Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Hier beschrijven we een indirecte ELISA sandwich immunocapture om de immunogene glycoproproteïnegehalte in rabiësvaccins te bepalen. Deze test maakt gebruik van een neutraliserende Monoclonal Antibody (mAb-D1) herkennen glycoproproproteïne trimers. Het is een alternatief voor de in vivo NIH-test om de consistentie van de potentie van het vaccin tijdens de productie te volgen.

Abstract

De groeiende wereldwijde zorg voor het dierenwelzijn moedigt fabrikanten en de Nationale Controlelaboratoria (OL's) aan om de 3Rs-strategie voor de vervanging, vermindering en verfijning van het laboratoriumdierproeven te volgen. De ontwikkeling van in vitro benaderingen wordt aanbevolen op het WHO- en Europees niveau als alternatieven voor de NIH-test voor de evaluatie van de potentie van rabiësvaccin. Aan het oppervlak van het rabantievirus (RABV) vormen trimers van glycoproteïne de belangrijkste immunogen die virale neutraliserende antilichamen (VNAbs) veroorzaken. Een ELISA-test, waarbij monoklonale antilichamen (mAb-D1) de trimeric vorm van het glycoproteïne herkennen, is ontwikkeld om de inhoud van het inheemse gevouwen trimeric glycoproteïne samen met de productie van de vaccinbatches te bepalen. Deze in vitro potentie test toonde een goede overeenstemming met de NIH-test en is geschikt bevonden in gezamenlijke proeven door RABV vaccin fabrikanten en OL's. Het vermijden van dierlijk gebruik is een haalbaar doel in de nabije toekomst.

De gepresenteerde methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van de mAb-D1 die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van het trimeric RABV glycoproteïne herkent, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. mAb-D1 wordt gebruikt voor zowel coating als detectie van glycoproproproteïne trimers die aanwezig zijn in de vaccinbatch. Aangezien het epitoop wordt herkend vanwege zijn conformatie-eigenschappen, kan het potentieel gedenatureerde glycoproteïne (minder immunogeen) niet worden opgevangen en gedetecteerd door de mAb-D1. Het te testen vaccin wordt geïncubeerd in een plaat die is gesensibiliseerd met de mAb-D1. Gebonden trimeric RABV glycoproteïnen worden geïdentificeerd door het toevoegen van de mAb-D1 opnieuw, gelabeld met peroxidase en vervolgens onthuld in de aanwezigheid van substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk.

Introduction

Sinds meer dan 50 jaar wordt de NIH-test1 gebruikt als een gouden standaardmethode om de potentie van het rabiësvaccin vóór de batchrelease te evalueren. Deze test bestaat uit een intraperitoneale immunisatie van groepen muizen met het te testen vaccin, gevolgd door een intracerebrale (IC) uitdaging 14 dagen later met de Challenge Virus Standard (CVS) stam van rabiësvirus (RABV). De potentie wordt geëvalueerd vanuit het aandeel muizen dat de IC-uitdaging overleeft. Hoewel who2 en European Pharmacopeia3 nog steeds de NIH-test vereisen voor de beoordeling van de vaccinpotentie, lijdt deze test aan verschillende hindernissen: de resultaten zijn zeer variabel4; besmettelijke RABV wordt gebruikt tijdens de uitdaging en dit vereist zowel technische vaardigheid als strikte bioveiligheidsmaatregelen; grote aantallen dieren worden gebruikt, en de ernst van de uitdaging roept ernstige ethische bezwaren op5. Een minder ernstige variatie van deze test is ontwikkeld: twee weken na de intra-peritoneale immunisatie worden muizen niet uitgedaagd door IC, maar gebloed en getest op de aanwezigheid van specifieke RABV neutraliserende antilichamen (VNAbs) in hun serum met behulp van een in vitro neutralisatietest. Deze test vereist echter nog steeds het opofferen van een groot aantal laboratoriummuizen, hoewel deze al wordt gebruikt voor de veterinaire vaccins6,7 en in aanmerking is genomen voor menselijke vaccins8.

