Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Abstract

La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.

La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.

Introduction

Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit plusieurs obstacles : les résultats sont très variables4; LE RABV infectieux est utilisé pendant le défi, ce qui exige à la fois des compétences techniques et des mesures de biosécurité strictes; un grand nombre d’animaux sont utilisés, et la gravité du défi soulève de sérieuses préoccupations éthiques5. Une variation moins grave de ce test a été développée : deux semaines après la vaccination intra-péritonéale, les souris ne sont pas contestées par IC mais saignées et testées pour la présence d’anticorps neutralisant RABV spécifiques (VNAbs) dans leur sérum à l’aide d’un test de neutralisation in vitro. Cependant, ce test nécessite encore de sacrifier un grand nombre de souris de laboratoire, bien qu’il soit déjà utilisé pour les vaccins vétérinaires6,7 et a été considéré pour les vaccins humains8.

À l’heure actuelle, les recommandations internationales9 et européennes10 encouragent les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle (Laboratoires officiels de contrôle des médicaments - OMCL) à mettre en œuvre le remplacement, la réduction et le raffinement des essais sur les animaux de laboratoire, appelé la stratégie 3R. La directive européenne 2010/63/UE (en vigueur depuis 2013/01/01) relative à la protection et au bien-être des animaux a également renforcé les contraintes pour les fabricants de vaccins et les laboratoires impliqués dans le contrôle de la qualité des vaccins antirabiques ainsi que dans la recherche sur la rage11. En conséquence, le développement, la validation et l’utilisation d’approches in vitro alternatives sont maintenant devenus une priorité. Ceux-ci sont non seulement éthiquement sains, mais peuvent également réduire les coûts de test par lots et raccourcir le temps pour les résultats à des heures au lieu de semaines3.

À la surface de la particule RABV, la glycoprotéine adopte une forme trimétérique12,13,14,15,16. Dans le vaccin contre la rage, cette forme trimériique indigène constitue l’immunogène majeur induisant VNAbs17 tandis que les glycoprotéines monomériques, solubles ou dénaturées sont mal immunogéniques18,19. Ainsi, la préservation des garnitures de la glycoprotéine le long du processus de production du vaccin est un bon indicateur pour la préservation d’un potentiel immunogène optimal. Plusieurs méthodes immunochimiques, telles que l’anticorps-contraignant-test20,21, letest d’immunodiffusion radiale unique (SRD) et le test ELISA23,24,25,26,27 sont recommandés par le rapport technique de l’OMS Série2 et la monographie européenne3 pour quantifier la teneur en antigènes dans les vaccins contre la rage. Ceux-ci sont utilisés par les fabricants pour surveiller l’uniformité de la production de vaccins et par l’OMCL pour évaluer la formulation cohérente de lots de vaccins humains28, même si le test des NIH est toujours considéré pour la puissance.

Cependant, toutes ces méthodes immunochimiques ne sont pas équivalentes. Le test SRD nécessite un pré-traitement qui peut modifier les garnitures à la membrane et entraîner une forme soluble ou dénaturée de la glycoprotéine22,29. Par conséquent, SRD n’est pas très efficace en discriminant entre les glycoprotéines immunogéniques et non immunogènes résultant en une évaluation imparfaite de l’immunogénicité d’un lot vaccinal. En revanche, le test ELISA est plus sensible22, préserve la structure indigène de la glycoprotéine, et est plus approprié pour déterminer le contenu des garnitures pliées indigènes de glycoprotéine. Le test ELISA peut utiliser soit des anticorps anti-glycoprotéines monoclonals de lapin ou de souris purifiés ou concentrés avec du sulfate d’ammonium. Des études ont démontré une bonne concordance entre le test des NIH et le contenu antigène évalué par ELISA dans les vaccins et ont conclu que les méthodes ELISA conviennent au test de puissance in vitro. Cela préconise que les tests ELISA pourraient au moins compléter ou même remplacer le test des NIH4,26,27,30,31,32,33. Aujourd’hui, la Pharmacopoeia européenne recommande l’utilisation d’essais sérologiques ou immunochimiques validés comme alternatives au test des NIH3. L’évitement complet de l’utilisation animale de la puissance vaccinale est devenu une perspective réaliste.

La méthode présentée ci-dessous est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant un clone d’anticorps monoclonal de souris (mAb-D1) qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabVtrimeric 15,34. Cette méthode a d’abord été développée à l’Institut Pasteur26,30 puis optimisée et validée par le laboratoire de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), c’est-à-dire le Français OMCL4,33. Le mAb-D1 est utilisé à la fois pour sensibiliser la plaque et par la suite pour détecter l’antigène capturé. Cela permet la quantification spécifique des garnitures de glycoprotéine, c’est-à-dire l’antigène RABV immunogénique. Le mAb-D1 utilisé pour la détection est étiqueté avec peroxidase, qui se révèle en présence du substrat et du chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique. Il est à noter que le même type d’essai peut être appliqué pour différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV35. La méthode pour obtenir et purifier ou se concentrer avec l’ammonium sulfate anti-glycorotein polyclonal rabbit immunoglobulins G (IgG) ou globulines monoclonal de souris ont été largement décrits précédemment36 avec la méthode pour conjuguer des anticorps avec peroxidase37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Précautions de sécurité

REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé.

  1. Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire.
  2. Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc.
  3. Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II.
    1. Considérez tout matériau en contact avec les échantillons (réactifs, solutions de lavage, etc.) comme matière infectieuse.
    2. Traiter le matériau contaminé en immergeant dans la solution d’eau de Javel (2,5% d’hypochlorite de sodium) pendant 30 min pour la décontamination.
  4. Manipuler les produits chimiques conformément à la pratique du bon laboratoire.

2. Préparation

  1. Utilisez des réactifs de qualité analytique lorsque c’est possible.
  2. Préparer de nouvelles solutions de tampon de revêtement/tampon carbonate, tampon de passivation, diluant et tampon de citrate(tableau 1), filtrer à travers 0,45 ou 0,22 m filtres et stocker à 4 oC pendant une journée avant l’utilisation pour préserver leur pureté analytique.
  3. Permettre aux réactifs d’atteindre la température ambiante (18 à 25 oC) 30 min avant l’utilisation et homogénéiser par un mélange doux avant l’utilisation.

3. Sensibilisation aux microplaques

REMARQUE : Utilisez 96 plaques d’immunoassay d’adsorption qui sont optimisées pour lier de grandes quantités d’immunoglobulines (p. ex., voir Tableau des matériaux).

  1. À chaque puits, ajouter 200 L de l’anticorps monoclonal (mAb-D1) dilué dans le tampon de carbonate.
    REMARQUE : Une concentration optimale d’environ 1 g/mL a été déterminée expérimentalement et correspond à une dilution approximative de 1/2000 du mAb-D1 purifié. Cette concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.
  2. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque pendant 3 h à 37 oC dans une atmosphère humidifiée.
  3. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
  4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 5 min.

4. Passivation microplaque

  1. À chaque puits, ajoutez 300 L du tampon de passivation.
  2. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber pendant 30 minutes à 37 oC.
  3. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
  4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
    REMARQUE : La microplaque peut être immédiatement utilisée ou stockée scellée à -20 oC jusqu’à 3 mois jusqu’à l’utilisation.

5. Analyse ELISA

REMARQUE : Pour établir la courbe de contrôle du vaccin de référence, l’étape 5.3 n’est pas requise; pour titrer le vaccin testé toutes les étapes 5.1 à 5.6 sont nécessaires.

  1. Lavage de la microplaque sensibilisée
    1. À chaque puits, ajoutez 300 lil du tampon de lavage.
    2. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    3. Répétez les étapes 5.1.1 et 5.1.2 cinq fois de plus pour laver largement la plaque sensibilisée.
    4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  2. Dilutions du vaccin de référence pour la courbe de contrôle
    1. Reconstituer le vaccin de référence (antigène de validation Lot 09) dans 1 ml d’eau distillée correspondant à une concentration de 10 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
    2. Préparer une dilution décuplée du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre 1 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
    3. Préparer 6 dilutions doubles séries de ce vaccin de référence dans le diluant comme indiqué dans le tableau 1.
    4. Distribuez 200 L du diluant en double (puits 1H/2H) pour servir de contrôle vierge.
    5. Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale de référence en double (puits G1/G2 à A1/A2).
  3. Dilutions du vaccin testé pour sa titration
    1. Préparer une dilution décuplée du vaccin testé dans le diluant.
    2. Préparer 7 dilutions en série doubles du vaccin testé dans le diluant comme indiqué dans le tableau 2.
    3. Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale testée en double (puits H3/H4 à A3/A4).
  4. Incubation/lavage de la plaque ELISA
    1. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.
    2. Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    3. À chaque puits, ajoutez 300 L de tampon de lavage.
    4. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.
    5. Répétez les étapes 5.4.3 et 5.4.4 cinq fois pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéines G liées à l’anticorps enduit (mAb D1).
    6. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  5. Liaison du peroxidase conjugué mAb-D1
    1. Distribuez 200 ll par puits de la dilution recommandée (1/2000) de mAb-D1 étiqueté peroxidase dans le diluant (concentration approximative de 1 g/mL). Une concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.
    2. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.
    3. Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    4. Ajouter à chaque puits, 300 l de la mémoire tampon de lavage.
    5. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.
    6. Répétez les étapes 5.5.4 et 5.5.5 cinq fois pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase (mAb D1).
    7. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  6. Révélation à l’aide d’un substrat-chromogen
    1. Distribuer 200 ll par puits de solution substrat-chromogène.
    2. Sceller la microplaque avec un film et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Une couleur jaune-orange développe l’intensité de ce qui est proportionnelle à la quantité d’anticorps peroxidase lié (mAb D1).
    3. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 L de solution d’arrêt par puits.
    4. Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-la dans un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique (OD) à 492 nm de tous les puits utilisés : contrôle négatif (blanc), vaccin de référence et vaccin testé.
    5. Recueillir des données OD comme format de fichier .xlsx ou .xlsx pour analyse.
  7. Dessiner la courbe vaccinale de référence, la teneur en glycoprotéines trimériques, en fonction de la densité optique (492 nm)
    1. Calculer la moyenne de la DMO à 492 nm pour chaque double aux différentes dilutions du vaccin de référence (puits G1/G2 à A1/A2 dans le tableau 2)
    2. Soustrayez la moyenne de la DMO du Blank (puits, H1/H2 dans le tableau 2)de chaque OD moyen calculé.
    3. Tracez les valeurs oD qui en résultent sur l’axe vertical (échelle linéaire) et la concentration correspondante dans les garnitures de glycoprotéine (ng/mL) sur l’axe horizontal (échelle logarithémique).
    4. Dessinez la courbe de référence en joignant des points(figure 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la normeinternationale (IS) de l’OMS pour le vaccin contre la rage (code NIBSC : 07/162), peut être utilisé.

Le tableau 3 montre les valeurs de la DMO (492 nm) pour une expérience typique. En utilisant ces valeurs, la courbe vaccinale de référence a été tracée (1) la moyenne OD (moins la moyenne de la DMO du blanc) aux différentes dilutions du vaccin de référence sur l’axe vertical (échelle linéaire); (2) la concentration des garnitures de glycoprotéine (ng/mL) sur l’axe horizontal (échelle logarithémique)(figure 1).

La teneur en glycoprotéine du vaccin testé est estimée par rapport à cette courbe de référence du vaccin. L’évaluation est précise pour la dilution du vaccin testé donnant une valeur de DMO moyenne dans la partie linéaire de la courbe du vaccin de référence. Dans l’expérience présentée(figure 1), la partie linéaire est d’environ 1 à 2 OD(tableau 3).

La dilution 1/40 du vaccin testé, avec une DMO moyenne pour les échantillons en double de 1.534, est alors appropriée pour une évaluation plus approfondie. Lorsque cette OD est tracée horizontalement jusqu’au point d’intersection avec la courbe du vaccin de référence, la projection verticale sur l’axe x correspond à 500 ng/mL de glycoprotéine. Compte tenu de la dilution, le vaccin testé contient

40 x 500 ng/mL à 20 g/mL de glycoprotéine trimérique.

Actuellement, il n’existe pas d’unité internationale ELISA pour la teneur en glycoprotéines RABV. Cependant, la puissance in vivo du vaccin de référence, dans les unités internationales (UI/mL), a été établie à l’aide du test des NIH par rapport au6ème code international standard de l’OMS (NIBSC: 07/162)4. Par conséquent, la comparaison des OPP moyennes entre le vaccin de référence et le vaccin testé permet non seulement de mesurer la quantité de glycoprotéine trimétérique du vaccin testé, mais évalue également la puissance in vitro estimée dans l’unité internationale équivalente (EIU/mL).

À l’aide de la méthode ELISA décrite ici, l’OMCL Français (ANSM) a surveillé la teneur en glycoprotéines de plus de 1000 lots de vaccin contre la rage humaine à être publiés sur le marché et a comparé au test niH effectué sur le site4du fabricant. La variabilité élevée du test des NIH, en raison de l’hétérogénéité chez les souris souche et la procédure de défi38, empêché une corrélation statistique entre les deux tests. Cependant, une concordance dans le profil des résultats et les mêmes conclusions de passage/échec ont été obtenues à l’aide d’essais in vitro et in vivo4. Cette concordance confirme que les garnitures indigènes de la glycoprotéine reconnues par le mAb-D134,39 constituent l’immunogène principal virus de la rage induisant VNAbs lors de la vaccination17. Ces VNAbs sont en mesure de protéger les souris contre le défi intra-cérébral du test des NIH. En conclusion, l’évaluation in vitro de la teneur en glycoprotéine de la rage est une alternative attrayante au test des NIH pour évaluer la puissance du vaccin contre la rage.

Tampons et réactifs Préparation
Tampon de revêtement
(Tampon Carbonate 50mM pH -9.6)		 Ajouter le carbonate de sodium 50 mM (Na2CO3-10H2O) au bicarbonate de sodium 50 mM (NaHCO3) jusqu’au pH désiré (environ 1/10 volume de bicarbonate de sodium)
Tampon de passivation 0,3% Bovine Serum Albumin (BSA, fraction V), 5% saccharose dans le tampon de carbonate 50 mM pH 9.6
10x Phosphate pH salin tamponné (PBS 10x) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g en 1L d’eau distillée. Ajuster le pH-7 avec 4N NaOH
Mémoire tampon de lavage 0,05% Tween en 1x PBS
Diluant                                                  0,5% Bovine Serum Albumin (Fraction V), 0,05% Tween en 1x PBS (ajuster pH à 7 en raison de l’acidification par BSA)
Citrate tampon pH-5.6
(pour substrat peroxidase)		 11,67 g de citrate de trois sodium-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2,17 g d’acide citrique-1H20 en 1L d’eau distillée
Solution Substrate-chromogène 50 mg de comprimé de diamine Ortho-phenylene, 0,1% peroxyde d’hydrogène 30% (110 vol) dans 25 ml de tampon Citrate pH 5,6
Solution d’arrêt
(4N acide sulfurique)		 10 ml de H2SO4 36N dans 80 ml d’eau distillée refroidie. La dilution doit être effectuée dans un bain de glace

Tableau 1. Tampons utilisés dans l’essai.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un Réf. Vaccin 1/640 Réf. Vaccin 1/640 Vaccin testé 1/1280 Vaccin testé 1/1280
B Réf. Vaccin 1/320 Réf. Vaccin 1/320 Vaccin testé 1/640 Vaccin testé 1/640
C Réf. Vaccin 1/160 Réf. Vaccin 1/160 Vaccin testé 1/320 Vaccin testé 1/320
D Réf. Vaccin 1/10 Réf. Vaccin 1/10 Vaccin testé 1/160 Vaccin testé 1/160
E Réf. Vaccin 1/40 Réf. Vaccin 1/40 Vaccin testé 1/80 Vaccin testé 1/80
F Réf. Vaccin 1/20 Réf. Vaccin 1/20 Vaccin testé 1/40 Vaccin testé 1/40
G Réf. Vaccin 1/10 Réf. Vaccin 1/10 Vaccin testé 1/20 Vaccin testé 1/20
H (en) Blanc Blanc Vaccin testé 1/10 Vaccin testé 1/10
Vaccin de référence Lot 09 dilution Concentration (ng/mL)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Tableau 2 : Plan microplaque pour l’analyse de titration de glycoprotéine de la rage et les dilutions pour les vaccins de référence et testés utilisés dans l’essai.

Vaccin de référence Lot 09 dilution Concentration (ng/mL) Dilution vaccinale testée Colonne OD 1 Colonne OD 2 Moyenne OD Référence OD moyenne- Blank OD signifie
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Blanc Blanc 1/10 0.078 0.087 0.0825

Tableau 3. Résultats obtenus à OD492 nm pour tracer la courbe de référence

Figure 1
Figure 1: Courbe de référence indiquant la teneur en glycoprotéine trimérique comme fonction de la densité optique (492 nm) pour le vaccin de référence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI-111235. Ceux-ci peuvent également être utilisés dans le type similaire d’expériences.

Une limitation de cette méthode in vitro par ELISA réside dans la conservation nécessaire de l’épitope reconnu par le mAb utilisé sur la souche du virus de la rage à tester. Jusqu’à présent, toutes les souches classiques utilisées pour les vaccins contre la rage humaine sont reconnues par le mAb-D1. La plus grande diversité des souches de rage utilisées dans les vaccins pour animaux pourrait constituer un problème à l’avenir. Cependant, comme mentionné précédemment, le même essai peut être appliqué à l’aide de différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV pour le revêtement et la détection. Cela permettra de contourner le problème35.

Un autre point sensible de cette méthode, quantifiant la forme trimériique de la glycoprotéine RABV, est l’effet possible du pH et de la température sur la conversion de conformation réversible14. Ces paramètres sont pris en compte dans le protocole proposé.

En résumé, la quantification d’une épitope hautement immunogène de garnitures de glycoprotéine correctement pliées par méthode ELISA in vitro semble aussi efficace que le test des NIH pour mesurer la capacité d’un lot vaccinal pour induire l’immunité humoristique contre l’infection par le virus de la rage. En outre, la méthode ELISA peut discriminer les lots de vaccins sous-puissants, en qualité ou en quantité, à partir des puissants4,35. La dernière étape avant de proposer un tel essai ELISA in vitro pour remplacer le test des NIH est l’organisation d’une étude collaborative internationale pour son amélioration et sa normalisation.

Un atelier du Comité de coordination de l’organisation sur la validation des méthodes alternatives (ICCVAM) intitulé International Workshop on Alternative Methods to Reduce, Refine, and Replace the Use of Animals in Vaccine Potency and Safety Testing (Ames, septembre 2010)44, a conclu que le test des NIH devrait être remplacé par un test in vitro alternatif évaluant l’immunogénicité vaccinale et capable de discriminer entre les puissants et les sous-potents4. Un autre atelier du Partenariat européen pour les alternatives à l’expérimentation animale (EPAA) en 201245 a décidé qu’un sandwich standardisé ELISA calibré par rapport à la norme internationale actuelle de référence de la rage serait une alternative idéale pour les tests de puissance vaccinale contre la rage. Par la suite, une étude internationale de pré-validation collaborative, qui comprenait à la fois des fabricants et des organismes de réglementation, a comparé diverses conceptions ELISA utilisées par les fabricants et leurs laboratoires nationaux de contrôle pour la libération de lots pour leur capacité à discriminer les sous-puissants à partir de lots puissants de différentes marques de vaccins35. Une conception ELISA combinant mAb-D1 (site antigénique III) et un autre mAb-WI-1112 (site antigénique II) a été proposée par la Direction européenne de la qualité des médicaments et des soins de santé (EDQM) pour une prochaine étude internationale de collaboration dans le cadre du Programme de normalisation biologique (BSP). Cela montre (1) que plusieurs combinaisons de mAbs pour le revêtement et la détection de microplaque peuvent être utilisées comme alternative in vitro au test in vivo NIH et (2) que ces combinaisons peuvent dépendre de la souche vaccinale RABV à tester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Immunologie et infection numéro 159 puissance vaccinale contre la rage test niSH méthode ELISA anticorps monocnel mAb-D1 trimers de glycoprotéine teneur en glycoprotéine
Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter