Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs ‘lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.
Kan kaynaklı metastaz çoğu kansere bağlı ölümler için hesaplar ve uzak sitelerde yeni tümörlerin kurulması başarılı olan tümör hücreleri (CTCs) dolaşım içerir. CTCs, hastaların kan dolaşımında tek hücreler (tek CTCs) veya çok hücreli alımları (CTC kümeleri ve CTC-beyaz kan hücresi kümeleri) olarak, ikincisi ise daha yüksek metastatik yeteneği göstererek bulunur. Numaralandırmanın ötesinde, fenotipi ve moleküler analiz, CTC biyolojisini incelemek ve eyleme dönüştürülebilir açıkları belirlemek için olağanüstü önem taşımaktadır. Burada, bireysel hücrelerin proliferatif ve hayatta kalma yeteneklerini değerlendirmek için CTC immünostasyon ve mikromanipülasyon, ex vivo kültürü içeren bir iş akışının ayrıntılı bir açıklamasını ve In vivo metastazlık oluşumunu sağlıyoruz. Ayrıca, CTC kümelerinin ayrı hücrelere dağılmasına ve küme içi heterojenliğin araştırmasına ulaşmak için bir protokol sağlıyoruz. Bu yaklaşımlarla, örneğin, CTC kümelerinde tek CTCs ve bireysel hücrelerin hayatta kalma ve proliferatif potansiyelini tam olarak ölçiyoruz, kümelerin içindeki hücrelerin daha iyi bir hayatta kalma ve proliferasyon göstermesinde bizi gözlemlemek Vivo kültürler tek CTCs ile karşılaştırıldığında. genel olarak, iş akışımızın tek hücreli düzeyde CTCs özelliklerini incelemek için bir platform sunuyor, metasuf ilgili yolların tanımlanması ve CTC biyoloji daha iyi bir anlayış amaçlayan.
Uzak organlarda metastaz klinik tezahürü kanser ilerlemesinin son aşamasını temsil eder ve kanser ile ilgili ölümlerin% 90 ‘ den fazla hesapları1. Lokalize metastatik hastalığa geçiş, genellikle tümör hücreleri (ctcs)2,3,4dolaşımla aracılı çok adımlı bir süreçtir. Bu hücreler primer tümörden kan dolaşımı içine dökebilir ve uzak organlara taşınır, burada ekstrasat ve metastatik lezyonlar kurmak5,6. Solid tümörler CTCs nispeten yüksek sayıda serbest bırakabilse de, çoğu CTCs, dolaşım, anoikis aracılı hücre ölümü, bağışıklık saldırısı veya sınırlı yetenekleri yabancı bir mikroortama uyum sağlamak için yüksek kesme kuvvetleri nedeniyle ölmek üzere kaderinde7. Bu nedenle, metastam-tohumlama becerisi ile donatılmış olan CTCs ‘nin moleküler özelliklerinin diseksiyonu sağlayan araçlar kurmak çok önemlidir. Son preklinik ve klinik çalışmalar, tek ctcs ve CTC kümelerinin varlığı ve miktarının, çeşitli katı tümörlere sahip hastalarda daha kötü bir sonuç ile ilişkili olduğunu göstermektedir8,9,10 , 11 ‘ i , 12 tane , 13 ‘ ü , 14 . CTC kümeleri, dolaşım sırasında birbirlerine bağlı iki veya daha fazla ctcs gruplarıdır ve tek ctcs3,15,16‘ ya kıyasla metastaylarda daha etkilidir. Bir küme içindeki hücreler desmosomes üzerinden güçlü hücre hücresi yapışma korumak ve anoikis üstesinden gelmek için yardımcı olabilir kavşaklar,17,18. Son zamanlarda, CTCs kümelemesinin, nüklenin ve proliferasyon ile ilişkili transkripsiyon faktörleri için bağlayıcı sitelerin hipometilasyonu ile bağlantılı olduğunu ve daha yüksek metaslit19‘ ı başarıyla başlatabilme yeteneğine yol açtığı gözlenmiştir. CTC küme dağılma sonuçları anahtar bağlama siteleri yeniden modelleme ve sonuç olarak, metastatik potansiyelinin bastırılması19. Ayrıca kanser hücrelerinin kümeleri için, CTCs de beyaz kan hücresi (en sık nötrofiller) dolaşım yüksek proliferasyon seviyeleri korumak ve onların metastatik yeteneğini artırmak için ilişkilendirebilirsiniz20. Ancak, CTCs biyolojisi sadece kısmen anlaşılabilir ve temel moleküler özellikleri ve tek ve kümelenmiş hücrelerin açıkları da dahil olmak üzere birkaç soru açık kalır.
Son yıllarda, hücre yüzeyi ifade desenlerinin yanı sıra ctcs ‘in fiziksel özelliklerinin, izolasyonlarının21,22,23,24, 25. Antigen-bağımlı yalıtım yöntemleri çoğunlukla hücre yüzeyi epitel hücre yapışma molekül (EpCAM)26ifadesine dayanır. En sık kullanılan ve (Şu anda) CTC numaralandırma için tek FDA onaylı platform, CTCs21yalıtmak için iki adımlı bir prosedür temel CELLSEARCH sistemidir. İlk adımda, plazma bileşenleri santrifüjleme ile kaldırılır, CTCs ise anti-EpCAM antikorları ile birleşen manyetik ferrosıvılarla yakalanır. İkinci adımda, CTC zenginleştirilmiş solüsyon, siteratin (CK)8,18,19ifade eden çekirdeklenmiş (dapi-pozitif) hücreler için lekelenmiş iken, beyaz kan hücreleri (WBCs) kullanılarak tespit edilir Pan-lökosit Marker CD45. Son olarak, yakalanan hücreler entegre bir tarama platformuna yerleştirilir ve CTCs CD45 için negatif durumdayken EpCAM, CKs ve DAPı ifadesi aracılığıyla tanımlanır. Bu CTC numaralandırma için altın standardı olarak kabul olmasına rağmen, aşağı akım moleküler Analizi CTC alma içindeki kısıtlamaları nedeniyle bu teknoloji ile zordur. Ayrıca, yalıtım prosedürü verilen, CELLSEARCH daha yüksek EpCAM seviyeleri ile ctcs zenginleştirme lehine olabilir, daha düşük EpCAM ifade, örneğin kanser heterojenlik27 veya epitel işaretçileri baskılanması için örnek nedeniyle 28,29. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, CTCs zenginleştirme için antijen bağımsız teknolojiler ortaya çıkmıştır. Örneğin, CTC-ıcwıp, geri kalan kan bileşenlerinden CTCs ve WBCs dahil olmak üzere çekirdeklenmiş hücrelerin hidrodinamik ayrımı bütünleştirir ve ardından antikor etiketli Vbcs ‘nin immunomagnetik tükenmesi ile etiketlenmemiş ve uygun CTC ‘lerin arıtılmasına izin verir 25. çözüm. Ayrıca, çoğu ctcs, kırmızı kan hücrelerinden (RBCs) veya WBCs ‘nin biraz daha büyük olması, boyut bazlı CTC zenginleştirme teknolojilerinin23,30 (örn., parsortix sistemi (Angle)) geliştirilmesine yol açan bir mikrofluidik tabanlı teknoloji, ayrım kaseti boyunca daralan bir kanal oluşan, 10, 8, 6,5 veya 4,5 μm bir Terminal boşluğu önde gelen hücreler (farklı boyutlarda hedef kanser hücrelerinin beklenen çapına bağlı olarak mevcuttur). Kan hücrelerinin çoğu dar boşluğa geçer, CTCs boyutları nedeniyle kapana kısılırken (aynı zamanda düşük deformetlilik nedeniyle) ve bu nedenle kasette tutulur. Akış yönünü geri dönüş, uygulanabilir bir durumda olan ve aşağı akış analizi için uygun olan yakalanan CTCs ‘nin serbest bırakılması sağlar. CTC yalıtım için seçilen Protokolden bağımsız olarak, ancak, tipik post-zenginleştirme yordamları hala nispeten az sayıda RBCs ve WBCs ile karışık CTCs verim, saf tek veya toplu CTCs zorlu analizi yapma. Bu sorunu gidermek için, kan hücresi kirleticileri tarafından sunulan potansiyel önyargı olmadan CTC manipülasyon sağlayan bir iş akışı kurduk. Değişken antikor kombinasyonları ile önceden immünostemenin eklenmesi, CTCs ‘Leri kan hücrelerinden ayıran ve hatta farklı yüzey işaretleyici ifade profillerine sahip CTC alt gruplarını belirlemenizi sağlar. Bu son derece özelleştirilebilir prosedür daha sonra belirli akış uygulamaları ile kombine edilebilir.
Burada, CTC zenginleştirilmiş bir üründen başlayan (herhangi bir CTC zenginleştirilmesi teknolojisi ile elde edilen) bir iş akışını tarif ediyoruz ve tek hücreli çözünürlükte CTC biyolojisi hakkında bilgi edinmek için çeşitli yaklaşımlar birleştirir. Özetle, iş akışımız tek CTCs, CTC kümeleri ve CTC-WBC kümelerinin canlı immünostasyon tarafından tanımlanmasını sağlayarak, ex vivo kültür protokolleri, tek hücreli mikromanipülasyon ve aşağı akış analizinin ardından sıralamayı ve In vivo metastazı gösteriyor.
CTCs ‘nin Moleküler Karakterizasyonu, metastatik süreç anlayışımızı iyileştirmek ve yeni anti-metastaz terapilerinin gelişmesine rehberlik etmek için söz veriyor. Burada, hem tek hücre bazlı işlevsel analizler, gen ifadesi Analizi ve metastatik potansiyel için in vivo transplantasyonu da dahil olmak üzere CTC mikromanipülasyon ve aşağı akış analizini sağlayan bu protokollerin ayrıntılı bir açıklamasını sağlıyoruz değerlendirme20.
<p class="jove_conten…The authors have nothing to disclose.
Çalışma için kan bağışlayan tüm hastalara, aynı zamanda tüm klinisyenler ve çalışma hemşirelerine teşekkür ederiz. Sürekli destek için ALS Automated Lab Solutions GmbH ‘dan Jens Eberhardt, Uwe birke ve Dr. Katharina Uhlig ‘e teşekkür ederiz. Geri bildirim ve tartışmalar için Aceto laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Aceto laboratuarında yapılan araştırmalar Avrupa Araştırma Konseyi, Avrupa Birliği, Isviçre Ulusal Bilim Vakfı, Isviçre kanser Ligi, Basel kanser Ligi, ETH Zürich üzerinden iki adet Basel Kantonu ve Basel Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.
Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
CellD software | ALS | version 3.0 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |