Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.
As metástases transmitidas pelo sangue representam a maioria das mortes relacionadas ao câncer e envolvem células tumorais circulantes (CTCs) que são bem-sucedidas no estabelecimento de novos tumores em locais distantes. Os CTCs são encontrados na corrente sanguínea de pacientes como células únicas (CTCs simples) ou como agregados multicelulares (clusters CTC e clusters de células sanguíneas CTC-brancas), com este último exibindo uma maior capacidade metastática. Além da enumeração, a análise fenotípica e molecular é extraordinariamente importante para dissecar a biologia de CTC e para identificar vulnerabilidades acionáveis. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um fluxo de trabalho que inclui imunocoloração e micromanipulação de CTC, cultura ex vivo para avaliar as capacidades proliferativas e de sobrevivência de células individuais e ensaios in vivo de formação de metástases. Adicionalmente, nós fornecemos um protocolo para conseguir a dissociação de clusters de CTC em pilhas individuais e a investigação da heterogeneidade do intra-conjunto. Com essas abordagens, por exemplo, quantificamos com precisão a sobrevida e o potencial proliferativo de CTCs individuais e células específicas dentro dos clusters de CTC, levando-nos à observação de que células dentro de clusters exibem melhor sobrevida e proliferação em ex em comparação com CTCs individuais. em geral, nosso fluxo de trabalho oferece uma plataforma para dissecar as características dos CTCs no nível de célula única, visando a identificação de vias relevantes para metástases e uma melhor compreensão da biologia da CTC.
A manifestação clínica da metástase em órgãos distantes representa o estágio final da progressão do câncer e responde por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer1. A transição da doença localizada para a metastática é um processo de múltiplas etapas, muitas vezes mediada por células tumorais circulantes (CTCs)2,3,4. Estas células são derramadas do tumor primário na circulação sanguínea e são transportadas para órgãos distantes, onde podem extravasar e estabelecer Lesões metastáticas5,6. Embora os tumores sólidos possam liberar um número relativamente elevado de CTCs, a maioria dos CTCs estão destinados a morrer, devido às altas forças de cisalhamento em circulação, morte celular mediada por anoikis, ataque imunológico ou capacidades limitadas para se adaptar a um microambiente estrangeiro7. Portanto, é fundamental estabelecer ferramentas que permitam a dissecção das características moleculares desses CTCs que são dotados de capacidade de propagação de metástases. Estudos pré-clínicos e clínicos recentes sugerem que a presença e a quantidade de CTCs individuais e de clusters de CTC está associada a um pior desfecho em pacientes com vários tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de . Os clusters CTC são grupos de dois ou mais CTCs conectados entre si durante a circulação e são mais eficientes na formação de metástases em comparação com CTCs simples3,15,16. Células dentro de um cluster mantêm forte adesão de células celulares através de desmossomas e junções aderências, o que pode ajudar a superar anoikis17,18. Recentemente, observou-se que o agrupamento de CTCs está vinculado à hipometilação de sítios de ligação para fatores de transcrição associados à stemness e proliferação, levando a uma maior capacidade de iniciar com sucesso a metástase19. A dissociação do agrupamento CTC resulta na remodelação de sítios de ligação chave e, consequentemente, na supressão do seu potencial metastático19. Adicionalmente aos conjuntos de células cancerosas, os CTCs podem igualmente associar ao glóbulo branco (o mais freqüentemente neutrophils) para manter níveis elevados da proliferação na circulação e para aumentar sua capacidade metastática20. No entanto, a biologia dos CTCs é entendida apenas em parte e várias questões permanecem abertas, incluindo as características moleculares subjacentes e vulnerabilidades de células simples e agrupadas.
Nos últimos anos, foram estabelecidas várias estratégias que exploram padrões de expressão celular-superfície, bem como propriedades físicas de CTCs para seu isolamento21,22,23,24, 25. Antigen-os métodos dependentes da isolação dependem na maior parte da expressão da molécula da adesão da pilha epithelial da superfície da pilha (epcam)26. O mais freqüentemente usado e (atualmente) a única plataforma aprovada pela FDA para a enumeração CTC, é o sistema CellSearch, que é baseado em um procedimento de duas etapas para isolar CTCs21. Na primeira etapa, os componentes do plasma são removidos por centrifugação, enquanto CTCs são capturados com Ferrofluidos magnéticos acoplados a anticorpos anti-EpCAM. Na segunda etapa, a solução enriquecida com CTC é manchada para células nucleadas (DAPI-positivas) expressando citoqueratina (CK)8,18,19, enquanto os glóbulos brancos (WBCs) são identificados usando o marcador de leucocitário CD45. Finalmente, as pilhas capturadas são coloc em uma plataforma de seleção integrada e os CTCs são identificados com a expressão de EpCAM, CKs, e DAPI ao ser negativo para CD45. Embora este seja considerado o padrão ouro para a enumeração de CTC, a análise molecular a jusante é desafiante com esta tecnologia devido às limitações inerentes na recuperação do CTC. Além disso, dado o seu procedimento de isolamento, CellSearch pode favorecer o enriquecimento de CTCs com níveis de EpCAM mais elevados em comparação com CTCs com menor expressão EpCAM, devido, por exemplo, a heterogeneidade do cancro27 ou downregulation de marcadores epiteliais 28,29. Para superar essas limitações, surgiram tecnologias independentes do antígeno para o enriquecimento de CTCs. Por exemplo, o CTC-ichip integra a separação hidrodinâmico de pilhas nucleadas, incluindo CTCs e WBCs dos componentes restantes do sangue, seguidos por um esgotamento imunomagnética de WBCs anticorpo-etiquetados, permitindo a purificação de CTCs untagged e viáveis em solução25. Adicionalmente, o fato de que a maioria dos CTCs são ligeiramente maiores do que os glóbulos vermelhos (RBCs) ou WBCs levou ao desenvolvimento de tecnologias de enriquecimento de CTC baseadas em tamanho23,30 (por exemplo, o sistema parsortix (Angle)) que faz uso de um tecnologia microfluídico-baseada, compreendendo um canal de estreitamento através da gaveta da separação, conduzindo as pilhas a uma abertura terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (os tamanhos diferentes estão disponíveis dependendo do diâmetro esperado de pilhas de cancro do alvo). A maioria das células sanguíneas passam pela lacuna estreita, enquanto CTCs ficar preso devido ao seu tamanho (mas também devido à sua baixa deformabilidade) e são, portanto, retidos na gaveta. Revertendo a direção do fluxo permite a liberação de CTCs capturados, que estão em um estado viável e adequado para análise downstream. Independentemente do protocolo escolhido para o isolamento de CTC, no entanto, os procedimentos típicos de pós-enriquecimento ainda produzem CTCs que são misturados com um número relativamente pequeno de RBCs e WBCs, fazendo a análise de CTCs puros ou em massa simples desafiador. Para abordar esta questão, estabelecemos um fluxo de trabalho que permite a manipulação de CTC sem potencial viés introduzido por contaminantes de células sanguíneas. A adição de imunocoloração de antemão, com combinações de anticorpos variáveis, distingue CTCs das células sanguíneas e até permite identificar subgrupos de CTC com perfis distintos de expressão de marcadores de superfície. Este procedimento altamente personalizável pode ser posteriormente combinado com aplicações específicas a jusante.
Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho que comece de um produto CTC-enriquecido (obtido com toda a tecnologia do enriquecimento do CTC da escolha) e combine diversas aproximações para ganhar a introspecção na biologia do CTC na definição da único-pilha. Em poucas palavras, nosso fluxo de trabalho possibilita a identificação de CTCs simples, clusters CTC e clusters CTC-WBC por imunocoloração ao vivo, seguidos de micromanipulação de células simples e análise a jusante usando protocolos de cultivo ex vivo , uma única célula sequenciamento e ensaios in vivo de metástases.
A caracterização molecular dos CTCs tem a promessa de melhorar nossa compreensão do processo metastático e orientar o desenvolvimento de novas terapias antimetástases. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada daqueles protocolos que permitem a micromanipulação de CTC e a análise a jusante, incluindo ensaios funcionais de uma única pilha-baseada, análise da expressão de gene e in vivo transplantação para o potencial metastático avaliação20.
<p class="jove_content"…The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos os pacientes que doaram sangue para o nosso estudo, assim como todos os clínicos envolvidos e enfermeiros de estudo. Agradecemos Jens Eberhardt, Uwe Birke, e Dr. Katharina Uhlig da ALS Automated Lab Solutions GmbH para suporte contínuo. Agradecemos a todos os membros do laboratório aceto por feedback e discussões. A investigação no laboratório aceto é apoiada pelo Conselho Europeu de investigação, pela União Europeia, pela Swiss National Science Foundation, pela Swiss Cancer League, pela Basel Cancer League, pelos dois cantons de Basileia através da ETH Zürich e pela Universidade de Basileia.
Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
CellD software | ALS | version 3.0 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |