Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

هنا نصف المناعة شطيرة ELISA غير مباشرة لتحديد محتويات البروتين الجليكوبروتين المناعي في لقاحات داء الكلب. يستخدم هذا الاختبار جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb-D1) يتعرف على مرجّات البروتين الجليكوبروتيني. وهو بديل لاختبار المعاهد القومية للصحة في الجسم الحي لمتابعة اتساق فاعلية اللقاح أثناء الإنتاج.

Abstract

يشجع الاهتمام العالمي المتزايد برفاهية الحيوان المصنعين ومختبرات المراقبة الوطنية على اتباع استراتيجية 3Rs لاستبدال الاختبارات الحيوانية المختبرية والحد منها وصقلها. ويوصى بتطوير نُهج المختبر على مستوى منظمة الصحة العالمية وأوروبا كبدائل لاختبار المعاهد القومية للصحة لتقييم فعالية لقاح داء الكلب. على سطح فيروس داء الكلب (RABV) الجسيمات، التشذيب من بروتين الجليكوبروتين تشكل المناعي الرئيسي للحث على الأجسام المضادة تحييد الفيروسية (VNAbs). تم تطوير اختبار ELISA ، حيث يتعرف تحييد الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb-D1) على الشكل التقليمي للبروتين الجليكوبروتيني ، لتحديد محتويات بروتين التشذيب الأصلي المطوى إلى جانب إنتاج دفعات اللقاح. أظهر هذا الاختبار في قوة المختبر توافقجيد مع اختبار المعاهد القومية للصحة وتم العثور على مناسبة في التجارب التعاونية من قبل مصنعي لقاحات RABV وOMCLs. إن تجنب استخدام الحيوانات هدف يمكن تحقيقه في المستقبل القريب.

ويستند الأسلوب المعروض على المناعة شطيرة ELISA غير مباشرة باستخدام mAb-D1 الذي يتعرف على المواقع المضادة للجينات الثالث (aa 330 إلى 338) من بروتين الغليكوبروتين RABV التشذيب، أي مستضد RABV المناعي. يستخدم mAb-D1 لكل من الطلاء والكشف عن مغيري البروتين الجليكوبروتين الموجود في دفعة اللقاح. نظرًا لأن البيتوب معترف به بسبب خصائصه المطابقة ، فإن بروتين الجليكوبروتين المشوه المحتمل (أقل مناعة) لا يمكن التقاطه واكتشافه بواسطة mAb-D1. يتم احتضان اللقاح الذي سيتم اختباره في لوحة حساسة مع mAb-D1. يتم تحديد البروتينات الزرجة المنضمة RABV بإضافة mAb-D1 مرة أخرى ، وتسمى بيروكسيديز ثم يتم الكشف عنها في وجود الركيزة والكروموجين. وتتيح مقارنة الامتصاص المقيس للقاح المختبر واللقاح المرجعي تحديد محتوى البروتين الجليكوبروتيني المناعي.

Introduction

منذ أكثر من 50 عاما، يتم استخدام اختبار المعاهد القومية للصحة1 كوسيلة معيار الذهب لتقييم قوة لقاح داء الكلب قبل الإفراج عن دفعة. يتكون هذا الاختبار من تحصين داخل perperitoneal لمجموعات من الفئران مع اللقاح ليتم اختبارها تليها تحدي داخل الدماغ (IC) بعد 14 يوما مع معيار فيروس التحدي (CVS) سلالة من فيروس داء الكلب (RABV). يتم تقييم الفعالية من نسبة الفئران الناجية من تحدي IC. على الرغم من أن منظمة الصحة العالمية2 والدوائية الأوروبية3 لا تزال تتطلب اختبار المعاهد القومية للصحة لتقييم قوة اللقاح، ويعاني هذا الاختبار عدة عقبات: النتائج متغيرة للغاية4; ويستخدم RABV المعدية خلال التحدي وهذا يتطلب كل من المهارة التقنية وتدابير السلامة البيولوجية الصارمة؛ وتستخدم أعداد كبيرة من الحيوانات، وشدة التحدي يثير مخاوف أخلاقية خطيرة5. وقد تم تطوير اختلاف أقل حدة من هذا الاختبار: بعد أسبوعين من التحصين داخل الجبقية، لا تتحدى الفئران من قبل IC ولكن نزف واختبارها لوجود أجسام مضادة محددة تحييد RABV (VNAbs) في مصلها باستخدام اختبار تحييد المختبر. ومع ذلك، لا يزال هذا الاختبار يتطلب التضحية بعدد كبير من فئران المختبر على الرغم من أنه يستخدم بالفعل لللقاحات البيطرية6،,7 وقد تم النظر في اللقاحات البشرية8..

وحتى الآن، تشجع التوصيات الدوليةالـ 9 والأوروبيةالعشرة المصنعين ومختبرات المراقبة الوطنية (مختبرات مراقبة الطب الرسمية - OMCLs) على تنفيذ استبدال الاختبارات الحيوانية المختبرية والحد منها وصقلها، التي يشار إليها باسم استراتيجية 3Rs. كما عزز التوجيه الأوروبي 2010/63/EU (الساري منذ 2013/01/01) المتعلق بحماية الحيوانات ورفاهيتها القيود المفروضة على مصنعي اللقاحات والمختبرات المشاركة في مراقبة جودة لقاحات داء الكلب وكذلك في بحوث داء الكلب11. ونتيجة لذلك، أصبح الآن وضع النهج البديلة في المختبر والتحقق من صحتها واستخدامها أولوية. هذه ليست فقط سليمة أخلاقيا ولكن يمكن أيضا خفض تكاليف اختبار دفعة وتقصير الوقت للنتائج إلى ساعات بدلا من أسابيع3.

على سطح الجسيمات RABV، وبروتين الجليكوبروتين يعتمد شكل التشذيب12،13،14،15،16. في لقاح داء الكلب، يشكل هذا الشكل الأصلي التشذيب المناعة الرئيسية التي تحفز VNAbs17 في حين أن البروتينات الجليكوبروتينية الأحادية أو القابلة للذوبان أو المشوهة هي ضعيفة المناعة18،19. وبالتالي، فإن الحفاظ على مغيري البروتين الجليكوبروتين يُمثل عملية إنتاج اللقاح مؤشراً جيداً للحفاظ على الإمكانات المناعية المثلى. العديد من الطرق المناعية الكيميائية، مثل اختبار الأجسام المضادة ملزمة20،,21،والأشعة المناعية شعاعية واحدة (SRD) اختبار22 واختبار ELISA23،,24،,25،,26، 27,27 هي الموصى بها من قبل سلسلة التقرير التقني لمنظمة الصحة العالمية2 والدراسة الأوروبية3 لقياس محتوى المستضد في لقاحات داء الكلب. وتستخدم هذه من قبل الشركات المصنعة لرصد اتساق إنتاج اللقاحات وOMCL لتقييم التركيب ة متسقة من دفعات من اللقاحات البشرية28، حتى لو كان اختبار المعاهد القومية للصحة لا يزال يعتبر لقوة.

ومع ذلك ، فإن كل هذه الأساليب المناعية الكيميائية ليست متساوية. يتطلب اختبار SRD معالجة مسبقة قد تغير التشذيب المرتكز على الغشاء وينتج عنه شكل قابل للذوبان أو مشوه من بروتين الجليكوبروتين22،29. وبالتالي، فإن SRD ليست فعالة كثيرا في التمييز بين البروتينات الجليكوبروتينية المناعية وغير المناعية مما أدى إلى تقييم ناقص للمناعة من الكثير من اللقاح. وعلى النقيض من ذلك، فإن اختبار ELISA هو أكثر حساسية22،ويحافظ على الهيكل الأصلي للبروتين الجليكوبروتين، وأكثر ملاءمة لتحديد محتوى التشذيب مطوية أصلا من البروتين الجليكوبروتين. يمكن لاختبار ELISA استخدام إما الأجسام المضادة المضادة للبروتين أحادي النسيلة أو أحادية النسيلة أو أحادية النسيلة أو أحادية النسيلة أو الأجسام المضادة للبروتين الجليكوبروتين المنقاة أو المركزة مع كبريتات الأمونيوم. وقد أظهرت الدراسات التوافق الجيد بين اختبار المعاهد القومية للصحة ومحتوى المستضد الذي تقيمه ELISA في اللقاحات وخلصت إلى أن أساليب ELISA مناسبة لاختبار الفعالية المختبرية. هذا يدعو إلى أن اختبارات ELISA قد تكمل على الأقل أو حتى تحل محل اختبار المعاهد القومية للصحة4،26،27،30،31،32،33., اليوم، توصي الأدوية الأوروبية باستخدام المواد الكيميائية المصلية أو المناعية المعتمدة كبدائل لاختبار المعاهد القومية للصحة3. وقد أصبح التجنب الكامل للاستخدام الحيواني لفعالية اللقاح منظوراً واقعياً.

ويستند الأسلوب المعروض أدناه على غير مباشر ELISA شطيرة المناعة باستخدام الماوس أحادي الكلون استنساخ الأجسام المضادة (mAb-D1) الذي يتعرف على المواقع المضادة للطبيعة الثالث (aa 330 إلى 338) من التشذيب RABV الجليكوبروتين15،34. تم تطوير هذه الطريقة في البداية في مختبر معهد باستور26،30 ثم تم تحسينها والتحقق من صحتها من قبل الوكالة الوطنية للعلوم والديمقراطية ومختبر produits de santé (ANSM) ، أي OMCL الفرنسية4،33. ويستخدم mAb-D1 على حد سواء لتوعية لوحة وبعد ذلك للكشف عن مستضد القبض. وهذا يسمح بالقياس الكمي المحدد لتقليم البروتين الجليكوبروتيني، أي مستضد RABV المناعي. ويسمى mAb-D1 المستخدمة للكشف مع البيروكسيداز، والتي يتم الكشف عنها في وجود الركيزة والكروموجين. وتتيح مقارنة الامتصاص المقيس للقاح المختبر واللقاح المرجعي تحديد محتوى البروتين الجليكوبروتيني المناعي. ومن الجدير بالذكر أن نفس النوع من الفحص يمكن تطبيقها على mAbs مختلفة الاعتراف المواقع المضادة للطبيعة المختلفة من بروتين الغليكوبروتين RABV35. طريقة الحصول على وتنقية أو التركيز مع كبريتات الأمونيوم المضادة للجليكوبروتين الجلوبيولين المناعي الأرانب G (IgG) أو جلوبيولين الماوس أحادي النسيقد وقد وصفت على نطاق واسع سابقا36 جنبا إلى جنب مع طريقة لاقتران الأجسام المضادة مع البيروكسية37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- الاحتياطات الأمنية

ملاحظة: تنطبق هذه الطريقة على كل من RABV الحية واللقاح المعطلة.

  1. استخدام ممارسات المختبرات الجيدة وإجراءات السلامة.
  2. ارتداء معدات الحماية الشخصية الكافية (PPE) بما في ذلك معطف المتاح، والقفازات، وقناع، والنظارات، الخ.
  3. عندما يتم مُرتَك الفيروس الحي، استخدم خزانة أمان بيولوجي من الفئة الثانية.
    1. النظر في أي مواد على اتصال مع العينات (الكواشف، ومحلول الغسيل، وما إلى ذلك) كمادة معدية.
    2. علاج المواد الملوثة عن طريق غمر في محلول التبييض (2,5% من هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 30 دقيقة لإزالة التلوث.
  4. التعامل مع المواد الكيميائية وفقا للممارسة المختبرية الجيدة.

2- التحضير

  1. استخدام الكواشف الصف التحليلي ة حيثما كان ذلك ممكنا.
  2. إعداد حلول جديدة من المخزن المؤقت الطلاء / كربونات، عازل التخميل، المخفف والحواجز التدرجات(الجدول 1)،تصفية من خلال مرشحات 0.45 أو 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية ليوم واحد قبل الاستخدام للحفاظ على نقاوتها التحليلية.
  3. السماح للكواشف بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (+18 درجة مئوية إلى +25 درجة مئوية) قبل 30 دقيقة من الاستخدام والتجانس عن طريق الخلط اللطيف قبل الاستخدام.

3- التوعية بالصفائح الدقيقة

ملاحظة: استخدم 96 لوحة مناعية امتصاص جيد تم تحسينها لربط كميات عالية من الغلوبولين المناعي (على سبيل المثال، انظر جدول المواد).

  1. إلى كل بئر، إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb-D1) المخفف في المخزن المؤقت كربونات.
    ملاحظة: تم تحديد تركيز أمثل من حوالي 1 ميكروغرام/مل تجريبياً ويتوافق مع تخفيف تقريبي 1/2000 من mAb-D1 المنقى. يشار إلى هذا التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منها بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
  2. تغطية لوحة مع فيلم لاصق واحتضان microplate لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية في جو رطب.
  3. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
  4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة.

4. ميكروبلايت التخميل

  1. إلى كل بئر، إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت التخميل.
  2. تغطية لوحة مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  3. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
  4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: يمكن استخدام اللوحة الدقيقة على الفور أو تخزينها مختومة في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى الاستخدام.

5. ELISA القول

ملاحظة: لإنشاء منحنى التحكم في اللقاح المرجعي، الخطوة 5.3 غير مطلوبة؛ لتحصين اللقاح المختبر جميع الخطوات 5.1 إلى 5.6 ضرورية.

  1. غسل الصفيحة الدقيقة الحساسة
    1. إلى كل بئر، إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الغسيل.
    2. يستنشق بعناية ونقل محتوى البئر إلى مستلم يحتوي على 2,5% محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    3. كرر الخطوات 5.1.1 و 5.1.2 خمس مرات أخرى لغسل لوحة التوعية على نطاق واسع.
    4. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  2. تخفيف اللقاح المرجعي لمنحنى التحكم
    1. إعادة تشكيل اللقاح المرجعي (مستضد التحقق من الصحة لوط 09) في 1 مل من الماء المقطر المقابلة لتركيز 10 ميكروغرام /مل من بروتين بروتين فيروس داء الكلب.
    2. إعداد تخفيف عشرة أضعاف من اللقاح المرجعي المعاد تشكيلها في المخفف للوصول إلى 1 ميكروغرام / مل من بروتين فيروس داء الكلب.
    3. إعداد 6 مخففات متسلسلة ذات شقين لهذا اللقاح المرجعي في المخفف كما هو مبين في الجدول 1.
    4. توزيع 200 ميكرولتر من المخفف في مكررة (آبار 1H/2H) لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ.
    5. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف لقاح مرجعي في مكررة (الآبار G1/G2 إلى A1/A2).
  3. تخفيف اللقاح المختبر لمعايرته
    1. إعداد تخفيف عشرة أضعاف من اللقاح الذي تم اختباره في المخفف.
    2. إعداد 7 تخفيفات متسلسلة ذات شقين من اللقاح المختبر في المخفف كما هو مبين في الجدول 2.
    3. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل تخفيف لقاح تم اختباره في مكررة (الآبار H3/H4 إلى A3/A4).
  4. حضانة / غسل لوحة ELISA
    1. تغطية microplate مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    2. إزالة الفيلم، نستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    3. إلى كل إضافة جيدا 300 ميكرولتر من الغسيل المخزن المؤقت.
    4. يستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    5. كرر الخطوتين 5.4.3 و 5.4.4 خمس مرات لإزالة المستضد غير المنضم والحفاظ على مرذب البروتين G المنضم إلى الأجسام المضادة المغلفة (mAb D1).
    6. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  5. ملزمة من البيروكسيداز مب-D1
    1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من التخفيف الموصى به (1/2000) من mAb-D1 المسمى بيروكسيديز في الدلوين (تركيز تقريبي 1μg/mL). يشار إلى التركيز الموصى به لكل دفعة mAb-D1 ويجب التحقق منه بشكل دوري مع التحكم الإيجابي.
    2. تغطية microplate مع فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    3. إزالة الفيلم، نستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    4. إضافة إلى كل بئر، 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الغسيل.
    5. يستنشق بعناية ونقل محتوى كل جيدا إلى المتلقي التي تحتوي على 2،5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم.
    6. كرر الخطوتين 5.5.4 و 5.5.5 خمس مرات لإزالة الأجسام المضادة المسماة بيروكسيديز غير المنضمة (mAb D1).
    7. عكس اللوحة الدقيقة واتركه يجف على ورقة ممتزة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  6. الوحي باستخدام الركيزة الكروموجين
    1. توزيع 200 ميكرولتر لكل بئر من محلول الركيزة الكروموجين.
    2. ختم لوحة صغيرة مع فيلم واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اللون الأصفر والبرتقالي يطور كثافة التي تتناسب مع كمية الأجسام المضادة التي تحمل علامة بيروكسيديز ملزمة (mAb D1).
    3. وقف التفاعل عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من وقف الحل في البئر.
    4. مسح دقيق الجزء السفلي من microplate ووضعه في مطياف لتحديد الكثافة البصرية (OD) في 492 نانومتر من جميع الآبار المستخدمة: التحكم السلبي (فارغة)، لقاح مرجعي ولقاح اختبارها.
    5. جمع بيانات OD كتنسيق ملف .xlss أو .xlsx للتحليل.
  7. رسم منحنى اللقاح المرجعي، محتوى بروتين الجليكوبروتين الزتيري، كدالة للكثافة البصرية (492 نانومتر)
    1. حساب متوسط OD عند 492 نانومتر لكل مكررة عند التخفيفات المختلفة لللقاح المرجعي (الآبار G1/G2 إلى A1/A2 في الجدول 2)
    2. طرح متوسط OD من فارغة (الآبار، H1/H2 في الجدول 2)من كل OD المتوسط محسوبة.
    3. رسم قيم OD الناتجة على المحور الرأسي (مقياس خطي) والتركيز المقابل في مغيرات البروتين الجليكوبروتين (نانوغرام/مل) على المحور الأفقي (مقياس لوغاريتمي).
    4. رسم المنحنى المرجعي عن طريق ربط النقاط(الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في المثال التالي يتم استخدام اللقاح المرجعي Lot 09 ، الذي يتكون من جزيئات فيروس داء الكلب المنشط النقي (سلالة اللقاح الكهروضوئي). وقد تم تحديد محتوى التشذيب الجليكوبروتين (10 ميكروغرام/مل) في هذا بعد تحديد الكمية الإجمالية للبروتينات الفيروسية (اختبار BCA) وتقييم النسبة المئوية للبروتين الجليكوبروتيني بواسطة SDS-polyacrylamide هلام الكهربية. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام لقاح مرجعي معاير، مثل المعيار الدوليالسادس لمنظمة الصحة العالمية للقاح داء الكلب (رمز NIBSC: 07/162).

ويبين الجدول 3 قيم OD (492 نانومتر) لتجربة نموذجية. وباستخدام هذه القيم، تم رسم منحنى اللقاح المرجعي عن طريق رسم (1) متوسط OD (ناقص متوسط OD للفارغة) عند التخفيفات المختلفة لللقاح المرجعي على المحور الرأسي (المقياس الخطي)؛ (2) تركيز مغيري البروتين الجليكوبروتين (نانوغرام/مل) على المحور الأفقي (مقياس اللوغاريتمي)(الشكل 1).

ويقدر محتوى البروتين الجليكوبروتين من اللقاح المختبر بالمقارنة مع هذا المنحنى اللقاح المرجعي. التقييم دقيق لتخفيف اللقاح المختبر مما يعطي قيمة OD متوسطة في الجزء الخطي من منحنى اللقاح المرجعي. في التجربة المقدمة(الشكل 1)، يكون الجزء الخطي من حوالي 1 إلى 2 OD(الجدول 3).

ثم يكون التخفيف 1/40 من اللقاح المختبر، مع متوسط OD لعينات مكررة من 1.534، مناسبًا لمزيد من التقييم. عندما يتم رسم هذا OD أفقياً حتى نقطة التقاطع مع منحنى اللقاح المرجعي، يتوافق الإسقاط الرأسي على المحور س مع 500 نانوغرام/مل من بروتين الجليكوبروتين. بالنظر إلى التخفيف ، يحتوي اللقاح المختبر على

40 × 500 نانوغرام/مل = 20 ميكروغرام/مل من بروتين الرتيريك.

حاليا، لا توجد وحدة ELISA الدولية لمحتوى بروتين الجليكوبروتين RABV. ومع ذلك، تم إنشاء فاعلية الجسم الحي من اللقاح المرجعي، في الوحدات الدولية (IU/mL)، باستخدام اختبار المعاهد القومية للصحة بالمقارنة مع المعيار الدوليالسادس لمنظمة الصحة العالمية (رمز NIBSC: 07/162)4. وبالتالي، فإن مقارنة متوسط ODs بين المرجع واللقاح المختبر لا تسمح فقط بقياس كمية بروتين الجليكوبروتين الزتيرية من اللقاح المختبر، بل تقيّم أيضاً الفعالية المختبرية المقدرة في الوحدة الدولية المكافئة(EIU/mL).

باستخدام طريقة ELISA الموصوفة هنا ، رصدت OMCL الفرنسية (ANSM) محتوى البروتين الجليكوبروتين لأكثر من 1000 دفعة من لقاح داء الكلب البشري ليتم إطلاقه في السوق ومقارنة مع اختبار المعاهد القومية للصحة الذي تم إجراؤه في موقع الشركة المصنعة4. وقد حال التباين الكبير في اختبار المعاهد القومية للصحة، بسبب عدم التجانس في إجهاد الفئران والإجراء38فيالتحدي، دون وجود ارتباط إحصائي بين الاختبارين. ومع ذلك ، تم الحصول على توافق في ملف النتائج ونفس استنتاجات التمرير / الفشل باستخدام في المختبر وفي الحي المقالات4. ويؤكد هذا التوافق أن التشذيب الأصلي من بروتين الجليكوبروتين المعترف بها من قبل mAb-D134,39 تشكل فيروس داء الكلب الرئيسي المناعي ة تحريض VNAbs أثناء التطعيم17. هذه VNAbs قادرة على حماية الفئران من التحدي داخل الدماغ من اختبار المعاهد القومية للصحة. في الختام، فإن التقييم المختبري لمحتوى بروتين الكلب هو بديل جذاب لاختبار المعاهد القومية للصحة لتقييم فعالية لقاح داء الكلب.

المخازن المؤقتة والكواشف اعداد
طلاء المخزن المؤقت
(كربونات العازلة 50mM درجة الحموضة = 9.6)		 إضافة كربونات الصوديوم 50 mM (نا2CO 3-10H2O) إلى بيكربونات الصوديوم 50 mM (NaHCO3)حتى الرقم الهيدروجيني المطلوب (حوالي 1/10 حجم بيكربونات الصوديوم)3
المخزن المؤقت للتخميل 0.3٪ بورفين مصل الألبومين (BSA، كسر الخامس)، 5٪ السكروز في الكربونات العازلة 50 mM درجة الحموضة 9.6
10x الفوسفات المؤقتة pH = 7 (PBS 10x) NaCl 80 غرام، KCl 2 ز، نا2PO4-12H2O 11.33 ز، KH2PO4 2g في 1L من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة = 7 مع 4N NaOH
الغسيل المخزن المؤقت 0.05٪ Tween في 1x PBS
مخفف                                                  0.5٪ بورفين مصل الألبومين (كسر الخامس)، 0.05٪ Tween في 1x PBS (ضبط درجة الحموضة إلى 7 بسبب التحمض من قبل BSA)
citrate عازلة pH-5.6
(لركيزة بيروكسيديز)		 11.67 غ تسترات ثلاثي الصوديوم-2H2O(Na3C6H5O7-2H20)، 2.17 غرام حمض الستريك-1H20 في 1لتر من الماء المقطر
محلول الركيزة الكروموجين 50 ملغ قرص ديامين تقويم العظام الفينيل فينيل, 0.1% بيروكسيد الهيدروجين 30% (110 فول) في 25 مل سيترات عازلة درجة الحموضة 5.6
إيقاف الحل
(حمض الكبريتيك 4N)		 10 مل H2SO4 36N في 80 مل المياه المقطرة المبردة. يجب أن يتم التخفيف في حمام جليدي

الجدول 1 - ما إذا كانت هناك المخازن المؤقتة المستخدمة في عملية الفحص.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
أ المرجع لقاح 1/640 المرجع لقاح 1/640 لقاح تم اختباره 1/1280 لقاح تم اختباره 1/1280
ب المرجع لقاح 1/320 المرجع لقاح 1/320 لقاح تم اختباره 1/640 لقاح تم اختباره 1/640
ج المرجع لقاح 1/160 المرجع لقاح 1/160 لقاح تم اختباره 1/320 لقاح تم اختباره 1/320
د المرجع لقاح 1/10 المرجع لقاح 1/10 لقاح تم اختباره 1/160 لقاح تم اختباره 1/160
ه المرجع لقاح 1/40 المرجع لقاح 1/40 لقاح تم اختباره 1/80 لقاح تم اختباره 1/80
و المرجع. لقاح 1/20 المرجع. لقاح 1/20 لقاح تم اختباره 1/40 لقاح تم اختباره 1/40
ز المرجع لقاح 1/10 المرجع لقاح 1/10 لقاح تم اختباره 1/20 لقاح تم اختباره 1/20
ح فارغه فارغه لقاح تم اختباره 1/10 لقاح تم اختباره 1/10
مرجع لقاح لوت 09 التخفيف تركيز (نانوغرام/مل)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

الجدول 2: خطة Microplate لفحص معايرة بروتين الكلب والتخفيف من أجل اللقاحات المرجعية والمختبرة المستخدمة في الفحص.

مرجع لقاح لوت 09 التخفيف تركيز (نانوغرام/مل) تم اختبار تخفيف اللقاح عمود OD 1 عمود OD 2 OD يعني مرجع OD يعني - يعني OD فارغة
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
فارغه فارغه 1/10 0.078 0.087 0.0825

الجدول 3 - ما إذا كانت هناك النتائج التي تم الحصول عليها في OD492 نانومتر لرسم المنحنى المرجعي

Figure 1
الشكل 1:منحنى مرجعي يظهر محتوى بروتين الجليكوبروتين الزتيريك كدالة للكثافة البصرية (492 نانومتر) للقاح المرجعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقع epitope المعترف بها من قبل mAb-D1 في الموقع المضاد للكائنات المضادة للبروتين الجليكوبروتين RABV الذي ليس فقط المناعي المهيمنة لتحريض VNAbs ولكن أيضا تشارك في الضراوة العصبية، والإمراضية40،,41 والتعرف على مستقبلات42. هناك موقع آخر مضاد للوراثيا على طول الجليكوبروتين، الموقع الثاني43، والتي تم عزل العديد من MAbs مثل mAb-WI-111235. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه في نوع مماثل من التجارب.

أحد القيود المفروضة على هذا في طريقة المختبر من قبل ELISA يكمن في الحفظ اللازم للepitope المعترف بها من قبل mAb المستخدمة على سلالة فيروس داء الكلب ليتم اختبارها. حتى الآن، يتم التعرف على جميع السلالات الكلاسيكية المستخدمة للقاحات داء الكلب البشري من قبل mAb-D1. وقد يشكل التنوع الأكبر لسلالات داء الكلب المستخدمة في اللقاحات الحيوانية مشكلة في المستقبل. ومع ذلك ، كما ذكر سابقا ، يمكن تطبيق نفس القول باستخدام mAbs مختلفة تعترف المواقع المضادة للطبيعة المختلفة من بروتين الغليكوبروتين RABV للطلاء والكشف. سيسمح هذا بالتحايل على المشكلة35.

نقطة حساسة أخرى من هذه الطريقة، قياس الشكل التشذيب من بروتين الرّجليكوبروتين RABV، هو التأثير المحتمل للدرجة الهيدروجينية ودرجة الحرارة على تحويل التوافق عكسها14. وتؤخذ هذه البارامترات في الاعتبار في البروتوكول المقترح.

وباختصار، فإن التحديد الكمي لبؤرة البروتين الجليكوبروتين يطوي بشكل صحيح من خلال طريقة ELISA المختبرية يبدو فعالاً مثل اختبار المعاهد القومية للصحة لقياس قدرة دفعة اللقاح للحث على المناعة الفكاهية ضد عدوى فيروس داء الكلب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تميز طريقة ELISA على الكثير من اللقاحات دون القوية ، من حيث الجودة أو الكمية ، من تلك القوية4،35. الخطوة الأخيرة قبل اقتراح مثل هذا في المختبر ELISA القول ليحل محل اختبار المعاهد القومية للصحة هو تنظيم دراسة تعاونية دولية لتحسينها وتوحيدها.

وخلصت حلقة عمل عقدتها لجنة التنسيق بين الوكالات المعنية) بالتحقق من صحة الأساليب البديلة بعنوان حلقة عمل دولية بشأن الأساليب البديلة للحد من وصقل واستبدال استخدام الحيوانات في فعالية اللقاح واختبار السلامة (Ames, September 2010)44, إلى أنه ينبغي الاستعاضة عن اختبار المعاهد القومية للصحة باختبار بديل في المختبر يقيّم مناعة اللقاح وقادر على التمييز بين دفعات قوية ومنخفضة القوة4. وقررت حلقة عمل أخرى للشراكة الأوروبية لبدائل اختبار الحيوانات في عام 201245 أن شطيرة موحدة معايرة ELISA مقابل المعيار المرجعي الدولي الحالي لداء الكلب سيكون بديلاً مثالياً لاختبار فعالية لقاح داء الكلب. بعد ذلك ، قارنت دراسة تعاونية دولية قبل التحقق ، والتي شملت المصنعين والهيئات التنظيمية ، مختلف تصاميم ELISA المستخدمة من قبل المصنعين ومختبرات التحكم الوطنية الخاصة بهم لإطلاق دفعة لقدرتها على التمييز دون قوية من دفعات قوية من العلامات التجارية المختلفة للقاحات35. اقترحت المديرية الأوروبية لجودة الأدوية والرعاية الصحية (EDQM) تصميماً لـ ELISA يجمع بين mAb-D1 (الموقع المضاد للطبيعة III) وmAb-WI-1112 (الموقع المضاد للطبيعة الثاني) لإجراء دراسة تعاونية دولية وشيكة تحت مظلة برنامج التوحيد البيولوجي (BSP). وهذا يدل على (1) أن عدة مجموعات من mAbs لطلاء microplate والكشف يمكن استخدامها كبديل في المختبر لاختبار المعاهد القومية للصحة في الجسم الحي و (2) أن هذه المجموعات يمكن أن تعتمد على سلالة لقاح RABV ليتم اختبارها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يجب الاعتراف بالدكتورة سيلفي مورجيو والدكتور جان ميشيل شابسال لمشاركتهما الرئيسية في إنشاء مقياس ELISA على دفعات اللقاحات وتنظيم ورش عمل دولية ودراسات تعاونية. نشكر صابرينا كالي على القراءة النقدية للمخطوطة. وكان الدكتور بيير بيرين مسؤولا ً عن عزل وتوصيف mAb-D1. وقد تم دعم هذا العمل بشكل رئيسي من قبل معهد تمويل باستور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 159، فاعلية لقاح داء الكلب، اختبار المعاهد القومية للصحة، طريقة ELISA، الأجسام المضادة أحادية النسيلة mAb-D1، التشذيب من بروتين الجليكوبروتين، محتوى البروتين الجليكوبروتيني
في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter