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Immunology and Infection

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

Abstract

동물 복지에 대한 전 세계적으로 증가하는 관심사는 제조업체와 국립 통제 연구소(OMCL)가 실험실 동물 실험의 교체, 감소 및 개선을 위한 3R 전략을 따르도록 장려하고 있습니다. 시험관 내 접근법의 개발은 광견병 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트의 대안으로 WHO 및 유럽 수준에서 권장됩니다. 광견병 바이러스 (RABV) 입자의 표면에서, 당단백질의 트리머는 바이러스 중화 항체 (VNAbs)를 유도하는 주요 면역 원을 구성한다. 중화 단일 클론 항체 (mAb-D1)는 당단백질의 트리메라 형태를 인식하는 ELISA 테스트는 백신 배치의 생산과 함께 네이티브 접힌 트리메릭 당단백질의 함량을 결정하기 위해 개발되었습니다. 이 시험관 내 효능 시험은 NIH 테스트와 양호한 일치를 입증했으며 RABV 백신 제조업체 및 OMcLs의 공동 시험에서 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 동물 사용의 회피는 가까운 장래에 달성 가능한 목표입니다.

제시된 방법은 트리메릭 RABV 당단백질, 즉 면역원성 RABV 항원의 항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 mAb-D1을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포지에 기초한다. mAb-D1은 백신 배치에 존재하는 당단백질 트리머의 코팅 및 검출 모두에 사용됩니다. 에피토프는 그것의 형태 특성 때문에 인식되기 때문에, 잠재적으로 변성된 당단백질 (더 적은 면역원성)은 mAb-D1에 의해 포착되고 검출될 수 없습니다. 시험되는 백신은 mAb-D1로 민감화된 플레이트에서 배양된다. 바운드 트리메릭 RABV 당단백질은 mAb-D1을 다시 첨가하여 확인되고, 과산화아제로 표지된 다음 기질 및 크로모겐의 존재에서 밝혀낸다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다.

Introduction

50년 이상 부터, NIH 시험1은 일괄 방출 전에 광견병 백신 효능을 평가하는 금 본위제 방법으로 사용된다. 이 시험은 광견병 바이러스 (RABV)의 도전 바이러스 표준 (CVS) 긴장으로 14 일 후에 시험될 백신을 가진 마우스의 군의 복강 내 면역으로 이루어져 있습니다. 효능은 IC 도전에서 살아남은 마우스의 비율에서 평가됩니다. WHO2 와 유럽 약전3은 여전히 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트를 필요로하지만,이 테스트는 몇 가지 장애물을 겪습니다 : 결과는 매우 가변적4; 전염성 RABV는 도전 도중 사용되며 이것은 기술적 인 기술과 엄격한 생물 안전 조치를 모두 필요로합니다. 많은 수의 동물이 사용되고 있으며, 도전의 심각성은 심각한 윤리적 우려를제기5. 이 시험의 보다 적게 가혹한 변이는 개발되었습니다: 복막 내 면역 화 후에 2 주, 마우스는 IC에 의해 도전되지 않습니다 그러나 시험관외 중화 시험을 사용하여 그들의 혈청에 있는 특정 RABV 중화 항체 (VNAbs)의 존재를 위해 시험을 보았습니다. 그러나, 이 시험은 이미 수의학 백신6,,7에 사용되고 인간 백신8에대해 고려되고 있지만 많은 수의 실험실 마우스를 희생해야한다.

현재, 국제9 및 유럽10 권고 는 제조 업체와 국가 제어 실험실을 장려 (공식 의학 제어 실험실 - OMCLs) 실험실 동물 테스트의 교체를 구현, 감소, 그리고 실험실 동물 테스트의 정제, 3Rs 전략으로 언급. 동물의 보호 및 복지와 관련된 유럽 지침 2010/63/EU(2013/01/01 이후 발효)는 광견병 백신의 품질 관리및 광견병 연구11에관련된 백신 제조업체 및 실험실에 대한 제약을 강화했습니다. 그 결과, 시험관 내 대체 접근법의 개발, 검증 및 사용이 이제 우선 순위가 되었습니다. 이들은 윤리적으로 건전할 뿐만 아니라 배치 테스트 비용을 줄이고 결과 에 대한 시간을3주가아닌 시간으로 단축할 수 있습니다.