Vanaf nu moedigen zowel internationale9- als Europese10-aanbevelingen fabrikanten en nationale controlelaboratoria (Official Medicine Control Laboratories - OL's) aan om de vervanging, vermindering en verfijning van laboratoriumdierproeven uit te voeren, de zogenaamde 3Rs-strategie. De Europese Richtlijn 2010/63/EU (die sinds 2013/01/01 van kracht is) met betrekking tot de bescherming en het welzijn van dieren heeft ook de beperkingen versterkt voor vaccinfabrikanten en laboratoria die betrokken zijn bij de kwaliteitscontrole van rabiësvaccins en bij onderzoek naar rabiës11. Als gevolg hiervan zijn de ontwikkeling, validatie en het gebruik van alternatieve in vitro benaderingen nu een prioriteit geworden. Deze zijn niet alleen ethisch verantwoord, maar kunnen ook de kosten voor batchtesten verlagen en de tijd voor resultaten verkorten tot uren in plaats van weken3.

Aan het oppervlak van het RABV-deeltje neemt het glycoproteïne een trimeric vormaan 12,13,14,15,16. In rabiësvaccin vormt deze inheemse trimeric vorm de belangrijkste immunogen inducerende VNAbs17, terwijl de monomeric, oplosbare of gedenatureerde glycoproteïnen slecht immunogene18,19zijn. Zo is het behoud van trimers van het glycoproteïne langs het vaccinproductieproces een goede indicator voor het behoud van een optimaal immunogeen potentieel. Verschillende immunochemische methoden, zoals de antilichaambindingstest20,21,de enkelvoudige radiale immunodiffusie (SRD) test22 en de ELISA-test23,24,25,27,27 worden aanbevolen door de WHO Technical Report Series2 en de Europese monografie3 om het antigeengehalte in rabiësvaccins te kwantificeren. Deze worden gebruikt door fabrikanten om de consistentie van de productie van vaccins te controleren en door de OMCL om de consistente formulering van partijen menselijke vaccins28tebeoordelen, zelfs als de NIH-test nog steeds in aanmerking komt voor de potentie.

Echter, al deze immunochemische methoden zijn niet gelijkwaardig. De SRD-test vereist een voorbehandeling die de membraanverankerde trimers kan veranderen en kan resulteren in een oplosbare of gedenatureerde vorm van het glycoproteïne222,29. Daarom is SRD niet veel efficiënt in het discrimineren tussen immunogene en niet-immunogene glycoproteïnen wat resulteert in een onvolmaakte beoordeling van de immunogeniciteit van een vaccinpartij. Daarentegen is de ELISA-test gevoeliger22, behoudt de oorspronkelijke structuur van het glycoproteïne en is het beter om de inhoud van de native gevouwen trimers van glycoproteïne te bepalen. De ELISA-test kan gebruik maken van konijnenpolyklonale of muismonoklonale anti-glycoproteïneantilichamen gezuiverd of geconcentreerd met ammoniumsulfaat. Studies hebben aangetoond goede overeenstemming tussen de NIH-test en het antigeengehalte geëvalueerd door ELISA in vaccins en concludeerde dat ELISA-methoden geschikt zijn voor de in vitro potentie test. Dit pleit ervoor dat ELISA-tests op zijn minst de NIH-test4,26,27,30,31,32,33kunnen aanvullen of zelfs vervangen ., Vandaag beveelt de Europese Farmacopee het gebruik aan van gevalideerde serologische of immunochemische tests als alternatief voor de NIH-test3. Het volledig vermijden van dierlijk gebruik voor vaccinpotentie is een realistisch perspectief geworden.

De onderstaande methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van een muis monoklonale antilichaam kloon (mAb-D1) die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van de trimeric RABV glycoproteïne15,34herkent. Deze methode werd in eerste instantie ontwikkeld aan het Institut Pasteur26,30 vervolgens geoptimaliseerd en gevalideerd door de Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dat wil zeggen, de Franse OMCL4,33. De mAb-D1 wordt zowel gebruikt voor het sensibiliseren van de plaat als vervolgens voor het detecteren van het gevangen antigeen. Dit maakt de specifieke kwantificering van de glycoproproteïne trimers mogelijk, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. De mAb-D1 die voor de detectie wordt gebruikt, is gelabeld met peroxidase, wat wordt onthuld in aanwezigheid van het substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk. Het is van belang dat hetzelfde type test kan worden toegepast voor verschillende mAbs herkennen verschillende antigene sites van de RABV glycoproteïne35. De methode om met ammoniumsulfaat anti-glycoproteïne polyklonkonijn immunoglobulinen G (IgG) of monoklonale muisglobuline te verkrijgen en te zuiveren of te concentreren, is eerder uitgebreid beschreven36 samen met de methode om antilichamen met peroxidase37te vervoegen..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Veiligheidsmaatregelen

OPMERKING: Deze methode is van toepassing op zowel levend RABV als geïnactiveerd vaccin.

  1. Gebruik goede laboratoriumpraktijken en veiligheidsprocedures.
  2. Draag adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s), waaronder wegwerpjas, handschoenen, masker, bril, enz.
  3. Wanneer het levende virus wordt getitreerd, gebruik dan een biologische veiligheidskast van klasse II.
    1. Beschouw elk materiaal dat in contact komt met de monsters (reagentia, wasoplossingen, enz.) als besmettelijk materiaal.
    2. Behandel het verontreinigde materiaal door het in de bleekoplossing (2,5% natriumhypochloriet) gedurende 30 min in te dompelen voor ontsmetting.
  4. Behandel chemicaliën in overeenstemming met de Good Laboratory Practice.

2. Voorbereiding

  1. Gebruik waar mogelijk reagentia van analytische kwaliteit.
  2. Bereid nieuwe oplossingen voor van de coatingbuffer/carbonaatbuffer, passivatiebuffer, verdunnings- en kletteringsbuffer (tabel 1), filter door 0,45 of 0,22 μm filters en bewaar op 4 °C gedurende een dag voorafgaand aan het gebruik om hun analytische zuiverheid te behouden.
  3. Laat reagentia tot de kamertemperatuur komen (+18 °C tot +25 °C) 30 min voor het gebruik en homogeniseren door vóór het gebruik voorzichtig te mengen.

3. Microplaatsensibilisatie

OPMERKING: Gebruik 96 goed adsorptie immunoassay platen die zijn geoptimaliseerd om hoge hoeveelheden immunoglobulinen te binden (bijvoorbeeld, zie Tabel van materialen).

  1. Voeg aan elke put 200 μL van het monoklonale antilichaam (mAb-D1) verdund toe in de carbonaatbuffer.
    OPMERKING: Een optimale concentratie van ongeveer 1 μg/mL is experimenteel bepaald en komt overeen met een geschatte verdunning van de gezuiverde mAb-D1. Deze aanbevolen concentratie wordt aangegeven voor elke mAb-D1-batch en moet periodiek worden geverifieerd met de positieve controle.
  2. Bedek de plaat met een kleeffolie en incubeer de microplaat gedurende 3 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer.
  3. Voorzichtig aanzuigen en breng de put inhoud in een ontvanger met 2,5% natriumhypochloriet oplossing.
  4. Draai de microplaat om en laat het 5 min drogen op een adsorbentpapier bij kamertemperatuur.

4. Microplate passivation

  1. Voeg aan elke put 300 μL van de passivationbuffer toe.
  2. Bedek de plaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
  3. Zuig voorzichtig aan en breng het putgehalte over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
  4. Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    LET OP: De microplaat kan tot 3 maanden tot gebruik onmiddellijk worden gebruikt of verzegeld bij -20 °C.

5. ELISA-test

OPMERKING: Voor het vaststellen van de controlecurve van het referentievaccin is stap 5.3 niet vereist; om het geteste vaccin te titreren zijn alle stappen 5.1 tot en met 5.6 noodzakelijk.

  1. Wassen van de gesensibiliseerde microplaat
    1. Voeg aan elke put 300 μL van de wasbuffer toe.
    2. Zuig voorzichtig aan en breng het putgehalte over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
    3. Herhaal de stappen 5.1.1 en 5.1.2 nog vijf keer om de gesensibiliseerde plaat uitgebreid te wassen.
    4. Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
  2. Verdunningen van het referentievaccin voor de controlecurve
    1. Reconstrueren van het referentievaccin (validatieantigeen Lot 09) in 1 mL gedestilleerd water dat overeenkomt met een concentratie van 10 μg/mL van het glycoproteïnevirus van rabiës.
    2. Bereid een tienvoudige verdunning van het gereconstitueerde referentievaccin in het verdunningsmiddel voor om 1 μg/mL van het glycoproteïnevirus van rabiës te bereiken.
    3. Bereid 6 seriële tweevoudige verdunningen van dit referentievaccin voor in het verdunningsmiddel zoals aangegeven in tabel 1.
    4. Verdeel 200 μL van het verdunningsmiddel in duplicaat (putten 1H/2H) om te dienen als een blanco controle.
    5. Verdeel 200 μL per put van elk referentievaccin verdunning in duplicaat (putten G1/G2 tot A1/A2).
  3. Verdunningen van het geteste vaccin voor de titratie
    1. Bereid een tienvoudige verdunning van het geteste vaccin in het verdunningsmiddel.
    2. Bereid 7 tweevoudige seriële verdunningen van het geteste vaccin in verdunningsmiddel zoals aangegeven in tabel 2.
    3. Verdeel 200 μL per put van elke geteste vaccinverdunning in duplicaat (putten H3/H4 tot A3/A4).
  4. Incubatie/wassen van de ELISA plaat
    1. Bedek de microplaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Verwijder de folie, spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
    3. Voeg aan elk goed 300 μL wasbuffer toe.
    4. Spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
    5. Herhaal de stappen 5.4.3 en 5.4.4 vijf keer om het ongebonden antigeen te verwijderen en de G-eiwittrimers die aan het gecoate antilichaam gebonden zijn (mAb D1) te conserveren.
    6. Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
  5. Binding van de peroxidase geconjugeerde mAb-D1
    1. Verdeel 200 μL per put van de aanbevolen verdunning (1/2000) van peroxidase-label mAb-D1 in verdunning (geschatte concentratie van 1μg/mL). Voor elke mAb-D1-batch wordt een aanbevolen concentratie aangegeven en moet periodiek met de positieve controle worden geverifieerd.
    2. Bedek de microplaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Verwijder de folie, spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
    4. Voeg aan elke put, 300 μL van de wasbuffer.
    5. Spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.
    6. Herhaal de stappen 5.5.4 en 5.5.5 vijf keer om ongebonden peroxidase-gelabeld antilichaam (mAb D1) te verwijderen.
    7. Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
  6. Openbaring met behulp van een substraat-chromogen
    1. Verdeel 200 μL per put van substraat-chromogen oplossing.
    2. Sluit de microplaat af met een film en broed in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Een geel-oranje kleur ontwikkelt de intensiteit waarvan evenredig is met de hoeveelheid gebonden peroxidase-gelabeldantilichaam (mAb D1).
    3. Stop de reactie door 50 μL stopoplossing per put toe te voegen.
    4. Veeg voorzichtig de bodem van de microplaat af en plaats deze in een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) te bepalen op 492 nm van alle gebruikte putten: negatieve controle (blanco), referentievaccin en getest vaccin.
    5. Od-gegevens verzamelen als .xls- of .xlsx-bestandsindeling voor analyse.
  7. Teken de referentievaccincurve, het trimeric glycoproteïnegehalte, als functie van optische dichtheid (492 nm)
    1. Bereken de gemiddelde OD op 492 nm voor elk duplicaat bij de verschillende verdunningen van het referentievaccin (putten G1/G2 tot A1/A2 in tabel 2)
    2. Trek de gemiddelde OD van de Blanco (putten, H1/H2 in tabel 2)af van elk berekend gemiddelde OD.
    3. Plot de resulterende OD-waarden op de verticale as (lineaire schaal) en de overeenkomstige concentratie in glycoproproteïne-trimers (ng/mL) op de horizontale as (logaritmische schaal).
    4. Teken de referentiecurve door punten(figuur 1)samen te voegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In het volgende voorbeeld wordt het referentievaccin Lot 09, bestaande uit gezuiverde geïnactiveerde rabiësvirusdeeltjes (PV-vaccinstam), gebruikt. Het glycoproproteïne-gehalte (10 μg/mL) hierin is vastgesteld na de bepaling van de totale hoeveelheid virale eiwitten (BCA-test) en de evaluatie van het percentage van het glycoproteïne door SDS-polyacrylamidegelelektrofore. Als alternatief kan een gekalibreerd referentievaccin, bijvoorbeeld de WHO6th International Standard (IS) voor rabiësvaccin (NIBSC-code: 07/162), worden gebruikt.

Tabel 3 toont de OD-waarden (492 nm) voor een typisch experiment. Met behulp van deze waarden werd de referentievaccincurve getrokken door (1) de gemiddelde OD (minus de gemiddelde OD van de blanco) te plotten bij de verschillende verdunningen van het referentievaccin op de verticale as (lineaire schaal); (2) de concentratie van de glycoproproteïnetrimers (ng/mL) op de horizontale as (logaritmische schaal) (figuur 1).

Het glycoproteïnegehalte van het geteste vaccin wordt geschat in vergelijking met deze referentievaccincurve. De evaluatie is nauwkeurig voor de verdunning van het geteste vaccin, wat een gemiddelde OD-waarde geeft in het lineaire deel van de referentievaccincurve. In het gepresenteerde experiment (figuur 1) is het lineaire deel van ongeveer 1 tot 2 OD (tabel 3).

De verdunning 1/40 van het geteste vaccin, met een gemiddelde OD voor dubbele monsters van 1.534, is dan geschikt voor verdere evaluatie. Wanneer deze OD horizontaal wordt uitgezet tot het snijpunt met de referentievaccincurve, komt de verticale projectie op de x-as overeen met 500 ng/mL glycoproteïne. Gezien de verdunning bevat het geteste vaccin

40 x 500 ng/mL = 20 μg/mL trimeric glycoproteïne.

Momenteel is er geen ELISA internationale eenheid voor RABV glycoproteïne gehalte. De in vivo potentie van het referentievaccin, in internationale eenheden (IE/mL), is echter vastgesteld met behulp van de NIH-test in vergelijking met de6e WHO International Standard (NIBSC-code: 07/162)4. De vergelijking van de gemiddelde OD's tussen de referentie en het geteste vaccin maakt het dus niet alleen mogelijk om de trimeric glycoproteïnehoeveelheid van het geteste vaccin te meten, maar evalueert ook de in equivalent international unit (EIU/mL) geschatte in vitro potentie.

Met behulp van de hier beschreven ELISA-methode heeft het Franse OMCL (ANSM) het glycoproproteïnegehalte van meer dan 1000 partijen vaccin tegen menselijke hondsdolheid gecontroleerd die op de markt moeten worden gebracht en heeft het vergeleken met de NIH-test die op de locatie van de fabrikant wordt uitgevoerd4. De hoge variabiliteit van de NIH-test, als gevolg van de heterogeniteit in muizenstam en uitdagingsprocedure38, verhinderde een statistische correlatie tussen de twee tests. Echter, een concordantie in het profiel van de resultaten en dezelfde pass / fail conclusies werden verkregen met behulp van in vitro en in vivo assays4. Deze overeenstemming bevestigt dat de inheemse trimers van het glycoproteïne dat door de mAb-D134wordt erkend,39 het belangrijkste rabiësvirus immunogen vormen dat VNAbs induceert tijdens vaccinatie17. Deze VNAbs zijn in staat om muizen te beschermen tegen de intracerebrale uitdaging van de NIH-test. Concluderend, de in vitro beoordeling van het glycoproteïnegehalte van hondsdolheid is een aantrekkelijk alternatief voor de NIH-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren.

Buffers en reagentia Voorbereiding
Coatingbuffer
(Carbonaatbuffer 50mM pH=9.6)		 Voeg natriumcarbonaat 50 mM (Na2CO3-10H2O) toe aan natriumbicarbonaat 50 mM (NaHCO3)tot de gewenste pH (ongeveer 1/10 volume natriumbicarbonaat)
Passivation buffer 0,3% Runderserum Albumine (BSA, fractie V), 5% sacharose in carbonaatbuffer 50 mM pH 9,6
10x Fosfaat gebufferde zoutlijn pH=7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g in 1L gedestilleerd water. Pas pH=7 aan met 4N NaOH
Wasbuffer 0,05% Tween in 1x PBS
Verdunningsmiddel                                                  0,5% Bovine Serum Albumin (Fractie V), 0,05% Tween in 1x PBS (pas de pH aan op 7 vanwege verzuring door BSA)
Citrate buffer pH-5.6
(voor peroxidase substraat)		 11,67 g Tri-natriumcitrate-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g Citroenzuur-1H20 in 1 L gedestilleerd water
Substraat-chromogen oplossing 50 mg Ortho-fenyleen diamine tablet, 0,1% waterstofperoxide 30% (110 vol) in 25 ml Citrate buffer pH 5.6
Stopoplossing
(4N zwavelzuur)		 10 ml H2SO4 36N in 80 ml gekoeld gedestilleerd water. Verdunning moet worden uitgevoerd in een ijsbad

Tabel 1. Buffers gebruikt in de test.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Vaccin 1/640 Ref. Vaccin 1/640 Getest vaccin 1/1280 Getest vaccin 1/1280
B Ref. Vaccin 1/320 Ref. Vaccin 1/320 Getest vaccin 1/640 Getest vaccin 1/640
C Ref. Vaccin 1/160 Ref. Vaccin 1/160 Getest vaccin 1/320 Getest vaccin 1/320
D Ref. Vaccin 1/10 Ref. Vaccin 1/10 Getest vaccin 1/160 Getest vaccin 1/160
E Ref. Vaccin 1/40 Ref. Vaccin 1/40 Getest vaccin 1/80 Getest vaccin 1/80
F Ref. Vaccin 1/20 Ref. Vaccin 1/20 Getest vaccin 1/40 Getest vaccin 1/40
G Ref. Vaccin 1/10 Ref. Vaccin 1/10 Getest vaccin 1/20 Getest vaccin 1/20
H Lege Lege Getest vaccin 1/10 Getest vaccin 1/10
Referentievaccin Lot 09 verdunning Concentratie (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabel 2: Microplate-plan voor rabiësglycoproproteïnetitratietest en verdunningen voor de referentie- en geteste vaccins die in de test worden gebruikt.

Referentievaccin Lot 09 verdunning Concentratie (ng/mL) Geteste verdunning van vaccins OD-kolom 1 OD-kolom 2 OD-gemiddelde Referentie OD-gemiddelde- Leeg OD-gemiddelde
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Lege Lege 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tabel 3. Resultaten verkregen bij OD492 nm voor het plotten van de referentiecurve

Figure 1
Figuur 1: Referentiecurve met het trimeric glycoproproteïnegehalte als functie van de optische dichtheid (492 nm) voor het referentievaccin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het epitoop dat door de mAb-D1 wordt erkend, bevindt zich in de antigene plaats III van het RABV-glycoproteïne, dat niet alleen immunodominant is voor de inductie van VNAbs, maar ook betrokken is bij neurovirulence, pathogeniteit40,41 en receptorherkenning42. Er is nog een andere belangrijke antigene site langs het glycoproteïne, site II43, waartegen verschillende MAbs zijn geïsoleerd, zoals mAb-WI-111235. Deze kunnen ook worden gebruikt in het soortgelijke type experimenten.

Een beperking van deze in vitro methode door ELISA bevindt zich in de noodzakelijke conservering van het epitoop dat door de gebruikte mAb op de te testen stam van het rabiësvirus wordt erkend. Tot nu toe worden alle klassieke stammen die worden gebruikt voor vaccins tegen hondsdolheid erkend door de mAb-D1. De grotere diversiteit aan rabiësstammen die in diervaccins worden gebruikt, kan in de toekomst een probleem vormen. Echter, zoals eerder vermeld, dezelfde test kan worden toegepast met behulp van verschillende mAbs herkennen verschillende antigene sites van de RABV glycoprotein voor coating en detectie. Dit zal het mogelijk maken het probleem te omzeilen35.

Een ander gevoelig punt van deze methode, het kwantificeren van de trimrische vorm van het RABV-glycoproteïne, is het mogelijke effect van pH en temperatuur op de omkeerbare bevleesdheidsconversie14. Met deze parameters wordt rekening gehouden in het voorgestelde protocol.

Samengevat lijkt kwantificering van een zeer immunogene epitoop van correct gevouwen glycoproteïne-trimers met in vitro ELISA-methode even effectief als de NIH-test om de capaciteit van een vaccinbatch te meten om humorale immuniteit tegen besmetting met het rabiësvirus te induceren. Bovendien kan de ELISA-methode subkrachtige vaccinpartijen, in kwaliteit of in kwantiteit, onderscheiden van de potente4,35. De laatste stap alvorens een dergelijke in vitro ELISA-test voor te stellen ter vervanging van de NIH-test is de organisatie van een internationale gezamenlijke studie voor de verbetering en standaardisatie ervan.

Een workshop van het Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) getiteld International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, september 2010)44, concludeerde dat de NIH-test moet worden vervangen door een alternatieve in vitro test waarbij de immunogeniciteit van het vaccin wordt geëvalueerd en krachtig moet worden gediscrimineerd tussen subkrachtige partijen4.) Een andere workshop van het Europees partnerschap voor alternatieven voor dierproeven (EPAA) in 201245 besloten dat een gestandaardiseerde sandwich ELISA gekalibreerd tegen de huidige internationale rabiës referentienorm zou een ideaal alternatief voor de rabiës vaccin potentie testen. Na, een internationale gezamenlijke pre-validatie studie, die zowel fabrikanten en regelgevende instanties opgenomen, vergeleken verschillende ELISA ontwerpen gebruikt door de fabrikanten en hun Nationale Controle Laboratoria voor batch release voor hun vermogen om sub-potent discrimineren van krachtige partijen van verschillende vaccin merken35. Het Ontwerp van ELISA dat mAb-D1 (antigene site III) combineert met een andere mAb-WI-1112 (antigene site II) werd voorgesteld door het Europees Directoraat voor de kwaliteit van geneesmiddelen en gezondheidszorg (EDQM) voor een komende internationale samenwerkingsstudie onder de paraplu van het Biological Standardization Program (BSP). Hieruit blijkt (1) dat verschillende combinaties van mAbs voor microplaatcoating en detectie kunnen worden gebruikt als in vitro alternatief voor de in vivo NIH-test en (2) dat deze combinaties afhankelijk kunnen zijn van de te testen RABV-vaccinstam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dr. Sylvie Morgeaux en Dr. Jean-Michel Chapsal moeten worden erkend voor hun belangrijkste deelname aan de ELISA-test op vaccinbatches vast te stellen en internationale workshops en samenwerkingsstudies te organiseren. Wij danken Sabrina Kali voor het kritisch lezen van het manuscript. Dr. Pierre Perrin was verantwoordelijk voor de isolatie en karakterisering van mAb-D1. Dit werk werd voornamelijk ondersteund door de financiering van het Institut Pasteur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Immunologie en infectie kwestie 159 rabiës vaccin potentie NIH test ELISA methode mAb-D1 monoklonale antilichaam Trimers van glycoproteïne Glycoprotein gehalte
In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter