Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunfangst til bestemmelse af det immunogene glycoprotein indhold i rabiesvacciner. Denne test bruger en neutraliserende Monoklonal Antistof (mAb-D1) genkende glycoprotein trimers. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for at følge konsistensen af vaccinestyrken under produktionen.

Abstract

Den voksende globale bekymring for dyrevelfærden tilskynder fabrikanter og de nationale kontrollaboratorier til at følge 3Rs-strategien for erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg. Det anbefales at udvikle in vitro-tilgange på WHO-plan og på europæisk plan som alternativer til NIH-testen til vurdering af rabiesvaccinestyrken. På overfladen af rabiesvirus (RABV) partikel, trimningaf glycoprotein udgør den største immunogen til at fremkalde Viral Neutraliserende Antistoffer (VNAbs). En ELISA-test, hvor neutraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) genkender glycoproteinets trimeriske form, er blevet udviklet til at bestemme indholdet af det oprindelige foldede trimeric glycoprotein sammen med produktionen af vaccinebatcherne. Denne in vitro-styrketest viste en god overensstemmelse med NIH-testen og er fundet egnet i kollaborative forsøg udført af RABV-vaccineproducenter og OMCL'er. Undgåelse af anvendelse af dyr er et opnåeligt mål i den nærmeste fremtid.

Den præsenterede metode er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af mAb-D1, som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein, dvs. mAb-D1 anvendes til både overfladebehandling og påvisning af glycoproteintrimere, der findes i vaccinebatchen. Da epitop er anerkendt på grund af dens konformationelle egenskaber, den potentielt denatureret glycoprotein (mindre immunogenic) kan ikke tilfangetages og detekteres af mAb-D1. Den vaccine, der skal testes, inkuberes i en plade, der er sensibiliseret med mAb-D1. Bundne trimeric RABV glycoproteiner identificeres ved at tilføje mAb-D1 igen, mærket med peroxidase og derefter afsløret i nærvær af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein.

Introduction

Siden mere end 50 år, nih test1 bruges som en guld standard metode til at vurdere rabies vaccine potens før batch frigivelse. Denne test består af en intraperitoneal immunisering af grupper af mus med den vaccine, der skal testes efterfulgt af en intracerebral (IC) udfordring 14 dage senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme af rabiesvirus (RABV). Styrken vurderes ud fra andelen af mus, der overlever IC-udfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 stadig kræver NIH-testen til vurdering af vaccinens styrke, lider denne test under flere forhindringer: resultaterne er meget variable4; infektiøs RABV anvendes under udfordringen, og dette kræver både tekniske færdigheder og strenge biosikkerhedsforanstaltninger; der anvendes et stort antal dyr, og udfordringens alvor giver anledning til alvorlige etiske betænkeligheder5. En mindre alvorlig variation af denne test er blevet udviklet: to uger efter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke udfordret af IC, men blødte og testet for tilstedeværelsen af specifikke RABV neutraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjælp af en in vitro-neutralisering test. Denne test kræver dog stadig at ofre et stort antal laboratoriemus, selv om den allerede er i brug for veterinærvaccinerne6,7 og er blevet overvejet til humane vacciner8.

Fra nu af opfordrer både internationale9 og europæiske10-anbefalinger fabrikanter og nationale kontrollaboratorier (officielle lægemiddelkontrollaboratorier - OMCL'er) til at gennemføre erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg, der kaldes 3Rs-strategien. Det europæiske direktiv 2010/63/EU (gældende siden 2013/01/01) vedrørende beskyttelse og velfærd for dyr har også skærpet begrænsningerne for vaccineproducenter og -laboratorier, der er involveret i kvalitetskontrol af rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som følge heraf er udvikling, validering og anvendelse af alternative in vitro-tilgange nu blevet en prioritet. Disse er ikke kun etisk forsvarlige, men kan også reducere batchtestomkostningerne og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uge3.

På overfladen af RABV-partiklen, glycoprotein vedtager en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaccine udgør denne oprindelige trimeriske form den vigtigste immunogeninducerende VNAbs17, mens monomeriske, opløselige eller denaturerede glycoproteiner er dårligt immunogene18,19. Således er bevarelsen af glycoproteinafet langs vaccineproduktionsprocessen en god indikator for bevarelsen af et optimalt immungent potentiale. Flere immunokemiske metoder, såsom antistofbindingstest20,21, enkeltradial immundiffusion (SRD) test22 og ELISA-test23,,24,,25,26,27, anbefales af WHO's tekniske rapport serie2 og den europæiske monografi3 for at kvantificere antigenindholdet i rabiesvacciner. Disse anvendes af producenterne til at overvåge sammenhængen i vaccineproduktionen og af OMCL til at vurdere den konsekvente formulering af partier af humane vacciner28, selv om NIH-testen stadig tages i betragtning til styrken.

Men alle disse immunokemiske metoder er ikke ækvivalente. SRD-testen kræver en forbehandling , som kan ændre de membranforankrede trimler og resultere i en opløselig eller denatureret form af glycoprotein22,29. Derfor er SRD ikke meget effektiv til at diskriminere mellem immungene og ikke-immungene glycoproteiner, hvilket resulterer i en ufuldstændig vurdering af immunogeniciteten af et vaccineparti. I modsætning hertil er ELISA-testen mere følsom22, bevarer glycoproteinets oprindelige struktur og er mere hensigtsmæssigt at bestemme indholdet af de oprindeligt foldede trimmere af glycoprotein. ELISA-testen kan anvende enten kaninpolyklonale eller mus monoklonale anti-glycoprotein antistoffer renset eller koncentreret med ammoniumsulfat. Undersøgelser har vist god overensstemmelse mellem NIH-testen og det antigenindhold, som ELISA har evalueret i vacciner, og konkluderet, at ELISA-metoder er egnede til in vitro-styrketesten. Dette slår til lyd for , at ELISA-test i det mindste kan supplere eller endog erstatte NIH-test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den Europæiske Farmakopé, at der anvendes validerede serologiske eller immunokemiske analyser som alternativer til NIH-test3. Den fuldstændige undgåelse af dyrs anvendelse til vaccinepotens er blevet et realistisk perspektiv.

Metoden nedenfor er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af en monoklonal antistofkloning af mus (mAb-D1 ), som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein15,34. Denne metode blev oprindeligt udviklet på Institut Pasteur26,30 ogderefter optimeret og valideret af Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratoriet,dvs.4, MAb-D1 anvendes både til sensibilisering af pladen og efterfølgende til detektering af det tilfangetagne antigen. Dette giver mulighed for specifik kvantificering af glycoproteintrimere, dvs. Den mAb-D1, der anvendes til påvisning, er mærket med peroxidase, som afsløres ved tilstedeværelse af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein. Det skal bemærkes, at den samme type analyse kan anvendes til forskellige mAbs, der genkender forskellige antigene steder af RABV glycoprotein35. Metoden til at opnå og rense eller koncentrere sig med ammoniumsulfat anti-glycoprotein polyklonale kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonale mus globuliner er blevet udførligt beskrevet tidligere36 sammen med metoden til at konjugere antistoffer med peroxidase37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sikkerhedsforanstaltninger

BEMÆRK: Denne metode gælder for både levende RABV og inaktiveret vaccine.

  1. Brug gode laboratoriepraksis- og sikkerhedsprocedurer.
  2. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr (PPE), herunder engangscoat, handsker, maske, briller osv.
  3. Når den levende virus titreres, skal du bruge et biologisk sikkerhedsskab i klasse II.
    1. Betragt ethvert materiale, der er i kontakt med prøverne (reagenser, vaskeopløsninger osv.), som infektiøs materiale.
    2. Det kontaminerede materiale behandles ved nedsænkning i blegemiddelopløsningen (2,5 % af natriumhypochlorit) i 30 minutter for dekontaminering.
  4. Håndter kemikalier i overensstemmelse med god laboratoriepraksis.

2. Forberedelse

  1. Brug reagenser af analytisk kvalitet, hvor det er muligt.
  2. Der fremstilles friske opløsninger af belægningsbufferen/karbonatbufferen, passiveringsbufferen, fortyndings- og citratbufferen (tabel 1), filtreres gennem 0,45- eller 0,22 μm filtre, og der opbevares ved 4 °C i en dag før anvendelse for at bevare deres analytiske renhed.
  3. Reagenser kan nå op på rumtemperaturen (+18 °C til +25 °C) 30 min før brug og homogeniseres ved forsigtig blanding før brug.

3. Microplate sensibilisering

BEMÆRK: Brug 96 brøndadsorptionsimmunassayplader, som er optimeret til at binde store Table of Materialsmængder immunglobuliner (f.eks.

  1. Til hver brønd tilsættes 200 μL af det monoklonale antistof (mAb-D1), der er fortyndet i karbonatbufferen.
    BEMÆRK: En optimal koncentration på ca. 1 μg/ml er eksperimentelt bestemt og svarer til en omtrentlig 1/2000 fortynding af den rensede mAb-D1. Denne anbefalede koncentration er indiceret for hvert mAb-D1-parti og skal regelmæssigt verificeres med positiv kontrol.
  2. Pladen dækkes med en klæbefilm, og mikropladen indsuges i 3 timer ved 37 °C i en befugtet atmosfære.
  3. Omhyggeligt aspirere og overføre brøndindholdet til en modtager, der indeholder 2,5% natrium hypochlorit opløsning.
  4. Inverter mikropladen, og lad den tørre på et adsorbent papir ved stuetemperatur i 5 min.

4. Microplate passivitet

  1. Til hver brønd tilsættes 300 μL af passivationsbufferen.
  2. Pladen dækkes med en selvklæbende film, og inkuber i 30 min ved 37 °C.
  3. Aspirere omhyggeligt og overføre brøndindholdet til en modtager, der indeholder 2,5% natriumhypochlorit opløsning.
  4. Inverter mikropladen, og lad den tørre på et adsorbent papir ved stuetemperatur i 1 min.
    BEMÆRK: Mikropladen kan straks anvendes eller opbevares forseglet ved -20 °C i op til 3 måneder, indtil den tages i brug.

5. ELISA-analyse

BEMÆRK: For at fastlægge referencevaccinens kontrolkurve er trin 5.3 ikke påkrævet. for at titrere den testede vaccine alle trin 5.1 til 5.6 er nødvendige.

  1. Vask af den sensibiliserede mikroplade
    1. Til hver brønd tilsættes 300 μL vaskebufferen.
    2. Aspirere omhyggeligt og overføre brøndindholdet til en modtager, der indeholder 2,5% natriumhypochlorit opløsning.
    3. Trin 5.1.1 og 5.1.2 gentages fem gange mere for at vaske den sensibiliserede plade grundigt.
    4. Inverter mikropladen, og lad den tørre på et adsorbent papir ved stuetemperatur i 1 min.
  2. Fortyndinger af referencevaccinen til kontrolkurven
    1. Refremstille referencevaccinen (valideringsantigen parti 09) i 1 ml destilleret vand svarende til en koncentration på 10 μg/ml rabiesvirusglycoprotein.
    2. Der fremstilles en tifolden fortynding af den rekonstituerede referencevaccine i fortyndingsmiddel et mål for at nå op på 1 μg/ml rabiesvirusglycoprotein.
    3. 6 serielle tofoldsfortyndinger af denne referencevaccine fremstilles i fortyndingsmiddel som angivet i tabel 1.
    4. 200 μL af fortyndingsværktøjet fordeles i to eksemplarer (brønde 1H/2H) for at fungere som blindkontrol.
    5. 200 μL pr. brønd af hver referencevaccinefortynding fordeles i to eksemplarer (brøndene G1/G2 til A1/A2).
  3. Fortyndinger af den testede vaccine for dens titrering
    1. Der fremstilles en tiganges fortynding af den testede vaccine i fortyndingsvaccinen.
    2. Der fremstilles syv dobbelt så store seriefortyndinger af den testede vaccine i fortyndingsmiddel som angivet i tabel 2.
    3. 200 μL pr. brønd af hver testet vaccinefortynding i to eksemplarer (brøndene H3/H4 til A3/A4).
  4. Inkubation/vask af ELISA-pladen
    1. Mikropladen tildækkes med en selvklæbende film og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    2. Fjern filmen, aspirere omhyggeligt og overføre indholdet af hver brønd til en modtager, der indeholder 2,5% natrium hypochlorit opløsning.
    3. Til hver brønd tilsættes 300 μL vaskebuffer.
    4. Aspirere omhyggeligt og overføre indholdet af hver brønd til en modtager, der indeholder 2,5% natrium hypochlorit opløsning.
    5. Trin 5.4.3 og 5.4.4 gentages fem gange for at fjerne det ubundne antigen og bevare g-proteintrimmere, der er bundet til det belagte antistof (mAb D1).
    6. Inverter mikropladen, og lad den tørre på et adsorbent papir ved stuetemperatur i 1 min.
  5. Binding af peroxidase konjugeret mAb-D1
    1. 200 μL pr. brønd af den anbefalede fortynding (1/2000) af peroxidasemærket mAb-D1 i fortyndingsmiddel (omtrentlig koncentration på 1μg/ml). En anbefalet koncentration er indiceret for hvert mAb-D1-parti og skal regelmæssigt verificeres med positiv kontrol.
    2. Mikropladen tildækkes med en selvklæbende film og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    3. Fjern filmen, aspirere omhyggeligt og overføre indholdet af hver brønd til en modtager, der indeholder 2,5% natrium hypochlorit opløsning.
    4. Der tillægges 300 μL vaskebuffer til hver brønd.
    5. Aspirere omhyggeligt og overføre indholdet af hver brønd til en modtager, der indeholder 2,5% natrium hypochlorit opløsning.
    6. 15.5.4 og 5.5.5 fem gange for at fjerne ubundet peroxidasemærket antistof (mAb D1).
    7. Inverter mikropladen, og lad den tørre på et adsorbent papir ved stuetemperatur i 1 min.
  6. Åbenbaring ved hjælp af et substrat-kromogen
    1. 200 μL pr. brønd af substrat-kromogenopløsning fordeles.
    2. Forsegl mikropladen med en film og inkuberi i mørke ved stuetemperatur i 30 min. En gul-orange farve udvikler intensiteten af som er proportional med mængden af bundet peroxidase-mærket antistof (mAb D1).
    3. Undgå reaktionen ved at tilsætte 50 μL stopopløsning pr. brønd.
    4. Tør forsigtigt bunden af mikropladen og anbring den i et spektrofotometer for at bestemme den optiske massefylde (OD) ved 492 nm af alle brugte brønde: negativ kontrol (tom), referencevaccine og testet vaccine.
    5. Indsaml OD-data som .xls- eller .xlsx-filformat til analyse.
  7. Der tegnes referencevaccinekurven, det trimriske glycoproteinindhold, som en funktion af optisk tæthed (492 nm)
    1. Middel-OD beregnes ved 492 nm for hver duplikat ved de forskellige fortyndinger af referencevaccinen (brøndene G1/G2 til A1/A2 i tabel 2)
    2. Træk den gennemsnitlige OD for Blindprøven (brønde, H1/H2 i tabel 2) fra hver beregnet middel-OD.
    3. De resulterende OD-værdier afbildes på den lodrette akse (lineær skala) og den tilsvarende koncentration i glycoproteintrimere (ng/ml) på den vandrette akse (logaritmisk skala).
    4. Tegn referencekurven ved sammenføjningspunkter (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I følgende eksempel anvendes referencevaccinen Lot 09, der består af renset inaktiverede rabiesviruspartikler (PV vaccine stamme). Glycoproteintrimersindholdet (10 μg/ml) i dette er blevet fastlagt efter bestemmelse af den samlede mængde virale proteiner (BCA-test) og vurdering af procentdelen af glycoprotein ved SDS-polyacrylamid gel elektroforese. Alternativt kan der anvendes en kalibreret referencevaccine,th f.eks.

Tabel 3 viser OD-værdierne (492 nm) for et typisk eksperiment. Ved hjælp af disse værdier blev referencevaccinekurven tegnet ved at plotte (1) den gennemsnitlige OD (minus den gennemsnitlige OD for blindprøven) ved de forskellige fortyndinger af referencevaccinen på den lodrette akse (lineær skala). 2) koncentrationen af glycoproteintrimorerne (ng/ml) på den vandrette akse (logaritmisk skala) (figur 1).

Glycoproteinindholdet i den testede vaccine estimeres i forhold til denne referencevaccinekurve. Evalueringen er præcis for fortyndingen af den testede vaccine, hvilket giver en gennemsnitlig OD-værdi i den lineære del af referencevaccinekurven. I det præsenterede eksperiment (Figur 1) er den lineære del fra ca. 1 til 2 OD (tabel 3).

Fortyndingen 1/40 af den testede vaccine med en gennemsnitlig OD for duplikerede prøver på 1,534 er derefter egnet til yderligere evaluering. Når denne OD afbildes vandret op til skæringspunktet med referencevaccinekurven, svarer den lodrette projektion på x-aksen til 500 ng/ml glykoprotein. I betragtning af fortyndingen indeholder den testede vaccine

40 x 500 NG/ml = 20 μg/ml trimeret glycoprotein.

I øjeblikket er der ingen international ELISA-enhed for RABV glycoproteinindhold. Referencevaccinens in vivo-styrke i internationale enheder (IU/ml) er imidlertid blevet fastlagt ved hjælp af NIH-testen i forhold til 6 th WHOInternational Standard (NIBSC-kode: 07/162)4. Sammenligningen af de gennemsnitlige OD'er mellem referencen og den testede vaccine gør det derfor ikke blot muligt at måle den testede vaccines trimeriske glycoproteinmængde, men også evaluerer den in vitro-styrke, der er anslået i ækvivalent international enhed (EIU/ml).

Ved hjælp af den eLISA-metode, der er beskrevet her, har den franske OMCL (ANSM) overvåget indholdet af glycoprotein i mere end 1000 partier rabiesvaccine hos mennesker, der skal frigives på markedet, og har sammenlignet med den NIH-test, der udføres på producentens sted4. Nih-testens høje variabilitet på grund af heterogeniteten i musstammen og challenge procedure38forhindrede en statistisk korrelation mellem de to test. Der blev imidlertid opnået en konkordans i resultatprofilen og de samme konklusioner om bestået/ikke-bestået ved hjælp af in vitro- og in vivo-analyser4. Denne konkordans bekræfter, at de indfødte trimningsmaskiner af glycoprotein anerkendt af mAb-D134,39 udgør de vigtigste rabiesvirus immunogen inducerende VNAbs under vaccination17. Disse VNAbs er i stand til at beskytte mus mod den intra-cerebrale udfordring af NIH-testen. Det kan konkluderes, at in vitro-vurderingen af indholdet af rabiesglycoprotein er et attraktivt alternativ til NIH-testen, der evaluerer rabiesvaccinestyrken.

Buffere og reagenser Under forberedelse
Buffer til overfladebehandling
(Karbonatbuffer 50 mM pH=9,6)		 Natriumcarbonat 50 mM (Na2CO3-10H2O) til natriumbikarbonat 50 mM (NaHCO3)indtil den ønskede pH (ca. 1/10 volumen natriumbikarbonat)
Buffer til passivering 0,3% Kvæg Serum Albumin (BSA, fraktion V), 5% saccharose i karbonatbuffer 50 mM pH 9,6
10x Fosfat buffered saltvand pH=7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g i 1L destilleret vand. Juster pH=7 med 4N NaOH
Vaskebuffer 0.05% Tween i 1x PBS
Fortyndingsmiddel                                                  0,5% Kvæg Serum Albumin (Fraktion V), 0,05% Tween i 1x PBS (juster pH til 7 på grund af forsuring af BSA)
Citratbuffer pH-5.6
(for peroxidase substrat)		 11,67 g Tri-natriumcitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g Citronsyre-1H20 i 1 L destilleret vand
Opløsning af substrat-kromogen 50 mg Ortho-phenylen diamin tablet, 0,1% Hydrogenperoxid 30% (110 vol) i 25 ml Citrat buffer pH 5,6
Stop løsning
(4N svovlsyre)		 10 ml H2SO4 36N i 80 ml afkølet destilleret vand. Fortynding skal udføres i et isbad

Tabel 1. Buffere, der anvendes i analysen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Vaccine 1/640 Ref. Vaccine 1/640 Testet Vaccine 1/1280 Testet Vaccine 1/1280
B Ref. Vaccine 1/320 Ref. Vaccine 1/320 Testet Vaccine 1/640 Testet Vaccine 1/640
C Ref. Vaccine 1/160 Ref. Vaccine 1/160 Testet vaccine 1/320 Testet vaccine 1/320
D Ref. Vaccine 1/10 Ref. Vaccine 1/10 Testet Vaccine 1/160 Testet Vaccine 1/160
E Ref. Vaccine 1/40 Ref. Vaccine 1/40 Testet Vaccine 1/80 Testet Vaccine 1/80
F Ref. Vaccine 1/20 Ref. Vaccine 1/20 Testet vaccine 1/40 Testet vaccine 1/40
G Ref. Vaccine 1/10 Ref. Vaccine 1/10 Testet vaccine 1/20 Testet vaccine 1/20
H Tom Tom Testet vaccine 1/10 Testet vaccine 1/10
Referencevaccine Lot 09 fortynding Koncentration (ng/ml)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabel 2: Mikropladeplan for rabiesglycoproteintitreringsanalyse og fortyndinger for reference- og testede vacciner, der anvendes i analysen.

Referencevaccine Lot 09 fortynding Koncentration (ng/ml) Testet vaccinefortynding OD kolonne 1 OD kolonne 2 OD-gennemsnit Reference OD gennemsnit- Tom OD gennemsnit
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Tom Tom 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tabel 3. Resultater opnået ved OD492 nm til plotning af referencekurven

Figure 1
Figur 1: Referencekurve, der viser indholdet af trimeretglycoprotein som funktion af den optiske massefylde (492 nm) for referencevaccinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den epitop, der genkendes af mAb-D1, er placeret på det antigene sted III i RABV glycoprotein, som ikke kun er immunodominerende for induktion af VNAbs, men også involveret i neurovirulence, patogenicitet40,41 og receptorgenkendelse42. Der er en anden vigtig antigen site langs glycoprotein, site II43, mod hvilken flere MAbs er blevet isoleret såsom mAb-WI-111235. Disse kan også bruges i den lignende type eksperimenter.

En begrænsning af denne in vitro-metode ved ELISA er den nødvendige bevarelse af den epitop, der er anerkendt af den anvendte mAb for den rabiesvirusstamme, der skal testes. Indtil nu er alle de klassiske stammer, der anvendes til humane rabiesvacciner, anerkendt af mAb-D1. Den større mangfoldighed af rabiesstammer, der anvendes i dyrevacciner, kan udgøre et problem i fremtiden. Men, som tidligere nævnt, den samme analyse kan anvendes ved hjælp af forskellige mAbs genkende forskellige antigene steder af RABV glycoprotein til belægning og påvisning. Dette vil gøre det muligt at omgå problemet35.

Et andet følsomt punkt i denne metode, kvantificering af den trimriske form af RABV glycoprotein, er den mulige virkning af pH og temperatur på reversible kropsbygning konvertering14. Disse parametre tages i betragtning i den foreslåede protokol.

Sammenfattende forekommer kvantificering af en meget immunogen epitop af korrekt foldede glycoproteintrimere ved in vitro ELISA-metoden lige så effektiv som NIH-testen til at måle en vaccinebatchs evne til at fremkalde humoral immunitet mod rabiesvirusinfektion. Desuden kan ELISA-metoden diskriminere subpotente vaccinepartier, i kvalitet eller kvantitet, fra de potente4,35. Det sidste skridt, før foreslå en sådan in vitro ELISA-analyse til at erstatte NIH test er tilrettelæggelsen af en international kollaborativ undersøgelse for dens forbedring og standardisering.

En workshop i Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) med titlen International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, september 2010)44, konkluderede, at NIH-testen bør erstattes af en alternativ in vitro-test, der evaluerer vaccinens immunogenicitet og kan diskriminere mellem potente og subpotente partier4.) En anden workshop i Det Europæiske Partnerskab for Alternativer til Dyreforsøg (EPAA) i 201245 besluttede, at en standardiseret sandwich-ELISA, der er kalibreret i forhold til den nuværende internationale rabiesreferencestandard, ville være et ideelt alternativ til test af rabiesvaccinens styrke. Efter, en international kollaborativ præ-validering undersøgelse, som omfattede både producenter og regulerende organer, sammenlignet forskellige ELISA design, der anvendes af producenterne og deres nationale kontrollaboratorier for batch frigivelse for deres evne til at diskriminere sub-potent fra potente partier fra forskellige vaccine mærker35. Det Europæiske Direktorat for Lægemiddelkvalitet (EDQM) har foreslået et ELISA-design, der kombinerer mAb-D1 (antigene lokalitet III) og en anden mAb-WI-1112 (antigen lokalitet II) til en kommende international samarbejdsundersøgelse under paraplyen af det biologiske standardiseringsprogram (BSP). Dette viser (1), at flere kombinationer af mAbs til mikropladebelægning og detektion kan anvendes som et in vitro-alternativ til in vivo NIH-testen, og (2) at disse kombinationer kan være afhængige af den RABV-vaccinestamme, der skal testes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal skal anerkendes for deres centrale deltagelse for at etablere ELISA-analysen om vaccinepartier og for at organisere internationale workshops og samarbejdsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk læsning af manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolering og karakterisering af mAb-D1. Dette arbejde er hovedsagelig blevet støttet af Institut Pasteur finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Immunologi og infektion Problem 159 Rabiesvaccinestyrke NIH-test ELISA-metode mAb-D1 monoklonalt antistof Trimers af glycoprotein glycoproteinindhold
In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter