Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Burada kuduz aşılarında immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama açıklar. Bu test glikoprotein düzelticileri tanıyan nötralize monoklonal antikor (mAb-D1) kullanır. Üretim sırasında aşı potens tutarlılığını takip etmek için in vivo NIH testine alternatiftir.

Abstract

Hayvan refahı için giderek artan küresel endişe üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarları (OMCLs) Değiştirme, Azaltma ve Laboratuvar hayvan testleri arıtma için 3Rs stratejisi takip teşvik etmektedir. Kuduz aşısı nın gücünü değerlendirmek için NIH testine alternatif olarak dSÖ ve Avrupa düzeylerinde in vitro yaklaşımların geliştirilmesi önerilmektedir. Kuduz virüsü (RABV) partikülünün yüzeyinde glikoprotein indükleyicileri Viral Nötralize Antikorları (VNAb) oluşturmak için büyük immünojeni oluşturur. Monoklonal Antikorların (mAb-D1) glikoproteinin trimerik formunu tanıdığı bir ELISA testi, aşı serilerinin üretimiyle birlikte yerli katlanmış trimerik glikoproteinin içeriğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu in vitro potens testi NIH testi ile iyi bir uyum gösterdi ve RABV aşı üreticileri ve OMCLs tarafından ortak çalışmalarda uygun bulunmuştur. Hayvan kullanımından kaçınmak yakın gelecekte ulaşılabilir bir hedeftir.

Sunulan yöntem, trimerik RABV glikoproteininin iii (aa 330-338) antijenik bölgelerini tanıyan mAb-D1 kullanılarak dolaylı elisa sandviç immünoyakalamasına dayanmaktadır. mAb-D1, aşı da bulunan glikoprotein düzelticilerin hem kaplaması hem de tespiti için kullanılır. Epitop konformasyonel özellikleri nedeniyle tanındığından, potansiyel olarak denatüre glikoprotein (daha az immünojenik) mAb-D1 tarafından yakalanıp tespit edilemez. Test edilecek aşı mAb-D1 ile duyarlı bir plaka içinde kuluçkaya yatırılır. Bağlı trimerik RABV glikoproteinler tekrar mAb-D1 eklenerek tanımlanır, peroksidaz ile etiketlenir ve daha sonra substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar.

Introduction

50 yıldan fazla olduğundan, NIH testi1 toplu yayından önce kuduz aşısı gücünü değerlendirmek için altın standart bir yöntem olarak kullanılır. Bu test, 14 gün sonra kuduz virüsü (RABV) türü olan Challenge Virus Standard (CVS) ile birlikte test edilecek aşı ile fare gruplarının intraperitoneal bağışıklamalarından oluşur. Potens IC meydan hayatta farelerin oranında değerlendirilir. Who2 ve Avrupa Farmakopesi3 hala aşı potens değerlendirmek için NIH testi gerektirir rağmen, Bu test çeşitli engeller uğrar: sonuçlar son derece değişken4; enfeksiyöz RABV meydan okuma sırasında kullanılır ve bu hem teknik beceri hem de sıkı biyogüvenlik önlemleri gerektirir; hayvanların çok sayıda kullanılır ve meydan şiddeti ciddi etikendişeleri5 yükseltir. Bu testin daha az ciddi bir varyasyonu geliştirilmiştir: intra-periton bağışıklama iki hafta sonra, fareler IC tarafından meydan değil ama kanama lı ve serumda spesifik RABV nötralize antikorların varlığı için test edilmiştir (VNAbs) bir in vitro nötralizasyon testi kullanarak. Ancak, bu test hala veteriner aşıları için kullanımda olmasına rağmen laboratuvar farelerin çok sayıda kurban gerektirir6,7 ve insan aşıları için kabul edilmiştir8.

Şu andan itibaren, hem Uluslararası9 hem de Avrupa10 önerisi, üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarlarını (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) 3R stratejisi olarak adlandırılan laboratuvar hayvan testlerinin değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi konusunda teşvik etmektedir. Avrupa Direktifi 2010/63/EU (2013/01/01 yılından bu yana yürürlükte) hayvanların korunması ve refahı ile ilgili de kuduz aşılarının Kalite Kontrolü ile ilgili aşı üreticileri ve laboratuvarları için kısıtlamaları güçlendirdi yanı sıra kuduz araştırma11. Sonuç olarak, alternatif in vitro yaklaşımların geliştirilmesi, doğrulanması ve kullanımı artık bir öncelik haline gelmiştir. Bu sadece etik olarak sağlam değil, aynı zamanda toplu test maliyetlerini azaltabilir ve hafta yerine saat sonuçları için süre kısaltmak3.

RABV parçacığının yüzeyinde, glikoprotein trimerik formu benimser12,13,14,15,16. Kuduz aşısında, bu yerli trimerik form vnabs indükleyen büyük immünojen oluşturur17 ise monomerik, çözünür veya denatüre glikoproteinler kötü immünojenik18,19. Bu nedenle, aşı üretim süreci boyunca glikoprotein düzelticilerin korunması optimal immünojenik potansiyelin korunması için iyi bir göstergedir. Antikor-bağlayıcı-test20,,21, tek radyal immünodiffüzyon (SRD) testi22 ve ELISA testi23,24,,25,26,,27 gibi çeşitli immünokimyasal yöntemler, kuduz aşılarında antijen içeriğini ölçmek için WHO Teknik Rapor Serisi2 ve Avrupa monografisi3 tarafından tavsiye edilir.24 Bu aşı üretiminin tutarlılığını izlemek için üreticiler tarafından kullanılan ve OMCL tarafından insan aşıları28toplu tutarlı formülasyon değerlendirmek için, NIH testi hala potens için kabul olsa bile.

Ancak, tüm bu immünokimyasal yöntemler eşdeğer değildir. SRD testi membran demirli süsleyiciler değiştirebilir ve glikoprotein,22,29çözünür veya denatüre formu neden olabilir bir ön tedavi gerektirir. Bu nedenle, SRD bir aşı çok immünojenite kusurlu bir değerlendirme ile sonuçlanan immünojenik ve non-immünojenik glikoproteinler arasında ayrım çok verimli değildir. Buna karşılık, ELISA testi dahaduyarlıdır 22, glikoproteinin doğal yapısını korur, ve glikoprotein doğal katlanmış trimers içeriğini belirlemek için daha uygundur. ELISA testi tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-glikoprotein antikorları saflaştırılmış veya amonyum sülfat ile konsantre kullanabilirsiniz. Çalışmalar, NIH testi ile aşılarda ELISA tarafından değerlendirilen antijen içeriği arasında iyi bir uyum olduğunu göstermiş ve ELISA yöntemlerinin in vitro potens testi için uygun olduğu sonucuna varmıştır. Bu ELISA testleri en azından ek olabilir ya da hatta NIH testi4,26,27,30,31,32,33değiştirebilirsiniz savunucuları ., Bugün, Avrupa Farmakopesi NIH testi3alternatif olarak doğrulanmış serolojik veya immünokimyasal tahlillerin kullanılmasını önerir. Aşı potens için hayvan kullanımıtam kaçınma gerçekçi bir bakış açısı haline gelmiştir.

Aşağıda sunulan yöntem, trimerik RABV glikoprotein15,34antijenik siteleri III (aa 330-338) tanır bir fare monoklonal antikor klonu (mAb-D1) kullanarak dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama dayanmaktadır. Bu yöntem başlangıçta Institut Pasteur26geliştirilmiştir ,30 sonra optimize edilmiş ve Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé tarafından doğrulandı (ANSM) laboratuvar, yani, Fransız OMCL4,33. mAb-D1 hem plakayı algılamak hem de yakalanan antijeni tespit etmek için kullanılır. Bu glikoprotein düzelticiler, yani, immünojenik RABV antijeninin spesifik niceliklenmesine olanak sağlar. Algılama için kullanılan mAb-D1 peroksidaz ile etiketlenir, hangi substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar. RABV glikoprotein35'infarklı antijenik bölgelerini tanıyan farklı mAb'ler için aynı tip bir titreşme uygulanabileceği dikkat ivedidir. Amonyum sülfat anti-glikoprotein poliklonal tavşan immünglobulinleri G (IgG) veya monoklonal fare globulinleri elde etme ve arındırma veya konsantre etme yöntemi, peroksidaz ile antikorları bir araya getirmek için kullanılan yöntemle birlikte daha önce36 olarak açıklanmıştır37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Güvenlik önlemleri

NOT: Bu yöntem hem canlı RABV hem de inaktive aşı için geçerlidir.

  1. İyi Laboratuvar Uygulamaları ve Güvenlik prosedürleri kullanın.
  2. Tek kullanımlık palto, eldiven, maske, gözlük vb. dahil olmak üzere yeterli Kişisel Koruma Ekipmanı (PPE) giyin.
  3. Canlı virüs titre edildiğinde, sınıf II biyolojik güvenlik kabini kullanın.
    1. Numunelerle temas eden herhangi bir malzemeyi (reaktifler, yıkama solüsyonları, vb.) enfeksiyöz malzeme olarak düşünün.
    2. Dekontaminasyon için 30 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi (sodyum hipokloritin %2,5'i) içine daldırarak kirlenmiş malzemeyi tedavi edin.
  4. İyi Laboratuvar Uygulamasına uygun olarak kimyasalları sapla.

2. Hazırlık

  1. Mümkün olduğunca analitik sınıf reaktifler kullanın.
  2. Kaplama tamponu/karbonat tamponu, passiv tamponu, dilüent ve sitrat tamponunun(Tablo 1),0,45 veya 0,22 μm filtrelerden süzülüğe taze çözeltiler hazırlayın ve analitik saflıklarını korumak için kullanımdan önce 4 °C'de bir gün saklayın.
  3. Reaktiflerin kullanımdan 30 dk önce oda sıcaklığına (+18 °C ila +25 °C) ulaşmasını bekleyin ve kullanımdan önce hafif bir karıştırma ile homojenize olun.

3. Mikroplaka duyarlılığı

NOT: Yüksek miktarda İmmünoglobulin bağlamak için optimize edilmiş 96 iyi adsorpsiyon immünoassay plakası kullanın (örn. Bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Her kuyuiçin, karbonat tamponunda seyreltilmiş monoklonal antikor (mAb-D1) 200 μL ekleyin.
    NOT: Yaklaşık 1 μg/mL'lik optimal konsantrasyon deneysel olarak belirlendi ve saflaştırılmış mAb-D1'in yaklaşık 1/2000 seyreltilmesine karşılık gelmektedir. Bu önerilen konsantrasyon her mAb-D1 toplu iş için gösterilir ve periyodik olarak pozitif kontrol ile doğrulanmalıdır.
  2. Plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve mikro plakayı nemli bir atmosferde 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Kuyu içeriğini dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
  4. Mikroplakaters ve 5 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.

4. Mikroplaka passivation

  1. Her kuyuya, passivation arabelleği 300 μL ekleyin.
  2. Plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. İyi içeriği dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
  4. Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.
    NOT: Mikroplaka, kullanıma kadar 3 ay süreyle -20 °C'de kullanılabilir veya saklanabilir.

5. ELISA tsası

NOT: Referans aşının kontrol eğrisinin oluşturulması için Adım 5.3 gerekli değildir; test edilen aşıyı titreetmek için tüm Adımlar 5.1 ile 5.6 arasında gereklidir.

  1. Hassaslaştırılmış mikroplakanın yıkanması
    1. Her kuyuya 300 μL yıkama tamponu ekleyin.
    2. İyi içeriği dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
    3. Duyarlı plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için 5.1.1 ve 5.1.2 adımlarını beş kez daha tekrarlayın.
    4. Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.
  2. Kontrol eğrisi için referans aşının seyreltilmesi
    1. 1 mL distile su daki referans aşıyı (doğrulama antijeni Lot 09) yeniden oluşturmak, kuduz virüsü glikoproteininin 10 μg/mL konsantrasyonuna karşılık gelen distile suyun.
    2. Kuduz virüsü glikoproteininin 1 μg/mL'sine ulaşmak için seyrelticide yeniden oluşturulmuş referans aşının on kat seyreltilmesini hazırlayın.
    3. Tablo 1'debelirtildiği gibi seyreltici de bu referans aşının 6 seri iki kat seyreltme hazırlayın.
    4. Boş bir denetim olarak hizmet vermek için 200 μL'lik ayrıştırmayı yinelenen (kuyu1H/2H) dağıtın.
    5. Her referans aşı seyreltme kuyusu başına 200 μL'yi yinelenen olarak dağıtın (G1/G2'den A1/A2'ye kadar olan kuyular).
  3. Titrasyonu için test edilen aşının seyreltmeleri
    1. Seyreltici de test edilen aşının on kat seyreltilmesini hazırlayın.
    2. Test edilen aşının 7 iki kat seri seyreltmelerini Tablo 2'debelirtildiği gibi seyreltici olarak hazırlayın.
    3. Her test aşısı seyreltme kuyusu başına 200 μL'yi yinelenen olarak dağıtın (H3/H4'tan A3/A4'e kadar olan kuyular).
  4. ELISA plakasının Kuluçka/Yıkama
    1. Mikro plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
    3. Her kuyu için 300 μL yıkama tamponekleyin.
    4. Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
    5. Bağlanmamış antijeni çıkarmak ve kaplanmış antikora bağlı G protein düzelticilerini (mAb D1) korumak için 5.4.3 ve 5.4.4 adımlarını beş kez tekrarlayın.
    6. Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.
  5. Peroksidaz konjuge mAb-D1'in bağlanması
    1. Önerilen seyreltme kuyubaşına 200 μL (1/2000) peroksidaz etiketli mAb-D1'i seyreltici olarak dağıtın (yaklaşık 1μg/mL konsantrasyonu). Önerilen konsantrasyon her mAb-D1 toplu iş için gösterilir ve periyodik olarak pozitif kontrol ile doğrulanmalıdır.
    2. Mikro plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    3. Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
    4. Her kuyuya, 300 μL yıkama tamponu ekleyin.
    5. Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
    6. Bağlı olmayan peroksidaz etiketli antikorları (mAb D1) çıkarmak için 5.5.4 ve 5.5 adımlarını beş kez tekrarlayın.
    7. Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.
  6. Bir substrat-kromojen kullanarak vahiy
    1. Substrat-kromojen çözeltisi kuyubaşına 200 μL dağıtın.
    2. Bir film ile mikroplaka mühür ve 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Sarı-turuncu renk, bağlı peroksidaz etiketli antikor (mAb D1) miktarıile orantılı olan yoğunluğu nu geliştirir.
    3. Kuyu başına 50 μL durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    4. Mikroplakanın altını dikkatlice silin ve kullanılan tüm kuyuların 492 nm'deki optik yoğunluğunu (OD) belirlemek için bir spektrofotometreye yerleştirin: negatif kontrol (boş), referans aşı ve test edilmiş aşı.
    5. Analiz için OD verilerini .xls veya .xlsx dosya biçimi olarak toplayın.
  7. Referans aşı eğrisi, trimerik glikoprotein içeriği, optik yoğunluğu (492 nm) bir fonksiyonu olarak çizin
    1. Referans aşının farklı seyreltmelerinde her yineleme için ortalama OD'yi 492 nm olarak hesaplayın (Tablo 2'dekiG1/G2'den A1/A2'ye kadar)
    2. Hesaplanan her ortalama OD'den Boş 'un (kuyular, Tablo 2'dekiH1/H2) ortalama OD'sini çıkarın.
    3. Ortaya çıkan OD değerlerini dikey eksen (doğrusal ölçek) ve glikoprotein düzelticilerde (ng/mL) yatay eksen (logaritmik ölçek) ile ilgili konsantrasyonu çizin.
    4. Noktaları birleştirerek referans eğrisiçizin (Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aşağıdaki örnekte saflaştırılmış inaktive kuduz virüs partiküllerinden (PV aşısı türü) oluşan referans aşı Lot 09 kullanılmaktadır. Bu nda glikoprotein düzelticiler (10 μg/mL) içeriği, toplam viral protein miktarının (BCA testi) belirlenmesi ve glikoprotein insiat yüzdesi SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile değerlendirildikten sonra oluşturulmuştur. Alternatif olarak, kuduz Aşısı için WHO6'ncı Uluslararası Standart (IS) (NIBSC kodu: 07/162) kalibre edilmiş bir referans aşı kullanılabilir.

Tablo 3, tipik bir deneme için OD değerlerini (492 nm) gösterir. Bu değerler kullanılarak, referans aşı eğrisi dikey eksen (doğrusal ölçek) üzerinde referans aşı farklı seyreltme (boş ortalama OD eksi) çizerek çizildi (1) ortalama OD (eksi boş ortalama OD); (2) glikoprotein düzelticilerin (ng/mL) yatay eksen (logaritmik skala) üzerindeki konsantrasyonu (Şekil 1).

Test edilen aşının glikoprotein içeriği bu referans aşı eğrisi ile karşılaştırılarak tahmin edilmektedir. Değerlendirme referans aşı eğrisinin doğrusal kısmında ortalama OD değeri veren test edilen aşının seyreltilmesi için kesindir. Sunulan deneyde(Şekil 1),doğrusal parça yaklaşık 1 ile 2 OD arasındadır (Tablo 3).

Test edilen aşının 1/40'ının seyreltilmesi, 1.534'ün yinelenen numuneleri için ortalama OD ile daha fazla değerlendirme için uygundur. Bu OD referans aşı eğrisi ile kesişme noktasına kadar yatay olarak çizildiğinde, x eksenindeki dikey projeksiyon glikoproteinin 500 ng/mL'sine karşılık gelir. Seyreltme göz önüne alındığında, test edilen aşı içerir

40 x 500 ng/mL = 20 μg/mL trimerik glikoprotein.

Şu anda RABV glikoprotein içeriği için ELISA uluslararası birimi bulunmamaktadır. Ancak, referans aşıin in vivo potens, uluslararası birimlerde (IU/mL),6 DSÖ Uluslararası Standardı (NIBSC kodu: 07/162)4ile karşılaştırıldığında NIH testi kullanılarak kurulmuştur. Sonuç olarak, ortalama OD'lerin referans ve test edilen aşı arasında karşılaştırılması sadece test edilen aşının trimerik glikoprotein miktarının ölçülmesine izin vermez, aynı zamanda Eşdeğer Uluslararası Birimde (EIU/mL) tahmin edilen in vitro potens'i de değerlendirir.

Burada açıklanan ELISA yöntemini kullanarak, Fransız OMCL (ANSM) piyasada piyasaya sürülecek insan kuduz aşısı 1000'den fazla toplu glikoprotein içeriğini izlemiştir ve üreticinin sitesinde gerçekleştirilen NIH testi ile karşılaştırıldığında4. NIH testinin yüksek değişkenliği, farelerin zorlanma ve meydan okuma prosedürü38heterojenite nedeniyle, iki test arasında istatistiksel bir korelasyon engelledi. Ancak, sonuç profilinde bir konkordans ve aynı geçiş / başarısız sonuçlar in vitro ve in vivo tahliller kullanılarak elde edildi4. Bu konkordato, mAb-D134,tarafından tanınan glikoproteinin yerli trimerlerinin aşı sırasında VNAb'leri indükleyen ana kuduz virüsü immünojenioluşturduğunu doğrular17. Bu VNAb'ler fareleri NIH testinin intraserebral mücadelesinden koruyabilirler. Sonuç olarak, kuduz glikoprotein içeriğinin in vitro değerlendirilmesi NIH testi için cazip bir alternatif kuduz aşısı potens değerlendirmek.

Arabellekler ve reaktifler Hazırlık
Kaplama tamponu
(Karbonat tamponu 50mM pH=9.6)		 Sodyum karbonat 50 mM (Na2CO3-10H2O) sodyum bikarbonat 50 mM (NaHCO3)istenilen pH kadar ekleyin (sodyum bikarbonat yaklaşık 1/10 hacim)
Geçiş arabelleği %0.3 Büyükbaş Serum Albumin (BSA, fraksiyon V), karbonat tamponunda %5 sakaroz 50 mM pH 9.6
10x Fosfat tamponlu salin pH=7 (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g distile su 1L. 4N NaOH ile pH=7'yi ayarlayın
Yıkama tamponu 1x PBS'de %0,05'lik bir artış
Dilüent                                                  %0.5 Büyükbaş Serum Albumin (Fraksiyon V), 1x PBS'de %0.05'lik Birk (BSA ile asitleşme nedeniyle pH'ı 7'ye ayarlayın)
Sitrat tamponu pH-5.6
(peroksidaz substrat için)		 11.67 g Tri-sodyum sitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2.17 g Distile suyun 1L'sinde 2,17 g Sitrik asit-1H20
Substrat-kromojen çözeltisi 50 mg Orto-fenilen diamin tablet, %0.1 Hidrojen peroksit %30 (110 vol) içinde 25 ml Sitrat tampon pH 5.6
Durdurma çözümü
(4N sülfürik asit)		 10 ml H2SO4 36N 80 ml soğutulmuş distile su. Seyreltme bir buz banyosu yapılmalıdır

Tablo 1. Arabellekler tislamada kullanılır.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Aşı 1/640 Ref. Aşı 1/640 Test Edilmiş Aşı 1/1280 Test Edilmiş Aşı 1/1280
B Ref. Aşı 1/320 Ref. Aşı 1/320 Test Edilmiş Aşı 1/640 Test Edilmiş Aşı 1/640
C Ref. Aşı 1/160 Ref. Aşı 1/160 Test Edilmiş Aşı 1/320 Test Edilmiş Aşı 1/320
D Ref. Aşı 1/10 Ref. Aşı 1/10 Test Edilmiş Aşı 1/160 Test Edilmiş Aşı 1/160
E Ref. Aşı 1/40 Ref. Aşı 1/40 Test Edilmiş Aşı 1/80 Test Edilmiş Aşı 1/80
F Ref. Aşı 1/20 Ref. Aşı 1/20 Test Edilmiş Aşı 1/40 Test Edilmiş Aşı 1/40
G Ref. Aşı 1/10 Ref. Aşı 1/10 Test Edilmiş Aşı 1/20 Test Edilmiş Aşı 1/20
H Boş Boş Test Edilmiş Aşı 1/10 Test Edilmiş Aşı 1/10
Referans aşı Lot 09 seyreltme Konsantrasyon (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tablo 2: Kuduz glikoprotein titrasyonu tahlili ve seyreltmeler için mikroplaka planı referans ve test aşıları için tahmin.

Referans aşı Lot 09 seyreltme Konsantrasyon (ng/mL) Test edilmiş aşı seyreltme OD sütun 1 OD sütun 2 OD Ortalaması Referans OD ortalaması- Boş OD ortalaması
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Boş Boş 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tablo 3. Referans eğrisinin çizilmesi için OD492 nm'de elde edilen sonuçlar

Figure 1
Şekil 1: Referans aşısı için optik yoğunluk (492 nm) fonksiyonu olarak trimerik glikoprotein içeriğini gösteren referans eğrisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

mAb-D1 tarafından tanınan epitop, rabv glikoproteininin antijenik bölgesi III'te yer alır ve bu sadece VNAb'lerin indüksiyonu için immündominant olmakla kalmamış, aynı zamanda nörovikurallılık, patojenite40,41 ve reseptör tanıma42'deyer almaktadır. Glikoprotein boyunca başka bir önemli antijenik site vardır, site II43, karşı birkaç MAbs mAb-WI-111235gibi izole edilmiştir. Bunlar benzer türde deneylerde de kullanılabilir.

ELISA tarafından bu in vitro yöntemin bir sınırlama test edilecek kuduz virüsü suş üzerinde kullanılan mAb tarafından tanınan epitop gerekli korunması bulunur. Şimdiye kadar, insan kuduz aşıları için kullanılan tüm klasik suşları mAb-D1 tarafından kabul edilmektedir. Hayvan aşılarında kullanılan kuduz suşlarının daha fazla çeşitliliği gelecekte bir sorun teşkil edebilir. Ancak, daha önce de belirtildiği gibi, aynı ispat kaplama ve algılama için RABV glikoprotein farklı antijenik siteleri tanıyan farklı mAbs kullanılarak uygulanabilir. Bu sorun35atlatmak sağlayacaktır.

Bu yöntemin bir diğer hassas noktası, RABV glikoprotein trimerik formu nicel, geri dönüşümlü konformasyon dönüşüm üzerinde pH ve sıcaklık olası etkisi14. Bu parametreler önerilen protokolde dikkate alınır.

Özetle, in vitro ELISA yöntemi ile doğru katlanmış glikoprotein düzelticilerin son derece immünojenik epitopölçümü kuduz virüs enfeksiyonuna karşı mizahi bağışıklık sağlamak için bir aşı toplu kapasitesini ölçmek için NIH testi kadar etkili görünür. Buna ek olarak, ELISA yöntemi, kalite veya miktar olarak, güçlü olanlar4,,35,alt güçlü aşı çok ayırt edebilirsiniz. NIH testiyerine böyle bir in vitro ELISA testi önermeden önce son adım, onun iyileştirilmesi ve standardizasyonu için uluslararası bir işbirliği çalışması nın organizasyonudur.

Alternatif Yöntemlerin Doğrulanması Üzerine Interagency Koordinasyon Komitesi 'nin) (ICCVAM) Aşı Potens ve Güvenlik Testinde Hayvanların Kullanımını Azaltmak, İyileştirmek ve Değiştirme Alternatif Yöntemler Üzerine Uluslararası Çalıştay (ICCVAM)44başlıklı bir çalıştayı , NIH testinin aşı immünojenitesini değerlendiren ve güçlü ve alt-güçlü gruplar arasında ayrım yapabilen bir alternatif le değiştirilmesi gerektiği sonucunavardı. 2012'de Avrupa Hayvan Testlerine Alternatifler Ortaklığı 'nın (EPAA) bir başka çalıştayı45, mevcut uluslararası kuduz referans standardına göre kalibre edilmiş standartlaştırılmış bir sandviç ELISA'nın kuduz aşısı potens testi için ideal bir alternatif olacağına karar veremilmiştir. Aşağıdaki, hem üreticileri ve düzenleyici organları içeren uluslararası bir işbirliği ön doğrulama çalışması, farklı aşı markalarından güçlü gruplardan alt güçlü ayrımcılık yeteneği için toplu serbest bırakılması için üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarları tarafından kullanılan çeşitli ELISA tasarımları karşılaştırıldı35. MAb-D1 (antijenik site III) ve farklı bir mAb-WI-1112 'i (antijenik site II) birleştiren bir ELISA tasarımı, Avrupa İlaç ve Sağlık Hizmetleri (EDQM) Kalitesi Müdürlüğü tarafından Biyolojik Standardizasyon Programı (BSP) şemsiyesi altında yapılacak uluslararası bir işbirliği çalışması için önerilmiştir. Bu (1) mikroplaka kaplama ve algılama için mAbs çeşitli kombinasyonları in vivo NIH testi için bir in vitro alternatif olarak kullanılabilir ve (2) bu kombinasyonları TEST edilecek RABV aşı suşu bağımlı olabileceğini gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Sylvie Morgeaux ve Dr. Jean-Michel Chapsal, aşı serileri konusunda ELISA titreşmelerini oluşturmak ve uluslararası çalıştaylar ve işbirlikçi çalışmalar düzenlemek için temel katılımları için kabul edilmelidir. Sabrina Kali'ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Pierre Perrin mAb-D1'in izolasyon ve karakterizasyonundan sorumluydu. Bu çalışma ağırlıklı olarak Institut Pasteur finansmanı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 159 Kuduz aşısı potens NIH testi ELISA yöntemi mAb-D1 monoklonal antikor glikoprotein düzelticiler Glikoprotein içeriği
In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter