Summary

Renal subkapsulær transplantation af 2 '-Deoxyguanosin-behandlede murine embryonale thymus i Nude mus

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Vi leverer en enkel og effektiv metode til transplantation 2 ‘-deoxyguanosine behandlet E 18.5 thymus i nyrerne kapsel af en nøgen mus. Denne metode bør aide i studiet af både thymisk epiteliale celler funktion og T celler modning.

Abstract

Thymus er et vigtigt centralt immun organ, som spiller en væsentlig rolle i udviklingen og differentieringen af T-celler. Thymus transplantation er en vigtig metode til undersøgelse af thymisk epitelial celle funktion og T-celler modning in vivo. Her vil vi beskrive de eksperimentelle metoder, der anvendes i vores laboratorium til transplantation 2 ‘-deoxyguanosine (at nedbryder donor lymfocytter) behandlet embryonale thymus i nyrerne kapsel af en athymic nøgen mus. Denne metode er både enkel og effektiv og kræver ikke særlige færdigheder eller enheder. Resultaterne opnået via denne enkle metode viste, at transplanterede thymus effektivt kan støtte modtagerens T-celler produktion. Desuden vil flere vigtige punkter med hensyn til protokollen blive yderligere belyst.

Introduction

Thymus er det centrale immun organ, inden for thymus thymocytter gennemgår positive og negative udvælgelse, og bliver modne T celler1,2. Unormalt positivt eller negativt valg resulterer i henholdsvis immundefekt eller autoimmune patologier3,4. Derfor er thymus organtransplantation en vigtig tilgang til at studere processen med T-celler udvælgelse i donorens thymus. Denne metode er især afgørende, når du analyserer thymisk epitel funktion medieret af genmutationer, som forårsager embryonisk dødelig fænotype, når muteret5.

For at studere modning af en modtagers T-celler i den transplanterede thymus er udtømning af donorens lymfocytter i thymus nødvendig. Til dette formål er embryonale 14-, 15-eller 16-dages (E14, E15, E16) thymus normalt valgt6,7. Thymus fra mere modne stadier kan også med held udtømmes af donorens lymfocytter ved behandling med 2 ‘-deoxyguanosin. Men en detaljeret protokol for nedbrydende lymfocytter og brug af ældre thymus kultur har ikke tidligere været beskrevet8,9. Selv om der er blevet indført transplantations protokoller af flere undersøgelser10,11, er det nødvendigt med yderligere ændringer og forbedringer af disse protokoller.

Vores protokol er opdelt i to dele: (i) udtømning af T-lymfocytter fra sent udviklingsmæssige fase E 18.5 thymus af kultur i 2 ‘-deoxyguanosin-holdige medier. II) transplantation af den dyrkede thymus til modtagerne. I denne procedure udviklede vi en enkel måde at levere det store væv (E 18.5 thymus) ind i den renale kapsel med nedsat risiko for nyreskade. Mens fokus på senere tidspunkt thymus, vores protokol kan også bruges direkte eller med ændringer til transplantation af thymus på forskellige udviklingsmæssige stadier eller andre lignende størrelse væv.

Protocol

Den præsenterede protokol overholder retningslinjerne fra den etiske komité i Jinan University vedrørende dyrepasning. Bemærk: de anvendte materialer er anført i tabellen over materialer. 1. isolering af embryonale thymus Autoklave alle kirurgiske instrumenter før eksperimentet, og sterilisere bænken/hætte med 70% ethanol. Ved hjælp af kuldioxid, anæstetize og aflive den gravide kvindelige mus (18,5 dag…

Representative Results

Her viser vi den isolerede E 18.5 thymus, der indeholder to komplette lapper (figur 1). Derudover viser vi hovedbunden vene nål, der blev klippet for at danne en facet på infusions røret (figur 2). Dernæst viser vi også et repræsentativt billede af den thymus, der blev transplanteret i den renale kapsel (figur 3a) og thymus efter 8 ugers vækst i modtager musene (figur 3b). For at afgøre, om T-ce…

Discussion

Renal subkapsular transplantation af embryonale thymus er en vigtig metode til at studere den thymiske epiteliale celler funktion og processen med T-celler modning in vivo. Selv om der er flere eksperimentelle undersøgelser af embryonale thymus organ kultur og transplantation6,7, vores protokol giver en simpel alternativ procedure på murine embryonale thymus kultur og renal subkapsulær katarakt transplantation for ældre thymus væv.

<p class="jove_content…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af start pakken af Jinan University til S.J. og af videnskab og teknologi program af Guangzhou Kina (Grant No. 201704020209 til S.J.). Vi takker Amy Botta (Department of Biology, York University, Toronto, på M3J 1P3, Canada) til korrekturlæsning og redigering af manuskriptet.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

References

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
  2. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
  4. Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
  5. Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
  6. Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  7. Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
  8. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  9. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  10. Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
  11. Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
  12. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
  13. Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
  14. Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

View Video