RABV 입자의 표면에서 당단백질은 트리메라 형태12,,13,,14,,15,,16을채택합니다. 광견병 백신에서, 이러한 네이티브 트리메릭 형태는VNAbs(17)를 유도하는 주요 면역원을 구성하는 반면, 단용성, 용해성 또는 변성당단백질은 면역원성이 불량한18,,19이다. 따라서, 백신 생산 공정에 따른 당단백질의 트리머의 보존은 최적의 면역원성 전위보존을 위한 좋은 지표이다. 항체 결합 시험20,,21,단일 방사형 면역이디퓨전(SRD) 시험22 및 ELISA 시험23,,24,,25,,26,,27과 같은 몇몇 면역화학적 방법은 광견병 백신의 항원 함량을 정량화하기 위해 WHO 기술 보고서 시리즈2 및 유럽 논문3에 의해 권장된다. 이들은 NIH 시험이 아직도 힘에 대하여 고려되더라도, 인간 백신28의, 배치의 일관된 배합을 평가하기 위하여 백신 생산의 일관성을 감시하기 위하여 제조자에 의해 이용됩니다.

그러나, 이러한 모든 면역 화학 적 방법은 동일하지 않습니다. 상기 SRD 시험은 막 고정 된 트리머를 변경하고 당단백질22,,29의용해성 또는 변성 형태를 초래할 수있는 전처리를 필요로한다. 따라서, SRD는 면역 원성 및 비 면역 원성 당단백질 사이의 차별에 많은 효율적이지 못하여 백신 부지의 면역 원내성에 대한 불완전한 평가를 초래한다. 대조적으로, ELISA 시험은22더 민감하고, 당단백질의 기본 구조를 보존하고, 당단백질의 기본적으로 접힌 삼량분의 함량을 결정하는 것이 더 적절하다. ELISA 시험은 토끼 폴리클로날 또는 마우스 단일클론 항당단백질 항체를 정제하거나 황산암모늄으로 농축하여 사용할 수 있다. 연구는 백신에서 ELISA에 의해 평가된 NIH 시험과 항원 함량 사이 좋은 일치를 보여주었고 ELISA 방법은 시험관 내 힘 시험에 적합하다는 결론을 내렸습니다. 이것은 ELISA 시험이 적어도 보충하거나 NIH 시험4,26,27,,,30,,31,,32,,33을대체할 지도 모른다는 것을 옹호합니다., 오늘, 유럽 약리학은 NIH 시험3에대한 대안으로 검증 된 혈청학 또는 면역 화학 분석법의 사용을 권장합니다. 백신 효능에 대한 동물 사용의 완전한 회피는 현실적인 관점이되었다.

하기 제시된 방법은 삼각약 RABV 당단백질15,,34의항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 마우스 단일클론 항체 클론(mAb-D1)을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포착에 기초한다. 이 방법은 처음에 개발되었다 연구소 파스퇴르26,30 다음 최적화 및 기관 국립 에 의해 검증 세큐리테 뒤 메디카멘트 et des produits 드 산테 (ANSM) 실험실, 즉, 프랑스 OMCL4,33. mAb-D1은 플레이트를 과민화하고 이어서 포획된 항원을 검출하기 위해 모두 사용된다. 이는 당단백질 트리머, 즉 면역원성 RABV 항원의 특이적 정량화를 허용한다. 검출에 사용되는 mAb-D1은 기질 및 크로모겐의 존재 에서 밝혀지는 과산화아제로 표지된다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다. RABV당단백질(35)의상이한 항원 부위를 인식하는 상이한 mAbs에 동일한 유형의 분석이 적용될 수 있다는 점에 유의한다. 상기 방법은 황산암모늄을 황산염 항당단백질 폴리클로날 토끼 G(IgG) 또는 모노클로날 마우스 글로불린으로 획득 및 정제 또는 농축하는방법(37)과 함께 이전에 광범위하게 기술되어 왔다37..

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Protocol

1. 보안 예방 조치

참고: 이 방법은 살아있는 RABV 및 불활성화 백신 모두에 적용됩니다.

  1. 좋은 실험실 실습 및 안전 절차를 사용하십시오.
  2. 일회용 코트, 장갑, 마스크, 안경 등을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
  3. 살아있는 바이러스가 적정되면, 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛을 사용한다.
    1. 시료(시약, 세척용액 등)와 접촉하는 모든 물질을 전염성 물질로 고려하십시오.
    2. 오염 물질을 표백제 용액(하이포아염소산나트륨 2,5%)에 30분 간 침지하여 오염물질을 제거합니다.
  4. 우수 실험실 관행에 따라 화학 물질을 취급하십시오.

2. 준비

  1. 가능한 한 분석 등급 시약을 사용하십시오.
  2. 코팅 버퍼/탄산염 버퍼, 패시베이션 버퍼, 희석제 및 구연산염 완충액(표1)의신선한 용액을 준비하고 0.45 또는 0.22 μm 필터를 통해 필터를 사용하고 분석 순도를 보존하기 위해 사용 하기 전 하루 동안 4 °C에 보관하십시오.
  3. 시약이 사용 30분 전에 실온(+18°C ~ +25°C)에 도달하도록 하고 사용하기 전에 부드럽게 혼합하여 균질화합니다.

3. 마이크로 플레이트 과민화

참고: 다량의 면역 글로불린을 결합하도록 최적화된 96개의 잘 흡착 면역 분석 판을 사용하십시오(예: 재료 표참조).

  1. 각각의 우물에, 탄산염 완충액에서 희석된 단일클론 항체(mAb-D1)의 200 μL을 첨가한다.
    참고: 약 1 μg/mL의 최적 농도가 실험적으로 결정되었으며 정제된 mAb-D1의 대략 1/2000 희석에 해당합니다. 이 권장 농도 각 mAb-D1 배치에 대 한 표시 하 고 주기적으로 긍정적인 제어와 확인 해야 합니다.
  2. 접착제 필름으로 플레이트를 덮고 가습 된 분위기에서 37 °C에서 3 시간 동안 마이크로 플레이트를 배양하십시오.
  3. 조심스럽게 흡입하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 잘 함량을 옮김을 옮김.
  4. 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 5 분 동안 건조시키십시오.

4. 마이크로 플레이트 패시베이션

  1. 각 우물에 패시베이션 버퍼의 300 μL을 추가합니다.
  2. 접착제 필름으로 플레이트를 덮고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
  3. 조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수용자에게 잘 함량을 옮김을 옮김.
  4. 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.
    참고: 마이크로플레이트는 사용 전까지 최대 3개월 동안 -20°C에서 즉시 사용하거나 밀봉하여 보관할 수 있습니다.

5. 엘리사 분석

참고: 참조 백신의 제어 곡선을 설정하기 위해 5.3 단계는 필요하지 않습니다. 시험된 백신을 적대하기 위해서는 모든 단계 5.1 ~ 5.6이 필요하다.

  1. 과민성 마이크로 플레이트의 세척
    1. 각 우물에 세척 버퍼의 300 μL을 추가합니다.
    2. 조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수용자에게 잘 함량을 옮김을 옮김.
    3. 5.1.1 단계와 5.1.2 단계를 5번 더 반복하여 감작 판을 광범위하게 세척합니다.
    4. 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.
  2. 대조군 곡선에 대한 기준 백신의 희석
    1. 광견병 바이러스 당단백질의 농도10 μg/mL에 해당하는 증류수의 1 mL에서 기준 백신(유효성 검사 항원 Lot 09)을 재구성한다.
    2. 광견병 바이러스 당단백질의 1 μg/mL에 도달하기 위해 희석제에서 재구성된 기준 백신의 10배 희석을 준비한다.
    3. 표 1에나타낸 바와 같이 희석제에서 이러한 기준 백신의 6개의 직렬 2배 희석을 준비한다.
    4. 희석제의 200 μL을 중복(wells 1H/2H)에 분배하여 블랭크 대조군으로 한다.
    5. 각 기준 백신 희석의 웰당 200 μL을 중복으로 분배합니다(우물 G1/G2에서 A1/A2).
  3. 적정에 대한 테스트 된 백신의 희석
    1. 희석제에서 시험된 백신의 10배 희석을 준비한다.
    2. 표 2에나타낸 바와 같이 희석액으로 시험된 백신의 7개의 2중 직렬 희석을 준비한다.
    3. 각 테스트 된 백신 희석의 웰 당 200 μL을 중복 (우물 H3 / H4에서 A3 / A4)을 분배하십시오.
  4. ELISA 플레이트의 인큐베이션/세척
    1. 미플레이트를 접착제 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    2. 필름을 제거하고 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 함량을 2,5 % 하이포 아염소산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 옮니다.
    3. 각각잘 300 μL의 세척 버퍼를 추가합니다.
    4. 조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 각 웰의 함량을 옮김.
    5. 5.4.3 단계 및 5.4.4 단계를 5회 반복하여 언바운드 항원을 제거하고 코팅된 항체(mAb D1)에 결합된 G 단백질 트리머를 보존한다.
    6. 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.
  5. 과산화아제 컨쥬게이드 mAb-D1의 결합
    1. 희석제(대략 1μg/mL의 대략 농도)에 과산화재 표지된 mAb-D1의 권장 희석(1/2000)의 웰당 200 μL을 분배합니다. 각 mAb-D1 배치에 대해 권장 농도가 표시되며 긍정적 인 대조군으로 주기적으로 검증되어야합니다.
    2. 미플레이트를 접착제 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. 필름을 제거하고 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 함량을 2,5 % 하이포 아염소산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 옮니다.
    4. 각각의 웰에, 300 μL의 세척 버퍼를 첨가한다.
    5. 조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 각 웰의 함량을 옮김.
    6. 5.5.4 단계 와 5.5.5 를 5 회 반복하여 언바운드 과산화아제 표지 항체 (mAb D1)를 제거합니다.
    7. 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.
  6. 기질 염색체를 이용한 계시
    1. 기질-크로모겐 용액의 웰당 200 μL을 분배합니다.
    2. 필름으로 마이크로 플레이트를 밀봉하고 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 황색-주황색은 결합된 과산화아제 표지 된 항체 (mAb D1)의 양에 비례하는 강도를 개발합니다.
    3. 잘 당 50 μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 중지합니다.
    4. 신중하게 마이크로 플레이트의 바닥을 닦아 모든 사용 웰의 492 nm에서 광학 밀도 (OD)를 결정하기 위해 분광광도계에 배치 : 음성 제어 (빈), 참조 백신 및 테스트 백신.
    5. 분석을 위해 .xls 또는 .xlsx 파일 형식으로 OD 데이터를 수집합니다.
  7. 광학 밀도(492 nm)의 함수로서 기준 백신 곡선, 트리메릭 당단백질 함량을 그립니다.
    1. 기준 백신의 다른 희석에서 각 중복에 대해 492 nm에서 평균 OD를 계산합니다(표 2의G1/G2에서 A1/A2까지)
    2. 계산된 각 평균 OD에서 공백의 평균 OD(표 2의웰, H1/H2)를 뺍니다.
    3. 수직 축(선형 눈금)에 결과 OD 값을 플롯하고 수평 축(로그가리축)에 당단백질 트리머(ng/mL)의 해당 농도를 플로팅합니다.
    4. 점을 결합하여 참조 곡선을그립니다(그림 1).

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Representative Results

다음 예에서 정제된 불활성화 광견병 바이러스 입자(PV 백신 균주)로 구성된 참조 백신 Lot 09가 사용된다. 이에 대한 당단백질 트리머(10 μg/mL) 함량은 총 바이러스 성 단백질(BCA 시험)의 측정 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 당단백질의 백분율의 평가 후에 확립되었다. 대안적으로, 교정된 기준 백신, 예를 들어, 광견병 백신에 대한 WHO6th 국제 표준(IS)(NIBSC 코드: 07/162)을 사용할 수 있다.

표 3은 전형적인 실험에 대한 OD 값(492 nm)을 나타낸다. 이러한 값을 사용하여, 기준 백신 곡선은 수직 축(선형 스케일)에 대한 기준 백신의 상이한 희석에서 평균 OD(공백의 평균 OD를 뺀)를 플로팅(1)하여 그려졌다; (2) 수평 축(로그계 척도)에서 당단백질 트리머(ng/mL)의농도(도 1).

시험된 백신의 당단백질 함량은 이러한 기준 백신 곡선과 비교하여 추정된다. 평가는 기준 백신 곡선의 선형 부분에서 평균 OD 값을 부여하는 시험된 백신의 희석에 대해 정확하다. 제시된실험(도 1)에서,선형 부분은 약 1~ 2 개의 OD(표3)이다.

1.534의 중복 시료에 대한 평균 OD를 가진 시험된 백신의 희석 1/40은 추가 평가를 위해 적색합니다. 이 OD가 기준 백신 곡선과 교차점까지 수평으로 플롯되면 x축의 수직 투영은 당단백질의 500 ng/mL에 해당합니다. 희석을 고려하여, 시험된 백신은

40 x 500 ng/mL = 트리메릭 당단백질의 20 μg/mL.

현재 RABV 당단백질 함량에 대한 ELISA 국제 단위는 없습니다. 그러나, 기준 백신의 생체 내 효능은 국제 단위(IU/mL)에서,제6차 WHO 국제 표준(NIBSC code: 07/162)에 비해 NIH 시험을 사용하여 확립되었다4. 따라서, 기준과 시험된 백신 사이의 평균 OD를 비교하면 시험된 백신의 트리메릭 당단백질 양을 측정할 수 없을 뿐만 아니라 동등한 국제 단위(EIU/mL)에서 추정된 시험관 내 효능을 평가합니다.

여기에 설명된 ELISA 방법을 사용하여, 프랑스 OMCL(ANSM)은 시장에서 방출되는 1000개 이상의 인간 광견병 백신의 당단백질 함량을 모니터링하고 제조업체의 사이트에서 수행된 NIH 시험과 비교하여4. NIH 시험의 높은 가변성은, 마우스 균주 및 도전절차(38)의이질성으로인해, 두 시험 사이의 통계적 상관관계를 방지하였다. 그러나, 결과 및 동일한 합격/불합격 결론의 프로파일에서 일치는 시험관 내 및 생체내검사4를사용하여 얻어졌다. 이러한 일치는 mAb-D1(34)34에의해 인식된34당단백질의 네이티브 트리머가백신접종 시 VNAbs를 유도하는 주요 광견병 바이러스 면역원(39)을 구성한다는 것을 확인한다.39 이 VNAbs는 NIH 시험의 대뇌 내 도전에서 마우스를 보호할 수 있습니다. 결론적으로, 광견병 당단백질 함량의 시험관내 평가는 광견병 백신 효능을 평가하는 NIH 시험에 대한 매력적인 대안이다.

버퍼 및 시약 준비
코팅 버퍼
(탄산염 완충액 50mM pH=9.6)		 원하는 pH(중탄산나트륨 약21/10부량)가 될 때까지 탄산나트륨 50mMM(Na2 CO 3-10H2O)을중탄산나트륨 50mM(NaHCO3)에첨가하십시오.3
패시베이션 버퍼 0.3% 소 세럼 알부민 (BSA, 분수 V), 5 % 탄산염 버퍼 50mM pH 9.6에서 자당
10x 인산염 완충 식염수 pH=7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g을 증류수 1L에.4 4N NaOH로 pH=7 조정
세척 버퍼 0.05% 1x PBS에서 트웬
희석제                                                  0.5% 소 혈청 알부민 (분수 V), 0.05% 1 x PBS에서 트웬 (BSA에 의한 산성화로 인해 pH를 7로 조정)
시산염 완충제 pH-5.6
(과산화아제 기판용)		 구연산 나트륨-2H2O(Na3C6H5O7-2H20), 증류수 1L에 2.17 g 구연산-1H20
기질 염색체 용액 50 mg 직교-페닐렌 디아민 정제, 0.1% 과산화수소 30% (110 vol) 25 ml 구연산염 완충제 pH 5.6
스톱 솔루션
(4N 황산)		 80ml의 냉각 된 증류수에 10 ml H2SO4 36N. 희석은 얼음 욕조에서 수행해야합니다.

표 1. 분석에 사용되는 버퍼입니다.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A. 참조 백신 1/640 참조 백신 1/640 테스트 된 백신 1/1280 테스트 된 백신 1/1280
B 참조 백신 1/320 참조 백신 1/320 테스트 된 백신 1/640 테스트 된 백신 1/640
C 참조 백신 1/160 참조 백신 1/160 테스트 된 백신 1/320 테스트 된 백신 1/320
D 참조 백신 1/10 참조 백신 1/10 테스트 된 백신 1/160 테스트 된 백신 1/160
전자 참조 백신 1/40 참조 백신 1/40 테스트 된 백신 1/80 테스트 된 백신 1/80
F 참조 백신 1/20 참조 백신 1/20 테스트 된 백신 1/40 테스트 된 백신 1/40
G 참조 백신 1/10 참조 백신 1/10 테스트 된 백신 1/20 테스트 된 백신 1/20
H 빈 빈 테스트 된 백신 1/10 테스트 된 백신 1/10
레퍼런스 백신 Lot 09 희석 농도(ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

표 2: 광견병 당단백질 적정 분석 및 희석을 위한 마이크로플레이트 계획 분석실험에 사용되는 참조 및 시험된 백신.

레퍼런스 백신 Lot 09 희석 농도(ng/mL) 테스트된 백신 희석 OD 열 1 OD 열 2 OD 평균 기준 OD 평균- 빈 OD 평균
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
빈 빈 1/10 0.078 0.087 0.0825

표 3. 기준 곡선을 플로팅하기 위해 OD492 nm에서 얻은 결과

Figure 1
도 1: 기준 백신에 대한 광학 밀도(492 nm)의 함수로서 트리메릭 당단백질 함량을 나타내는 기준 곡선.

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Discussion

mAb-D1에 의해 인식된 에피토프는 RabV 당단백질의 항원 부위 III에 위치하며 이는 VNAbs의 유도를 위한 면역 지배적일 뿐만 아니라 또한 신경성, 병원성40,,41 및 수용체인식에관여한다. 당단백질, 부위 II43을따라 또 다른 중요한 항원 부위가 있는데, 이에 대해 mAb-WI-111235와같은 여러 MAb가 분리되었다. 이들은 또한 실험의 유사한 모형에서 이용될 수 있습니다.

ELISA에 의한 이러한 시험관내 방법의 한 가지 제한은 시험될 광견병 바이러스 균주에 사용된 mAb에 의해 인식되는 에피토프의 필요한 보존에 상주한다. 지금까지, 인간 광견병 백신에 사용되는 모든 고전적인 긴장은 mAb-D1에 의해 인식됩니다. 동물 백신에 사용되는 광견병 균주의 다양성은 미래에 문제가 될 수 있습니다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 동일한 분석기는 코팅 및 검출을 위한 RABV 당단백질의 상이한 항원 부위를 인식하는 상이한 mAbs를 사용하여 적용될 수 있다. 이렇게하면 문제35를우회 할 수 있습니다.

이 방법의 또 다른 민감한 점은, RABV 당단백질의 삼분체 형태를 정량화하고, 가역적 형태변환(14)에대한 pH 및 온도의 가능한 효과이다. 이러한 매개 변수는 제안된 프로토콜에서 고려됩니다.

요약하면, 생체외 ELISA 방법에 의해 올바르게 접힌 당단백질 삼량체의 고면역원성 에피토프의 정량화는 광견병 바이러스 감염에 대한 체액성 면역을 유도하는 백신 배치의 용량을 측정하는 NIH 시험만큼 효과적이게 나타난다. 또한, ELISA 방법은 강력한것들4,35에서품질 또는 양에서, 하위 강력한 백신 제비를 구별 할 수 있습니다. NIH 시험을 대체하기 위하여 시험관 내 ELISA 분석실험을 제안하기 전에 마지막 단계는 그것의 개선 그리고 표준화를 위한 국제적인 협력 적인 연구 결과의 조직입니다.

대체 방법의 유효성 검사에 대한 기관 간 조정위원회의 워크샵 (ICCVAM) 백신 효능 및 안전 성 시험에서 동물의 사용을 줄이고, 정제하고, 대체하는 대체 방법에 대한 국제 워크샵 (Ames, 2010년 9월 2010)44, NIH 시험은 백신 면역 원산성 및 백신 면역 원산성을 평가하는 대체 시험관 내 시험시험으로 대체되어야 한다는 결론을) 내렸습니다.4 2012년45년 유럽 동물 실험 대안 파트너십(EPAA)의 또 다른 워크숍에서는 현재의 국제 광견병 기준 표준에 대해 보정된 표준화된 샌드위치 ELISA가 광견병 백신 효능 테스트를 위한 이상적인 대안이 될 것이라고 결정했습니다. 다음, 제조 업체와 규제 기관을 모두 포함하는 국제 공동 사전 검증 연구는 다른 백신브랜드35에서강력한 배치에서 하위 강력한 구별 할 수있는 능력에 대한 배치 릴리스에 대한 제조 업체와 국가 제어 연구소에서 사용하는 다양한 ELISA 디자인을 비교했다. mAb-D1 (항원 사이트 III)와 다른 mAb-WI-1112 (항원 사이트 II)를 결합한 ELISA 디자인은 생물학적 표준화 프로그램 (BSP)의 우산 아래 향후 국제 공동 연구를 위해 의약품 및 건강 관리 (EDQM)의 품질에 대한 유럽 이국에 의해 제안되었습니다. 이는 (1) 마이크로플레이트 코팅 및 검출을 위한 여러 조합의 mAbs가 생체내 NIH 시험에 대한 시험관내 대안으로서 사용될 수 있고(2) 이들 조합이 시험되는 RABV 백신 균주에 의존될 수 있음을 보여준다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

실비 모르게오 박사와 장 미셸 채프살 박사는 백신 배치에 대한 ELISA 분석 결과를 확립하고 국제 워크샵 및 공동 연구를 조직하기 위해 주요 참여를 인정받아야 합니다. 우리는 원고의 비판적 독서사브리나 칼리에게 감사드립니다. 피에르 페린 박사는 mAb-D1의 격리와 특성화를 담당했습니다. 이 작품은 주로 인스티투트 파스퇴르 자금조달에 의해 지원되고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

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References

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면역학 및 감염 문제 159 광견병 백신 효능 NIH 테스트 ELISA 방법 mAb-D1 단일 클론 항체 당단백질 트리머 당단백질 함량
광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트
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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

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