Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Här beskriver vi en indirekt ELISA sandwich immunocapture att bestämma immunogenic glykoprotein innehållet i rabies vacciner. Detta test använder en neutraliserande monoklonal antikropp (mAb-D1) som känner igen glykoproteintrimmers. Det är ett alternativ till in vivo NIH-testet att följa konsistensen av vaccinpotens under produktionen.

Abstract

Den växande globala oron för djurens välbefinnande uppmuntrar tillverkare och nationella kontrolllaboratorier att följa 3R-strategin för ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjursförsök. Utveckling av in vitro-metoder rekommenderas på WHO-nivå och europeisk nivå som alternativ till NIH-testet för utvärdering av rabiesvaccinpotensen. På ytan av rabiesvirus (RABV) partikel, trimers av glykoprotein utgör de viktigaste immunogen att inducera viral neutraliserande antikroppar (VNAbs). Ett ELISA-test, där neutraliserande monoklonala antikroppar (mAb-D1) känner igen den trimeriska formen av glykoproteinet, har utvecklats för att bestämma innehållet i det inbyggda vikta trimeric glykoproteinet tillsammans med produktionen av vaccinsatserna. Detta in vitro-potenstest visade en god överensstämmelse med NIH-testet och har befunnits lämpligt i samarbetsstudier av RABV vaccintillverkare och OMCLs. Undvikande av djuranvändning är ett uppnåeligt mål inom en snar framtid.

Den metod som presenteras är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av mAb-D1 som erkänner antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein, dvs immunogenic RABV antigen. mAb-D1 används för både beläggning och detektion av glykoproteintrimmer som finns i vaccinpartiet. Eftersom epitopet är erkänt på grund av dess konformationsegenskaper, kan det potentiellt denaturerade glykoproteinet (mindre immunogent) inte fångas upp och detekteras av mAb-D1. Vaccinet som ska testas inkuberas i en plattsensibiliserad med mAb-D1. Bundna trimeric RABV glykoproteiner identifieras genom att lägga till mAb-D1 igen, märkt med peroxidas och sedan avslöjas i närvaro av substrat och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten.

Introduction

Sedan mer än 50 år används NIH-testet1 som en guldstandardmetod för att utvärdera rabiesvaccinpotensen innan partiet släpps ut. Detta test består av en intraperitoneal immunisering av grupper av möss med det vaccin som ska testas följt av en intra-cerebral (IC) utmaning 14 dagar senare med Challenge Virus Standard (CVS) stam av rabiesvirus (RABV). Styrkan utvärderas från andelen möss som överlever IC-utmaningen. Även om WHO2 och European Pharmacopeia3 fortfarande kräver NIH-testet för att bedöma vaccinets styrka, lider detta test av flera hinder: resultaten är mycket varierande4; Infektiös RABV används under utmaningen och detta kräver både teknisk skicklighet och stränga åtgärder för biosäkerhet. ett stort antal djur används, och utmaningens allvar ger upphov till allvarliga etiska betänkligheter5. En mindre allvarlig variation av detta test har utvecklats: två veckor efter den intra peritoneala immuniseringen utmanas möss inte av IC utan avblodas och testas för förekomst av specifika RABV-neutraliserande antikroppar (VNAbs) i serumet med hjälp av ett in vitro-neutraliseringstest. Detta test kräver dock fortfarande att man offrar ett stort antal laboratoriemöss även om det redan används för veterinärmedicinskavaccinerna 6,,7 och har övervägts för humanvaccin8.

Från och med nu, både International9 och Europeiska10 rekommendationer uppmuntra tillverkare och nationella kontrolllaboratorier (officiella laboratorier för medicin kontroll - OMCLs) att genomföra ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjur testning, kallad 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (som varit i kraft sedan 2013/01/01) om djurskydd och djurskydd har också förstärkt de begränsningar för vaccintillverkare och laboratorier som deltar i kvalitetskontrollen av rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som ett resultat av detta har utvecklingen, valideringen och användningen av alternativa in vitro-metoder nu blivit en prioritet. Dessa är inte bara etiskt sunda men kan också minska partiets testkostnader och förkorta tiden för resultat till timmar istället för vecka3.

På ytan av RABV partikel, glykoprotein antar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabies vaccin, denna inhemska trimeric form utgör de viktigaste immunogen inducera VNAbs17 medan monomeric, lösliga eller denaturerade glykoproteiner är dåligt immunogenic18,19. Således är bevarandet av trimers av glykoproteinet längs vaccinproduktionsprocessen en bra indikator för bevarandet av en optimal immunogen potential. Flera immunokemiska metoder, såsom antikroppsbindningstestet20,21, test22 av en radiell immundiffusion (SRD) och ELISA-testet23,,24,,25,26,27 rekommenderas av WHO:s tekniska rapport serie2 och den europeiska monografin3 för att kvantifiera antigenhalten i rabiesvacciner. Dessa används av tillverkarna för att övervaka konsekvensen i vaccinproduktionen och av OMCL för att bedöma den konsekventa formuleringen av partier avhumanvacciner 28, även om NIH-testet fortfarande övervägs för styrkan.

Emellertid, alla dessa immunokemiska metoder är inte likvärdiga. SRD-testet kräver en förbehandling som kan förändra de membranförankrade trimers och resultera i en löslig eller denaturerad form av glykoproteinet22,29. Därför är SRD inte mycket effektivt när det gäller att diskriminera mellan immunogena och icke-immunogena glykoproteiner som resulterar i en ofullständig bedömning av immunogeniciteten hos ett vaccinparti. Däremot är ELISA-testet känsligare22, bevarar glykoproteinets ursprungliga struktur och är lämpligare för att bestämma innehållet i de inbyggda vikta trimersna av glykoprotein. ELISA-testet kan använda antingen kaninpolyklonala eller mus monoklonala anti-glykoproteinantikroppar som renats eller koncentrerats med ammoniumsulfat. Studier har visat god överensstämmelse mellan NIH-testet och det antigeninnehåll som utvärderats av ELISA i vacciner och kommit fram till att ELISA-metoderna är lämpliga för in vitro-potenstestet. Detta förespråkar att ELISA-tester åtminstone kan komplettera eller till och med ersätta NIH-testet4,,26,,27,,30,,31,,32,33. I dag rekommenderar Europeiska farmakopén användning av validerade serologiska eller immunokemiska analyser som alternativ till NIH-testet3. Det fullständiga undvikandet av djuranvändning för vaccinpotens har blivit ett realistiskt perspektiv.

Den metod som presenteras nedan är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av en mus monoklonal antikropp klon (mAb-D1) som känner igen antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denna metod utvecklades ursprungligen vid Institut Pasteur26,30 sedan optimeras och valideras av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dvs den franska OMCL4,33. MAb-D1 används både för att sensibilisera plattan och därefter för att upptäcka det fångade antigenet. Detta möjliggör specifik kvantifiering av glykoproteintrimmarna, dvs det immunogena RABV-antigenet. Den mAb-D1 som används för detektion är märkt med peroxidas, vilket avslöjas i närvaro av substratet och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten. Det är att notera att samma typ av analys kan tillämpas för olika mAbs erkänner olika antigena platser av RABV glykoprotein35. Metoden för att erhålla och rena eller koncentrera med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonanal kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonala musglobuliner har beskrivits utförligt tidigare36 tillsammans med metoden att konjugate antikroppar med peroxidas37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Säkerhetsåtgärder

OBS: Denna metod är tillämplig på både levande RABV och inaktiverat vaccin.

  1. Använd god laboratoriesed och säkerhetsrutiner.
  2. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive engångsrock, handskar, mask, glasögon etc.
  3. När det levande viruset titreras, använd ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II.
    1. Betrakta allt material som kommer i kontakt med proverna (reagenser, tvättlösningar etc.) som infektiöst material.
    2. Behandla det förorenade materialet genom att doppa i blekmedelslösningen (2,5 % natriumhypoklorit) i 30 minuter för sanering.
  4. Hantera kemikalier i enlighet med god laboratoriesed.

2. Förberedelser

  1. Använd reagenser av analytisk kvalitet där det någonsin är möjligt.
  2. Bered färska lösningar på beläggningsbufferten/karbonatbufferten, passivationsbufferten, spädnings- och citratbufferten(tabell 1),filtrerar genom 0,45 eller 0,22 μm filter och förvaras i 4 °C under en dag före användning för att bevara deras analytiska renhet.
  3. Låt reagenserna nå rumstemperaturen (+18 °C till +25 °C) 30 minuter före användning och homogenisera genom skonsam blandning före användning.

3. Mikroplat sensibilisering

OBS: Använd 96 brunnsanroptionsimanalysplattor som är optimerade för att binda stora mängder immunglobuliner (t.ex. se Tabell över material).

  1. Tillsätt 200 μl av den monoklonala antikroppen (mAb-D1) som späds ut i karbonatbufferten till varje brunn.
    OBS: En optimal koncentration på ca 1 μg/ml har fastställts experimentellt och motsvarar en ungefärlig 1/2000 utspädning av den renade mAb-D1. Denna rekommenderade koncentration anges för varje mAb-D1-sats och måste regelbundet verifieras med den positiva kontrollen.
  2. Täck plattan med en självhäftande film och inkubera mikroplattan i 3 timmar vid 37 °C i en fuktad atmosfär.
  3. Sug försiktigt och överför brunnsinnehållet till en mottagare som innehåller 2,5 % natriumhypokloritlösning.
  4. Vänd mikroplattan och låt den torka på ett adsorbentpapper i rumstemperatur i 5 min.

4. Mikroplåt passivitet

  1. Tillsätt 300 μL av passivationsbufferten till varje brunn.
  2. Täck plattan med en självhäftande film och inkubera i 30 min vid 37 °C.
  3. Aspirera noggrant och överför brunnsinnehållet till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
  4. Vänd mikroplattan och låt den torka på ett adsorbentpapper i rumstemperatur i 1 min.
    OBS: Mikroplattan kan omedelbart användas eller förvaras förseglad vid -20 °C i upp till 3 månader tills den används.

5. ELISA-analys

OBS: För att fastställa referensvaccinets kontrollkurva krävs inte steg 5.3. för att titrera det testade vaccinet är alla steg 5.1 till 5.6 nödvändiga.

  1. Tvättning av den sensibiliserade mikroplattan
    1. Tillsätt 300 μL av tvättbufferten till varje brunn.
    2. Aspirera noggrant och överför brunnsinnehållet till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
    3. Upprepa steg 5.1.1 och 5.1.2 fem gånger till för att i stor utsträckning tvätta den sensibiliserade plattan.
    4. Vänd mikroplattan och låt den torka på ett adsorbentpapper i rumstemperatur i 1 min.
  2. Utspädningar av referensvaccinet för kontrollkurvan
    1. Rekonstruera referensvaccinet (valideringsantigenet Lot 09) i 1 ml destillerat vatten motsvarande en koncentration på 10 μg/ml rabiesvirus glykoprotein.
    2. Bered en tiofaldig utspädning av det rekonstituerade referensvaccinet i spädningsspädning för att nå 1 μg/ml rabiesvirus glykoprotein.
    3. Bered 6 seriella tvåfaldiga utspädningar av detta referensvaccin i spädningsvattnet enligt tabell 1.
    4. Fördela 200 μl av spädningslet i duplicera (brunnar 1H/2H) för att fungera som en tom kontroll.
    5. Fördela 200 μl per brunn av varje referensvaccinutspädning i duplicering (brunnarna G1/G2 till A1/A2).
  3. Spädningar av det testade vaccinet för titrering
    1. Bered en tiofaldig utspädning av det testade vaccinet i spädningsspädning.
    2. Bered 7 tvåfaldiga seriella utspädningar av det testade vaccinet i spädningsmedel enligt tabell 2.
    3. Fördela 200 μl per brunn av varje testad vaccinutspädning i duplicera (brunnarna H3/H4 till A3/A4).
  4. Inkubation/tvättning av ELISA-plattan
    1. Täck mikroplattan med en självhäftande film och inkubera i 1 h vid 37 °C.
    2. Ta bort filmen, aspirera försiktigt och överför innehållet i varje brunn till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
    3. Tillsätt till varje brunn 300 μL tvättbuffert.
    4. Aspirera noggrant och överför innehållet i varje brunn till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
    5. Upprepa steg 5.4.3 och 5.4.4 fem gånger för att avlägsna det obundna antigenet och bevara G-proteintrimers som är bundna till den belagda antikroppen (mAb D1).
    6. Vänd mikroplattan och låt den torka på ett adsorbentpapper i rumstemperatur i 1 min.
  5. Bindning av peroxidaskonjugerad mAb-D1
    1. Fördela 200 μl per brunn av den rekommenderade utspädningen (1/2000) av peroxidasmärkt mAb-D1 i spädningsmedel (ungefärlig koncentration på 1 μg/ml). En rekommenderad koncentration anges för varje mAb-D1-sats och måste regelbundet verifieras med den positiva kontrollen.
    2. Täck mikroplattan med en självhäftande film och inkubera i 1 h vid 37 °C.
    3. Ta bort filmen, aspirera försiktigt och överför innehållet i varje brunn till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
    4. Lägg till varje brunn, 300 μL av tvättbufferten.
    5. Aspirera noggrant och överför innehållet i varje brunn till en mottagare som innehåller 2,5% natriumhypokloritlösning.
    6. Upprepa steg 5.5.4 och 5.5.5 fem gånger för att avlägsna obunden peroxidasmärkt antikropp (mAb D1).
    7. Vänd mikroplattan och låt den torka på ett adsorbentpapper i rumstemperatur i 1 min.
  6. Uppenbarelse med hjälp av substrat-kromogen
    1. Fördela 200 μl per brunn substrat-kromogenlösning.
    2. Täta mikroplattan med en film och inkubera i mörker vid rumstemperatur i 30 min. En gul-orange färg utvecklar intensiteten som är proportionell mot mängden bunden peroxidas-märkt antikropp (mAb D1).
    3. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 μL stopplösning per brunn.
    4. Torka försiktigt av mikroplattans botten och placera den i en spektrofotometer för att bestämma den optiska densiteten (OD) vid 492 nm av alla använda brunnar: negativ kontroll (tom), referensvaccin och testat vaccin.
    5. Samla in OD-data som XLS- eller .xlsx-filformat för analys.
  7. Rita referensvaccinkurvan, det trimeric glykoproteininnehållet, som en funktion av optisk densitet (492 nm)
    1. Beräkna medelvärdet OD vid 492 nm för varje duplikat vid referensvaccinets olika utspädningar (brunnarna G1/G2 till A1/A2 i tabell 2)
    2. Subtrahera medelvärdet OD för blanka (brunnar, H1/H2 i tabell 2)från varje beräknad genomsnittlig OD.
    3. Rita de resulterande OD-värdena på den vertikala axeln (linjär skala) och motsvarande koncentration i glykoproteintrimmer (ng/ml) på den horisontella axeln (logaritmisk skala).
    4. Rita referenskurvan genom att sammanfoga punkter (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I följande exempel används referensvaccinet Lot 09, bestående av renade inaktiverade rabiesviruspartiklar (PV-vaccinstam). Glykoproteintrimmers (10 μg/ml) i detta har fastställts efter bestämning av den totala mängden virusproteiner (BCA-test) och utvärdering av procentandelen av glykoproteinet av SDS-polyarylamidgelelektrofores. Alternativt kan ett kalibrerat referensvaccin, t.ex.th

Tabell 3 visar OD-värdena (492 nm) för ett typiskt experiment. Med hjälp av dessa värden ritades referensvaccinkurvan genom att rita (1) medelvärdet FÖR OD (minus ämnets medelvärdeslöpning) vid referensvaccinets olika utspädningar på den vertikala axeln (linjär skala). (2) Koncentrationen av glykoproteintrimmarna (ng/ml) på den horisontella axeln (logaritmisk skala) (figur 1).

Glykoproteinhalten i det testade vaccinet uppskattas i jämförelse med denna referensvaccinkurva. Utvärderingen är exakt för utspädning av det testade vaccinet som ger ett genomsnittligt OD-värde i den linjära delen av referensvaccinkurvan. I det presenterade experimentet (figur 1) är den linjära delen från ca 1 till 2 OD (tabell 3).

Utspädning 1/40 av det testade vaccinet, med medelvärdet OD för dubbla prover på 1,534, är sedan lämplig för vidare utvärdering. När denna OD ritas horisontellt upp till skärningspunkten med referensvaccinkurvan motsvarar den vertikala projektionen på x-axeln 500 ng/ml glykoprotein. Med tanke på utspädningen innehåller det testade vaccinet

40 x 500 ng/ml = 20 μg/ml trimeric glykoprotein.

För närvarande finns det ingen ELISA internationell enhet för RABV glykoproteininnehåll. Referensvaccinets in vivostyrka i internationella enheter (IE/ml) har dock fastställts med hjälp av NIH-testet jämfört med6:e WHO International Standard (NIBSC-kod: 07/162)4. Jämförelsen av de genomsnittliga eds mellan referensen och det testade vaccinet gör det därför inte bara möjligt att mäta det testade vaccinets trimeric glykoproteinmängd utan utvärderar också den in vitro-potens som uppskattas i Equivalent International Unit (EIU/mL).

Med hjälp av den ELISA-metod som beskrivs här har den franska OMCL (ANSM) övervakat glykoproteinhalten i mer än 1000 partier av humant rabiesvaccin som ska släppas ut på marknaden och har jämfört med NIH-testet som utförts på tillverkarens plats4. Den höga variabiliteten hos NIH-testet, på grund av heterogeniteten hos mössstammen och utmaningsproceduren38, förhindrade en statistisk korrelation mellan de två testerna. En överensstämmelse i resultatens profil och samma slutsatser om godkänd/underkänd erhölls dock med in vitro- och in vivo-analyser4. Denna konkordans bekräftar att de infödda trimers av glykoprotein som erkänns av mAb-D134,39 utgör de viktigaste rabiesvirus immunogen inducera VNAbs under vaccination17. Dessa VNAbs kan skydda möss från den intra-cerebrala utmaningen av NIH-testet. Sammanfattningsvis är in vitro-bedömningen av rabies glykoproteinhalten ett attraktivt alternativ till NIH-testet utvärdera rabiesvaccin potens.

Buffertar och reagenser Förberedelser
Beläggningsbuffert
(Karbonatbuffert 50mM pH=9,6)		 Tillsätt natriumkarbonat 50 mM (Na2CO3-10H2O) till Natriumbikarbonat 50 mM (NaHCO3) tills önskat pH (ca 1/10 volym natriumbikarbonat)
Buffert för passivation 0.3% Bovin serum albumin (BSA, fraktion V), 5% sackaros i karbonatbuffert 50 mM pH 9.6
10x Fosfat buffrad saltlösning pH=7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g i 1L destillerat vatten. Justera pH=7 med 4N NaOH
Tvättbuffert 0.05% Interpolering i 1x PBS
Spädningsmedel                                                  0,5% Bovin serum albumin (fraktion V), 0,05% Interpolering i 1x PBS (justera pH till 7 på grund av försurning av BSA)
Citratbuffert pH-5.6
(för substrat peroxidas)		 11,67 g Tri-natriumcitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g Citronsyra-1H20 i 1L destillerat vatten
Substrat-kromogenlösning 50 mg Ortofenylensdikamintablett, 0,1 % väteperoxid 30% (110 vol) i 25 ml Citratbuffert pH 5,6
Stoppa lösning
(4N svavelsyra)		 10 ml H2SO4 36N i 80 ml kylt destillerat vatten. Utspädning måste utföras i ett isbad

Tabell 1. Buffertar som används i analysen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Vaccin 1/640 Ref. Vaccin 1/640 Testat vaccin 1/1280 Testat vaccin 1/1280
B Ref. Vaccin 1/320 Ref. Vaccin 1/320 Testat vaccin 1/640 Testat vaccin 1/640
C Ref. Vaccin 1/160 Ref. Vaccin 1/160 Testat vaccin 1/320 Testat vaccin 1/320
D Ref. Vaccin 1/10 Ref. Vaccin 1/10 Testat vaccin 1/160 Testat vaccin 1/160
ᵉ Ref. Vaccin 1/40 Ref. Vaccin 1/40 Testat vaccin 1/80 Testat vaccin 1/80
F Ref. Vaccin 1/20 Ref. Vaccin 1/20 Testat vaccin 1/40 Testat vaccin 1/40
G Ref. Vaccin 1/10 Ref. Vaccin 1/10 Testat vaccin 1/20 Testat vaccin 1/20
H Tom Tom Testat vaccin 1/10 Testat vaccin 1/10
Referensvaccin Lot 09 utspädning Koncentration (ng/ml)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tabell 2: Mikroplåtsplan för glykoproteintiteringsanalys och utspädningar för referens- och testade vacciner som används i analysen.

Referensvaccin Lot 09 utspädning Koncentration (ng/ml) Testad vaccinutspädning OD kolumn 1 OD kolumn 2 OD medelvärde Referens OD medelvärde- Tom OD medelvärde
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Tom Tom 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tabell 3. Resultat som erhållits vid OD492 nm för att rita referenskurvan

Figure 1
Figur 1: Referenskurva som visar det trimeric glykoproteininnehållet som den optiska densitetens funktion (492 nm) för referensvaccinet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitopet som erkänns av mAb-D1 ligger i det antigena området III av RABV glykoprotein som inte bara är immun-dominerande för induktion av VNAbs men också deltar i neurovirulens, patogenicitet40,41 och receptorerkännande42. Det finns en annan viktig antigen plats längs glykoprotein, plats II43, mot vilken flera MAbs har isolerats såsom mAb-WI-111235. Dessa kan också användas i liknande typ av experiment.

En begränsning av denna in vitro-metod av ELISA finns i det nödvändiga bevarandet av epitopet som erkänns av den använda mAb på den rabiesvirusstam som ska testas. Hittills har alla klassiska stammar som används för humana rabiesvacciner erkänts av mAb-D1. Den större mångfalden av rabiesstammar som används i djurvacciner kan utgöra ett problem i framtiden. Som tidigare nämnts kan dock samma analys appliceras med hjälp av olika mAbs som erkänner olika antigena platser i RABV glykoprotein för beläggning och detektion. Detta kommer att göra det möjligt att kringgå problemet35.

En annan känslig punkt i denna metod, kvantifiera den trimeric formen av RABV glykoprotein, är den möjliga effekten av pH och temperatur på den reversibla konformation omvandling14. Dessa parametrar beaktas i det föreslagna protokollet.

Sammanfattningsvis förefaller kvantifiering av en mycket immunogen epitop av korrekt vikta glykoproteintrimmare med elisa-metoden in vitro lika effektiv som NIH-testet för att mäta kapaciteten hos ett vaccinparti för att inducera humoral immunitet mot rabiesvirusinfektion. Dessutom kan ELISA-metoden diskriminera subpotenterade vaccinpartier, i kvalitet eller i kvantitet, från de potenta4,,35. Det sista steget innan du föreslår en sådan in vitro ELISA-analys för att ersätta NIH-testet är organisationen av en internationell samarbetsstudie för dess förbättring och standardisering.

I en workshop av samordningskommittén för internrektion om validering) av alternativa metoder (ICCVAM) med titeln International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, September 2010)44, drogs slutsatsen att NIH-testet bör ersättas med ett alternativt in vitro-test som utvärderar vaccinimmungeniciteten och kunna diskriminera mellan potenta och subpotenta partier4. En annan workshop i det europeiska partnerskapet för alternativ till djurförsök (EPAA) 201245 beslutade att en standardiserad smörgås ELISA kalibrerad mot den nuvarande internationella referensstandarden för rabies skulle vara ett idealiskt alternativ för rabiesvaccinpotenstestning. Efter en internationell samarbetsundersökning före validering, som omfattade både tillverkare och tillsynsmyndigheter, jämfördes olika ELISA-konstruktioner som används av tillverkarna och deras nationella kontrolllaboratorier för frisläppande av partier för deras förmåga att diskriminera subpotent från potenta partier från olika vaccinmärken35. Europeiska direktoratet för läkemedelskvalitet (EDQM) föreslog en annan mAb-WI-1112 (antigentisk plats II) som kombinerar mAb-D1 (antigent område III) för en kommande internationell samarbetsstudie inom ramen för det biologiska standardiseringsprogrammet (BSP). Detta visar (1) att flera kombinationer av mAbs för mikroplåtsbeläggning och detektion kan användas som in vitro-alternativ till in vivo NIH-testet och (2) att dessa kombinationer kan vara beroende av den RABV-vaccinstam som ska testas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Dr Sylvie Morgeaux och Dr Jean-Michel Chapsal måste erkännas för deras viktigaste deltagande för att upprätta ELISA analys på vaccin partier och att organisera internationella workshops och samarbetsstudier. Vi tackar Sabrina Kali för kritisk läsning av manuskriptet. Dr Pierre Perrin var ansvarig för isolering och karakterisering av mAb-D1. Detta arbete har huvudsakligen fått stöd av Institut Pasteur-finansieringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 159 Rabiesvaccin potens NIH-test ELISA-metod mAb-D1 monoklonal antikropp Trimers av glykoprotein Glykoproteininnehåll
In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter