Renal subkapsulær transplantation af 2 '-Deoxyguanosin-behandlede murine embryonale thymus i Nude mus
Summary
Vi leverer en enkel og effektiv metode til transplantation 2 ‘-deoxyguanosine behandlet E 18.5 thymus i nyrerne kapsel af en nøgen mus. Denne metode bør aide i studiet af både thymisk epiteliale celler funktion og T celler modning.
Abstract
Thymus er et vigtigt centralt immun organ, som spiller en væsentlig rolle i udviklingen og differentieringen af T-celler. Thymus transplantation er en vigtig metode til undersøgelse af thymisk epitelial celle funktion og T-celler modning in vivo. Her vil vi beskrive de eksperimentelle metoder, der anvendes i vores laboratorium til transplantation 2 ‘-deoxyguanosine (at nedbryder donor lymfocytter) behandlet embryonale thymus i nyrerne kapsel af en athymic nøgen mus. Denne metode er både enkel og effektiv og kræver ikke særlige færdigheder eller enheder. Resultaterne opnået via denne enkle metode viste, at transplanterede thymus effektivt kan støtte modtagerens T-celler produktion. Desuden vil flere vigtige punkter med hensyn til protokollen blive yderligere belyst.
Introduction
Thymus er det centrale immun organ, inden for thymus thymocytter gennemgår positive og negative udvælgelse, og bliver modne T celler1,2. Unormalt positivt eller negativt valg resulterer i henholdsvis immundefekt eller autoimmune patologier3,4. Derfor er thymus organtransplantation en vigtig tilgang til at studere processen med T-celler udvælgelse i donorens thymus. Denne metode er især afgørende, når du analyserer thymisk epitel funktion medieret af genmutationer, som forårsager embryonisk dødelig fænotype, når muteret5.
For at studere modning af en modtagers T-celler i den transplanterede thymus er udtømning af donorens lymfocytter i thymus nødvendig. Til dette formål er embryonale 14-, 15-eller 16-dages (E14, E15, E16) thymus normalt valgt6,7. Thymus fra mere modne stadier kan også med held udtømmes af donorens lymfocytter ved behandling med 2 ‘-deoxyguanosin. Men en detaljeret protokol for nedbrydende lymfocytter og brug af ældre thymus kultur har ikke tidligere været beskrevet8,9. Selv om der er blevet indført transplantations protokoller af flere undersøgelser10,11, er det nødvendigt med yderligere ændringer og forbedringer af disse protokoller.
Vores protokol er opdelt i to dele: (i) udtømning af T-lymfocytter fra sent udviklingsmæssige fase E 18.5 thymus af kultur i 2 ‘-deoxyguanosin-holdige medier. II) transplantation af den dyrkede thymus til modtagerne. I denne procedure udviklede vi en enkel måde at levere det store væv (E 18.5 thymus) ind i den renale kapsel med nedsat risiko for nyreskade. Mens fokus på senere tidspunkt thymus, vores protokol kan også bruges direkte eller med ændringer til transplantation af thymus på forskellige udviklingsmæssige stadier eller andre lignende størrelse væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renal subkapsular transplantation af embryonale thymus er en vigtig metode til at studere den thymiske epiteliale celler funktion og processen med T-celler modning in vivo. Selv om der er flere eksperimentelle undersøgelser af embryonale thymus organ kultur og transplantation6,7, vores protokol giver en simpel alternativ procedure på murine embryonale thymus kultur og renal subkapsulær katarakt transplantation for ældre thymus væv.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af start pakken af Jinan University til S.J. og af videnskab og teknologi program af Guangzhou Kina (Grant No. 201704020209 til S.J.). Vi takker Amy Botta (Department of Biology, York University, Toronto, på M3J 1P3, Canada) til korrekturlæsning og redigering af manuskriptet.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
