Renale Subcapsulaire transplantatie van 2 '-Deoxyguanosine-behandelde Muriene embryonale Thymus in naakt muizen

Thymustransplantatie is een belangrijke methode voor het onderzoeken van thymus epitheelcelfunctie en de T-cel rijping in vivo. Dit eenvoudige en efficiënte protocol kan worden gebruikt om muis 18,5 thymus te isoleren en te te planten voor latere transplantatie in een niercapsule. Het protocol voor de 18,5 thymustransplantatie kan worden gewijzigd voor thymische transplantatie in andere ontwikkelingsstadia of voor andere weefsels van vergelijkbare grootte.

Ook deze procedure is zeer eenvoudig. De details voor sommige van de case stempels moeten zorgvuldig worden herzien bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer. Deze procedure bevat gedetailleerde manipulaties die beter kunnen worden geïllustreerd met visualisatie.

Na het offeren veeg je de embryonale dag 18,5 zwangere muis af met 70% ethanol en gebruik je autoclaved gesteriliseerde instrumenten om een v-vormige snede op de buik te maken van de blaas tot elke hoorn van de baarmoeder. Gebruik een schaar om de mesometrium en cervicale en vaginale gebieden te snijden en oogst de baarmoeder in een petrischaaltje met koude PBS op ijs. Snijd de voorste baarmoederwand van de ene baarmoeder hoorn naar de andere om de embryo’s bloot te stellen in de envelop aan decidua en gebruik fijne pincet terug te pellen de deciduele weefsels.

Snijd de navelstreng om de embryo’s vrij te geven voor overdracht in een nieuwe petrischaal op ijs. Om de eerste thymus te oogsten, veeg je een embryo af met 70% alcohol en breng je het embryo over in een nieuw petrischaaltje. Na de onthoofding bevestig je het embryo in de schaal in de supinepositie en gebruik steriele schaar om de laterale borstwand horizontaal langs de okselvoorzijde te snijden.

Snijd het middenrif om de borst te openen. De thymus moet zichtbaar zijn als twee witte lobben voor de luchtpijp en grenzend aan het hart. Steek voorzichtig gebogen punt tang achter de thymus en trek voorzichtig omhoog om het weefsel te oogsten.

Controleer de integriteit van de thymus om te bevestigen dat het twee gegewrichtde kwabben bevat. Was vervolgens de thymus met PBS voordat u een stereomicroscoop gebruikt om de bindweefsels en bloedvaten weg te knippen. Wanneer alle thymi zijn verzameld, breng elk schoon weefsel in individuele putten van een 24 put plaat met 500 microliter van cultuur medium per goed.

En voeg 2’deoxygranosine toe aan een uiteindelijke concentratie van 1,25 millimolar per put. Plaats vervolgens de geïsoleerde thymi acht dagen in de celkweek incubator. Gebruik op de laatste dag van de cultuur een schaar om een naald van de hoofdhuidader op het infuusbuisgedeelte onder een hoek van 45 graden te snijden en bevestig een gebrek aan respons op teenknijpen in een naaktontvanger dier.

Plaats de muis op de operatietafel in een juiste zijdelingse positie en gebruik een 0,5%povidone jodium wattenstaafje om de huid in het chirurgische gebied twee keer uit te stijgen van binnen naar buiten van het lichaam. Gebruik de scalpel om een vijf tot negen millimeter huidincisie parallel aan de wervelkolom in de linker nier gebied te maken en snijd door het onderhuidse weefsel en de spier om de buikholte te openen. Met behulp van een pincet met een hand, til de spier en vetweefsel van de wervelkolom kant incisie rand van de blootgestelde nier en gebruik de andere hand om zachtjes knijp uit de nier.

Om de niercapsule vochtig te houden tijdens de operatie, nat het oppervlak van de nier met zoutoplossing en gebruik de hoofdhuid naald om zachtjes krassen op de niercapsule aan de rechterbenedenzijde ongeveer 1/2 tot 2/3 de breedte van de nier. Schuif de infuusbuis in de inkeping van de capsule en maak de niercapsule voorzichtig los van de nier lang de lange kant van de nier ongeveer drie tot vier millimeter in de niercapsule. Trek vervolgens de infuusbuis in.

Om de thymus in de gecreëerde subcapsulaire ruimte te implanteren, was je twee keer een kweek thymus in verse zoutoplossing en sluit je de afgeknipte infuusbuis aan op een spuit. Zuid langzaam de voorbereide thymus in de gemodificeerde infuusbuis aanzuigen. En steek de infuusbuis voorzichtig in de niercapsule totdat deze de superieure pool bereikt.

Om de thymus in de niercapsule te leveren, trekt u de buis langzaam in terwijl u tegelijkertijd de zuiger zachtjes deprimeert. Met behulp van een alcohollamp, iets warmte van de hoofdhuid naald en na de bevestiging dat de hele thymus is in de subcapsulaire ruimte, gebruik maken van de verwarmde naald om de nick cauterize. Herstel de cauterized nier in de buikholte en sluit het buikvlies en de spier met hechtingen.

Met behulp van een gewijzigde onderbroken verticale matras hechting, sluit de huid incisie met ten minste drie knopen en gebruik een povidone jodium wattenstaafje om de incisie te desinfecteren. Zorg vervolgens voor een onderhuidse injectie van antibiotica en analgesie en plaats de muis onder een infraroodlamp met monitoring tot volledig herstel. Hier kan een embryonale dag 18.5 thymus met twee volledige kwabben worden waargenomen.

Onmiddellijk na implantatie kan de thymus worden gevisualiseerd onder de niercapsule op het puntje van de ontvangende nier. Na acht weken van groei binnen de naakt muis ontvanger dier, de thymus blijft onder de capsule, maar neemt robuust in omvang. T-cellen worden geproduceerd in zowel de getransplanteerde thymus en het perifere bloed van naakte muis ontvangers.

Maar zoals verwacht, geen T-cellen worden gedetecteerd in de perifere van niet-getransplanteerde naakt dieren. Verder werd in dit representatieve experiment geen LacZ-gen aangetroffen in de perifere T-cellen die werden geoogst uit het perifere bloed van naakte muizenontvangers die zijn getransplanteerd met thymuskwab’s die het LacZ-allel bevatten, wat aangeeft dat perifere T-cellen werden gegenereerd van de ontvangende dieren. Wees voorzichtig bij het schuiven van de buis in een niercapsule.

Vermijd het breken van de capsule. En zorg ervoor dat je genoeg ruimte in de voor de thymus levering. Thymische of perifere T-cel populaties kunnen worden geanalyseerd met behulp van stroom cytometer.

Waar, immuunreacties in de perifere weefsels van de ontvanger kunnen worden geanalyseerd door I2d en de immuun histochemische analyse.