen med en klebende film og inkuber mikroplaten i 3 timer ved 37 °C i en fuktet atmosfære.
  3. Forsiktig aspirere og overføre godt innhold til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypokloritt løsning.
  4. Vend mikroplaten og la den tørke på et adsorbent papir ved romtemperatur i 5 min.

4. Passivisering av mikroplate

  1. Til hver brønn, tilsett 300 μL av passiviseringsbufferen.
  2. Dekk platen med en klebende film og inkuber i 30 min ved 37 °C.
  3. Aspirer nøye og overfør brønninnholdet til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittoppløsning.
  4. Vend mikroplaten og la den tørke på et adsorbent papir ved romtemperatur i 1 min.
    MERK: Mikroplaten kan umiddelbart brukes eller oppbevares forseglet ved -20 °C i opptil 3 måneder til bruk.

5. ELISA analyse

MERK: For å etablere kontrollkurven for referansevaksinen, er trinn 5.3 ikke nødvendig; for å titrere den testede vaksinen alle trinn 5.1 til 5.6 er nødvendige.

  1. Vasking av den sensibiliserte mikroplaten
    1. Til hver brønn, tilsett 300 μL av vaskebufferen.
    2. Aspirer nøye og overfør brønninnholdet til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittoppløsning.
    3. Gjenta trinn 5.1.1 og 5.1.2 fem ganger til for å vaske den sensibiliserte platen i stor grad.
    4. Vend mikroplaten og la den tørke på et adsorbent papir ved romtemperatur i 1 min.
  2. Fortynninger av referansevaksinen for kontrollkurven
    1. Rekonstituer referansevaksinen (valideringsantigen Lot 09) i 1 ml destillert vann som tilsvarer en konsentrasjon på 10 μg/ml rabiesvirusglykoprotein.
    2. Forbered en ti ganger fortynning av den rekonstituerte referansevaksinen i fortynningsvannet for å nå 1 μg/ml rabiesvirusglykoprotein.
    3. Forbered 6 seriell todelte fortynninger av denne referansevaksinen i fortynningsvannet som angitt i tabell 1.
    4. Fordel 200 μL av fortynningsvannet i duplikat (brønner 1H/2H) for å fungere som en tom kontroll.
    5. Fordel 200 μL per brønn av hver referansevaksinefortynning i duplikat (brønner G1/G2 til A1/A2).
  3. Fortynninger av den testede vaksinen for titrering
    1. Forbered en ti ganger fortynning av den testede vaksinen i fortynningsstedet.
    2. Forbered 7 togangers seriefortynninger av den testede vaksinen i fortynningsvann som angitt i tabell 2.
    3. Fordel 200 μL per brønn av hver testet vaksinefortynning i duplikat (brønner H3/H4 til A3/A4).
  4. Inkubasjon/vasking av ELISA-platen
    1. Dekk mikroplaten med en klebende film og inkuber i 1 time ved 37 °C.
    2. Fjern filmen, aspirere forsiktig og overfør innholdet i hver brønn til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittløsning.
    3. Til hver brønn tilsett 300 μL vaskebuffer.
    4. Aspirer nøye og overfør innholdet i hver brønn til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittoppløsning.
    5. Gjenta trinn 5.4.3 og 5.4.4 fem ganger for å fjerne det ubundne antigenet og bevare G-proteintrimmerne som er bundet til det belagte antistoffet (mAb D1).
    6. Vend mikroplaten og la den tørke på et adsorbent papir ved romtemperatur i 1 min.
  5. Binding av peroksidasekonjugert mAb-D1
    1. Fordel 200 μL per brønn av anbefalt fortynning (1/2000) peroksidasemerket mAb-D1 i fortynningsmiddel (omtrentlig konsentrasjon på 1μg/ml). En anbefalt konsentrasjon er indisert for hver mAb-D1 batch og må periodisk verifiseres med positiv kontroll.
    2. Dekk mikroplaten med en klebende film og inkuber i 1 time ved 37 °C.
    3. Fjern filmen, aspirere forsiktig og overfør innholdet i hver brønn til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittløsning.
    4. Legg til hver brønn, 300 μL av vaskebufferen.
    5. Aspirer nøye og overfør innholdet i hver brønn til en mottaker som inneholder 2,5% natriumhypoklorittoppløsning.
    6. Gjenta trinn 5.5.4 og 5.5.5 fem ganger for å fjerne ubundet peroksidasemerket antistoff (mAb D1).
    7. Vend mikroplaten og la den tørke på et adsorbent papir ved romtemperatur i 1 min.
  6. Åpenbaring ved hjelp av et substrat-krom
    1. Fordel 200 μL per brønn av substrat-kromløsning.
    2. Forsegle mikroplaten med en film og inkuber i mørket ved romtemperatur i 30 min. En gul-oransje farge utvikler intensiteten som er proporsjonal med mengden bundet peroksidasemerket antistoff (mAb D1).
    3. Stopp reaksjonen ved å legge til 50 μL av stoppeløsning per brønn.
    4. Tørk forsiktig av bunnen av mikroplaten og plasser den i et spektrotometer for å bestemme den optiske tettheten (OD) ved 492 nm av alle brukte brønner: negativ kontroll (tom), referansevaksine og testet vaksine.
    5. Samle inn OD-data som XLS- eller XLSX-filformat for analyse.
  7. Tegn referansevaksinekurven, det trimeric glykoproteininnholdet, som en funksjon av optisk tetthet (492 nm)
    1. Beregn gjennomsnittlig OD på 492 nm for hver duplikat ved de forskjellige fortynningene av referansevaksinen (brønner G1/G2 til A1/A2 i tabell 2)
    2. Trekk gjennomsnittlig OD av Blank (brønner, H1/H2 i tabell 2) fra hver beregnet gjennomsnittlig OD.
    3. Plott de resulterende OD-verdiene på den vertikale aksen (lineær skala) og tilsvarende konsentrasjon i glykoproteintrimmer (ng/ml) på den horisontale aksen (logaritmisk skala).
    4. Tegn referansekurven ved å koble sammen punkter (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I følgende eksempel brukes referansevaksinen Lot 09, bestående av rensede inaktiverte rabiesviruspartikler (PV-vaksinestamme). Glykoproteintrimmerne (10 μg/ml) innholdet i dette er etablert etter bestemmelse av den totale mengden virusproteiner (BCA-test) og evaluering av prosentandelen av glykoproteinet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Alternativt kan en kalibrert referansevaksine, for eksempel WHO 6th International Standard (IS) for Rabies Vaccine (NIBSC-kode: 07/162), brukes.

Tabell 3 viser OD-verdiene (492 nm) for et typisk eksperiment. Ved hjelp av disse verdiene ble referansevaksinekurven tegnet ved å plotte (1) gjennomsnittlig OD (minus gjennomsnittlig OD av det tomme) ved de forskjellige fortynningene av referansevaksinen på den vertikale aksen (lineær skala); (2) konsentrasjonen av glykoproteintrimmerne (ng/ml) på den horisontale aksen (logaritmisk skala) (Figur 1).

Glykoproteininnholdet i den testede vaksinen anslås ved sammenligning med denne referansevaksinekurven. Evalueringen er nøyaktig for fortynning av den testede vaksinen som gir en gjennomsnittlig OD-verdi i den lineære delen av referansevaksinekurven. I det presenterte eksperimentet (Figur 1)er den lineære delen fra ca. 1 til 2 OD (tabell 3).

Fortynning 1/40 av den testede vaksinen, med en gjennomsnittlig OD for dupliserte prøver på 1,534, er da egnet for videre evaluering. Når denne OD er plottet horisontalt opp til skjæringspunktet med referansevaksinekurven, tilsvarer den vertikale projeksjonen på x-aksen 500 ng / ml glykoprotein. Med tanke på fortynning inneholder den testede vaksinen

40 x 500 ng/ml = 20 μg/ml trimeric glykoprotein.

For tiden er det ingen ELISA internasjonal enhet for RABV glykoproteininnhold. In vivo-styrken til referansevaksinen, i internasjonale enheter (IE/ml), er imidlertid etablert ved hjelp av NIH-testen i forhold til 6th WHO International Standard (NIBSC-koden: 07/162)4. Følgelig tillater sammenligningen av de gjennomsnittlige ODer mellom referansen og den testede vaksinen ikke bare måling av den trimeric glykoproteinmengden av den testede vaksinen, men evaluerer også in vitro-styrken som er estimert i tilsvarende internasjonal enhet (EIU/ml).

Ved hjelp av ELISA-metoden som er beskrevet her, har den franske OMCL (ANSM) overvåket glykoproteininnholdet til mer enn 1000 grupper av humanrabiesvaksine som skal frigjøres i markedet og har sammenlignet med NIH-testen utført på produsentens nettsted4. Den høye variabiliteten til NIH-testen, på grunn av heterogeniteten hos musstamme og utfordringsprosedyre38, forhindret en statistisk korrelasjon mellom de to testene. Men en konkordans i resultatprofilen og de samme pass/fail-konklusjonene ble oppnådd ved hjelp av in vitro og in vivo assays4. Denne konkordansen bekrefter at de innfødte trimmerne av glykoproteinet som er anerkjent av mAb-D134,39 utgjør de viktigste rabiesvirusimmunogen indusere VNAbs under vaksinasjon17. Disse VNAbs er i stand til å beskytte mus mot den intra-cerebrale utfordringen av NIH-testen. Til slutt er in vitro-vurderingen av rabiesglykoproteininnholdet et attraktivt alternativ til NIH-testen evaluere raties vaksinestyrke.

Buffere og reagenser Forberedelse
Buffer for belegg
(Karbonatbuffer 50m pH=9.6)		 Tilsett natriumkarbonat 50 mM (Na2CO3-10H2O) til natriumbikarbonat 50 mM (NaHCO3) til ønsket pH (ca. 1/10 volum natriumbikarbonat)
Passiviseringbuffer 0,3 % storfeserumalbumin (BSA, bksjon V), 5 % sukrose i karbonatbuffer 50 mM pH 9,6
10x fosfat bufret saltvann pH = 7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g i 1L destillert vann. Juster pH=7 med 4N NaOH
Vaskebuffer 0,05% Tween i 1x PBS
Fortynner                                                  0,5% storfe serum albumin (brøk V), 0,05% Tween i 1x PBS (juster pH til 7 på grunn av forsuring av BSA)
Citratbuffer pH-5.6
(for peroksidasesubstrat)		 11.67 g Tri-natriumsitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g sitronsyre-1H20 i 1 L destillert vann
Substrat-kromløsning 50 mg Ortho-fenylendiamintablett, 0,1 % hydrogenperoksid 30 % (110 vol) i 25 ml Citratbuffer pH 5,6
Stoppeløsning
(4N svovelsyre)		 10 ml H2SO4 36N i 80 ml avkjølt destillert vann. Fortynning må utføres i et isbad

Tabell 1. Buffere som brukes i analysen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Vaksine 1/640 Ref. Vaksine 1/640 Testet vaksine 1/1280 Testet vaksine 1/1280
B Ref. Vaksine 1/320 Ref. Vaksine 1/320 Testet vaksine 1/640 Testet vaksine 1/640
C Ref. Vaksine 1/160 Ref. Vaksine 1/160 Testet vaksine 1/320 Testet vaksine 1/320
D Ref. Vaksine 1/10 Ref. Vaksine 1/10 Testet vaksine 1/160 Testet vaksine 1/160
E Ref. Vaksine 1/40 Ref. Vaksine 1/40 Testet vaksine 1/80 Testet vaksine 1/80
F Ref. Vaksine 1/20 Ref. Vaksine 1/20 Testet vaksine 1/40 Testet vaksine 1/40
G Ref. Vaksine 1/10 Ref. Vaksine 1/10 Testet vaksine 1/20 Testet vaksine 1/20
H Tom Tom Testet vaksine 1/10 Testet vaksine 1/10
Referansevaksine Lot 09 fortynning Konsentrasjon (ng/ml)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabell 2: Mikroplateplan for rabies glykoproteintitreringsanalyse og fortynninger for referansen og testede vaksiner som brukes i analysen.

Referansevaksine Lot 09 fortynning Konsentrasjon (ng/ml) Testet vaksinefortynning OD-kolonne 1 OD-kolonne 2 OD Gjennomsnitt Referanse OD gjennomsnitt- Blank OD gjennomsnitt
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Tom Tom 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tabell 3. Resultater oppnådd ved OD492 nm for plotting av referansekurven

Figure 1
Figur 1: Referansekurve som viser det trimeric glykoproteininnholdet som funksjonen til den optiske tettheten (492 nm) for referansevaksinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitopen anerkjent av mAb-D1 ligger i det antigene området III av RABV glykoprotein som ikke bare er immunodominerende for induksjon av VNAbs, men også involvert i nevrovirulens, patogene40,41 og reseptorgjenkjenning42. Det er et annet viktig antigent sted langs glykoprotein, sted II43, mot hvilke flere MAbs har blitt isolert som mAb-WI-111235. Disse kan også brukes i lignende type eksperimenter.

En begrensning av denne in vitro metoden av ELISA bor i den nødvendige bevaring av epitopanerkjent av den brukte mAb på rabies virusstamme som skal testes. Hittil er alle de klassiske stammene som brukes til humane rabiesvaksiner anerkjent av mAb-D1. Det større mangfoldet av rabiesstammer som brukes i dyrevaksiner kan utgjøre et problem i fremtiden. Men som nevnt tidligere, kan den samme analysen brukes ved hjelp av forskjellige mAbs gjenkjenne ulike antigene steder av RABV glykoprotein for belegg og deteksjon. Dette vil tillate omgåproblemet35.

Et annet følsomt punkt i denne metoden, kvantifisere den trimeric formen av RABV glykoprotein, er den mulige effekten av pH og temperatur på reversibel konformasjonkonvertering14. Disse parametrene tas i betraktning i den foreslåtte protokollen.

Oppsummert, kvantifisering av en svært immungen epilfor korrekt foldet glykoprotein trimers av in vitro ELISA metoden vises like effektiv som NIH test for å måle kapasiteten til en vaksine batch for å indusere humoral immunitet mot rabies virusinfeksjon. I tillegg kan ELISA-metoden diskriminere subpotente vaksinetomter, i kvalitet eller i kvantitet, fra de potente4,35. Det siste trinnet før du foreslår en slik in vitro ELISA-analyse for å erstatte NIH-testen, er organiseringen av en internasjonal samarbeidsstudie for forbedring og standardisering.

Et verksted av Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) med tittelen International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, September 2010)44, konkluderte med at NIH-testen bør erstattes av en alternativ in vitro-test som evaluerte vaksineimmunogenisiteten og i stand til å diskriminere mellom potente og subpotente partier4.) Et annet verksted av European Partnership for Alternatives to Animal Testing (EPAA) i 201245 besluttet at en standardisert sandwich ELISA kalibrert mot dagens internasjonale rabies referansestandard ville være et ideelt alternativ for rabies vaksine styrketesting. Etter, en internasjonal samarbeidende pre-validering studie, som inkluderte både produsenter og regulatoriske organer, sammenlignet ulike ELISA design som brukes av produsentene og deres National Control Laboratories for batch release for deres evne til å diskriminere sub-potent fra potente partier fra forskjellige vaksine merker35. En ELISA-design som kombinerer mAb-D1 (antigen togent sted III) og et annet mAb-WI-1112 (antigent område II) ble foreslått av Det europeiske direktoratet for kvalitet på medisiner og helsepleie (EDQM) for en kommende internasjonal samarbeidsstudie under paraplyen til Det biologiske standardiseringsprogrammet (BSP). Dette viser (1) at flere kombinasjoner av mAbs for mikroplatebelegg og deteksjon kan brukes som et in vitro alternativ til in vivo NIH-testen og (2) at disse kombinasjonene kan være avhengig av ATV-vaksinestammen som skal testes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal må anerkjennes for deres viktigste deltakelse for å etablere ELISA-analysen om vaksinegrupper og for å organisere internasjonale workshops og samarbeidsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk lesning av manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolasjon og karakterisering av mAb-D1. Dette arbeidet har i hovedsak blitt støttet av Institut Pasteur-finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 159 Rabies vaksinestyrke NIH-test ELISA-metode mAb-D1 monoklonalt antistoff Trimers av glykoprotein Glykoproteininnhold
In Vitro ELISA Test for å evaluere Rabies vaksine styrke
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter